杧果E2F_DP转录因子家族生物信息学分析_高庆远.pdf

分子植物育种，2023 年，第 21 卷，第 3 期，第 772-781 页Molecular Plant Breeding,2023,Vol.21,No.3,772-781研究报告Research Report杧果 E2F/DP 转录因子家族生物信息学分析高庆远1,2孙宇2刘志鑫2蒲金基2杨石有1*张贺2*1 海南大学林学院,海口,570228;2 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室,海口,571101*共同通信作者,;摘要E2F/DP 转录因子是真核生物中细胞周期进程的关键调节因子，与植物激素共同发挥着重要的调控作用。以杧果全基因组为供试参考基因组，用生物信息学软件预测 E2F/DP 转录因子家族基因成员，并分析其理化性质、保守结构域、保守基序、进化关系，结合实时荧光定量 PCR 测定杧果细菌性黑斑病菌(Xan-thomonas campestris pv.mangiferaeindicae,Xcm)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides,Cg)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)和水杨酸(salicylic acid,SA)处理下基因表达量。结果表明，杧果全基因组中有 8 个E2F/DP 转录因子，命名为 MiE2Fs。保守结构域预测发现 MiE2F1MiE2F5 均含有 E2F_DD，MiE2F7 和MiE2F8 同时包含两个 E2F_TDP 保守结构域；二级结构预测发现 E2F/DP 家族蛋白质二级结构相似，无规则卷曲和-螺旋是 MiE2F1MiE2F8 蛋白二级结构主要元件，其次是延伸链和-转角；保守基序预测发现杧果有 1 个高度保守的基序 Motif1；基于杧果和大豆、烟草、毛果杨、拟南芥、阿月浑子、葡萄的 E2F/DP 蛋白质序列构建系统发育树，发现杧果 E2F/DP 基因与阿月浑子、葡萄亲缘关系接近。杧果细菌性黑斑病菌(Xcm)和胶孢炭疽菌(Cg)侵染过程中，MiE2F4、MiE2F5、MiE2F6 的表达量显著上调。茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫处理下，MiE2F7 表达量显著上调，其余基因均下调；水杨酸(SA)胁迫处理下，从 6 h 开始，各个基因的表达量都在逐步上调。以上研究结果可为探究杧果 E2F/DP 基因参与的植物防御反应机制奠定基础。关键词杧果;E2F/DP 转录因子;生物信息学BioinformaticsAnalysisof E2F/DPTranscriptionFactorFamilyin MangiferaindicaGao Qingyuan1,2Sun Yu2Liu Zhixin2Pu Jinji2Yang Shiyou1*Zhang He2*1 College of Forestry,Hainan University,Haikou,570228;2 Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Grops(Ministry of Agricultureand Rural Affairs),Environment and Plant Protection Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou,571101*Co-corresponding authors,;DOI:10.13271/j.mpb.021.000772AbstractE2F/DP transcription factor is a key regulator of cell cycle progression in eukaryotes and plays an im-portant regulatory role together with plant hormones.Using the whole mango genome as a reference genome,wepredicted the gene members of E2F/DP transcription by bioinformatics software factor family,and analyzed itsphysicochemical properties,conserved domain,conserved motif,and evolutionary relationship.The gene expressionlevelsofXanthomonas campestris pv.mangiferaeindicae(Xcm),Colletotrichum gloeosporioides(Cg),methyl jas-monate(MeJA)andsalicylicacid(SA)treatmentinmango were detected byRT-qPCR.The resultsshowed that therewere 8 E2F/DP transcription factors in the whole genome of mango,named MiE2Fs.The conserved domain pre-基金项目：本研究由国家重点研发专项(2019YFD1001103;2019YFD1000504)、贵州省农业科技支撑项目(黔科合支撑 20182284)和中国热带农业科学院基本科研业务费专项(1630042021022;1630042017019)共同资助引用格式：Gao Q.Y,Sun Y.,Liu Z.X.,Pu J.J.,Yang S.Y.,and Zhang H.,2023,Bioinformatics analysis of E2F/DP transcription factorfamily in Mangifera indica,Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding),21(3):772-781.(高庆远,孙宇,刘志鑫,蒲金基,杨石有,张贺,2023,杧果 E2F/DP 转录因子家族生物信息学分析,分子植物育种,21(3):772-781.)diction showed that MiE2F1-MiE2F5 contained E2F_DD,MiE2F7 and MiE2F8 contained two E2F_TDP con-served domains.The prediction of secondary structure showed that E2F/DP family proteins were similar,randomcoil and-helix were the main components of secondary structure of MiE2F1-MiE2F8 proteins,followed by ex-tend strand and-corner.There was a highly conserved motif in mango.Phylogenetic trees were constructedbased on the E2F/DP gene sequences of mango,soybean,tobacco,poplar,Arabidopsis thaliana,pistachio andgrape,and it was found that the E2F/DP gene of mango was closely related to pistachio and grape.The expressionlevels of MiE2F4,MiE2F5 and MiE2F6 were significantly up-regulated during Xcm and CG infection.Under MeJAstress,the expression level of MiE2F7 was significantlyup-regulated,while the other genes were down-regulated.Under SA stress,the expression levels of all genes were gradually up-regulated from 6 h.These results may lay afoundation for exploring the mechanism of plant defense response involved in E2F/DP gene in mango.KeywordsMango;E2F transcription factor;BioinformaticsE2F/DP 转录因子是所有真核生物中细胞周期进程的关键调节因子，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Klaas et al.,2002;Mariconti et al.,2002)、大豆(Glycinemax)(Schmutzetal.,2010)、毛果杨(Populus trichocarpa)(Tuskan et al.,2006)、烟草(Nicotiana tabacum)(Sekineet al.,1999)、阿月浑子(Pistacia vera)(Zeng et al.,2019)等植物中，已经鉴定到具有保守 DNA 结合结构域的 E2F/DP家族转录因子的存在，调控了一系列细胞周期相关的生物学过程，如细胞分裂、DNA 修复、分化相关的途径，在植物细胞周期的调控中发挥了重要的作用(Sozzanietal.,2010)。在模式植物拟南芥中，发现8 个 E2F/DP 转录因子，被分为三个典型的 E2F(命名为 E2Fa,E2Fb,E2Fc)，两个二聚蛋白(命名为 DPa,DPb)和三个 DEL(命名为 E2Fd/DEL1,E2Fe/DEL2,E2Ff/DEL3)。E2F 的成员的分子特征，包括 DNA 结合域(DNA-binding domain,DB)、Rb 蛋白结合域(Rb-bing-ding domain,RbB)、成二聚体结构域和“Marked box”(MB)结构域；AtE2F 活性可诱导 S 期和核内复制，诱导叶片愈伤组织合成植物激素，AtE2Fb 在转基因拟南芥植物中的过表达导致了根、子叶和叶形态的显著改变(Sozzanietal.,2006)。DP的成员的分子特征，包含亮氨酸拉链二聚结构域和 DNA 结合结构域，与 E2F分支的成员形成二聚体，调控细胞的分裂和增殖(Klaaset al.,2002;Mariconti et al.,2002;La Thangue,2003;Ia-quinta and Lees,2007)。DEL 的成员的分子特征，包含重复的 DNA 结合结构域并以单体形式起作用，参与调节内循环、细胞大小、增殖和 DNA 损伤反应，是一类非典型的 E2F/DP 转录因子(Mariconti et al.,2002;Ramirez-Parra et al.,2004;Sozzani et al.,2006)。在植物细胞增殖、分化和发育过程中，E2F/DP 转录因子和水杨酸(Chandran et al.,2014)等植物激素共同发挥着重要的调控功能。如水杨酸能提高甘草种子萌发和幼苗生长对盐胁迫的耐性(李润枝等,2020)，还能够通过对抗氧化防御反应的调节诱导番茄对灰霉病的抗性(刘佳,2012)；茉莉酸甲酯能够提高桃(Jin etal.,2008)和枇杷(Jin et al.,2014)的耐寒性；在干旱胁迫下，外源茉莉酸甲酯还能改善小麦的光合特性，增加干物质的积累。而杧果(Mangifera indica)是典型的热带果树之一，因基因组杂合度较高限制了高质量杧果参考基因组的获得，从而阻碍了杧果在防御反应研究领域的快速发展。2020 年，华南农业大学高立志研究团队联合多个研究团队，破解了杂合度高的难题，成功获得了染色体级的杧果参考基因组序列，为研究杧果防御反应机制提供精准的基因信息。本研究对杧果 E2F/DP 转录因子家族进行了生物信息学分析，并分析其理化性质、保守结构域、保守基序、进化关系等，结合实时荧光定量 PCR 测定杧果细菌性黑斑病菌、胶孢炭疽菌、茉莉酸甲酯和水杨酸处理下基因表达量，为解析 E2F/DP 基因功能，探究其参与的植物防御反应机制奠定基础。1结果与分析1.1杧果E2F/DP基因家族成员的鉴定通过在杧果基因组数据库中进行 blastp 检索，发现杧果 E2F/DP 基因家族有 8 个成员，分别命名为MiE2F1、MiE2F2、MiE2F3、MiE2F4、MiE2F5、MiE2F6、MiE2F7 和 MiE2F8。通过 ProtParam 在线分析网站，对杧果 E2F/DP 基因家族 8 个成员的理化性质进行分析(表 1)。MiE2F/DP 氨基酸数在 244869 个范围内，蛋白分子量在 27327.996804.19Da 范围内，其中 MiE2F5最大，MiE2F2 最小，等电点在 4.489.18 范围内，不稳定指数在 45.9658.95 范围内，脂溶指数在 71.0788.91 范围内，亲水性平均数在-0.702-0.329 范围内。因此，预测 MiE2F1、MiE2F2、MiE2F3、MiE2F4、杧果 E2F/DP 转录因子家族生物信息学分析BioinformaticsAnalysisof E2F/DPTranscriptionFactorFamilyin Mangifera indica773分子植物育种Molecular Plant Breeding图 1 杧果 E2F/DP 家族保守结构域Figure 1 Conserved domain analysis of E2F/DP protein in mango表 1 杧果 E2F/DP 基因家族成员的基本信息Table 1 Basic information of E2F/DP gene family member基因名称Gene nameMiE2F1MiE2F2MiE2F3MiE2F4MiE2F5MiE2F6MiE2F7MiE2F8序列 IDSequence IDGWHPABLA000481GWHPABLA000488GWHPABLA022128GWHPABLA007479GWHPABLA009256GWHPABLA016360GWHPABLA013224GWHPABLA024101氨基酸数量Number ofamino acids541284474476869660244384分子质量Molecularweight60 378.9932 013.7052 549.3952 756.0296 804.1973 525.6827 327.9043 431.81等电点pI5.364.484.805.025.447.206.119.18不稳定指数Instabilityindex46.8846.0053.5151.9545.9654.3053.8958.95脂溶指数Aliphaticindex78.3788.9175.9571.0779.9079.3084.6776.43亲水性平均系数GRAVY-0.569-0.488-0.675-0.587-0.424-0.329-0.468-0.702MiE2F5 和 MiE2F7 这六个蛋白都为不稳定亲水酸性蛋白，MiE2F6、MiE2F8 这两个蛋白为不稳定亲水碱性蛋白。1.2杧果E2F/DP蛋白保守结构域分析通过 NCBI Conserved Domain Search 分析杧果E2F/DP 家族蛋白质序列保守结构域，发现 8 个成员均含有 E2F_TDP 保守结构域(图 1)，MiE2F1MiE2F5 均含有 E2F_DD 保守结构域，MiE2F5 含有 Gcd10p、E2F_TDP、DP 保守结构域，MiE2F6 含有 PLN02530、DP、E2F_DD 保守结构域，另外，MiE2F7 和 MiE2F8同时包含两个 E2F_TDP 保守结构域。1.3杧果E2F/DP蛋白二级结构预测运用 SOPMA 在线分析对杧果 E2F/DP 蛋白的二级结构进行预测(图 2)，无规则卷曲和-螺旋是MiE2Fs 蛋白二级结构主要元件，其次是延伸链和-转角，MiE2F 家族蛋白质二级结构相似(表 2)，其中-螺旋在 22.69%37.50%范围内，最低为 MiE2F4，最高为 MiE2F8；延伸链在 9.02%17.72%范围内，最774低为 MiE2F7，最高为 MiE2F5；-转角在 1.48%7.02%范围内，最低为 MiE2F3，最高为 MiE2F5；无规则卷曲在 40.45%63.87%范围内，最低为 MiE2F6，最高为 MiE2F4。1.4杧果E2F/DP蛋白保守基序分析通过生物信息学在线网址 MEME，得到杧果 E2F/DP 转录因子家族的蛋白质保守基序并匹配系统发育树(图 3A)，发现杧果 E2F/DP 转录因子家族中鉴定出 3 个保守基序(图 3B)，其中 MiE2F1MiE2F8共有 1 个高度保守的基序 motif 1，MiE2F1MiE2F5有 3 个高度保守的基序 Motif，MiE2F6MiE2F8 有两个重复的高度保守的基序 motif 1。图 2 杧果 E2F/DP 家族的二级结构预测注:横坐标表示氨基酸序列位点Figure 2 Secondary structure prediction of E2F/DP family inmangoNote:The abscissa indicates the position of the amino acid se-quence1.5杧果E2F/DP蛋白系统进化树分析为了清晰地展示杧果 E2F/DP 基因家族的系统发育关系，将杧果(8 个)、大豆(38 个)、烟草(22 个)、毛果杨(16 个)、拟南芥(16 个)、阿月浑子(8 个)、葡萄(7 个)E2F/DP 的蛋白序列进行 BLAST 分析(孙宇等,2021)。用 MEGA7.0 软件构建杧果和 6 种植物 E2F/DP蛋白序列系统进化树(图 4)。结果表明，MiE2F1、MiE2F2、MiE2F3 与阿月浑子(XP_031280393.1,XP_031280394.1)、葡萄(GSVI-VT01033931001)亲缘关系最近。MiE2F4 与阿月浑子(XP_031281057.1,XP_031285172.1,XP_031285171.1)亲缘关系最近。MiE2F5 与阿月浑子(XP_031283221.1)亲缘关系最近。MiE2F6 与阿月浑子(XP_031256-567.1)、葡萄(GSVIVT01025739001)亲缘关系最近。MiE2F7、MiE2F8 与阿月浑子(XP_031279605.1)亲缘关系最近。总体来说，杧果 E2F/DP 基因与阿月浑子关系接近，推测它们有相似的功能。1.6杧果E2F/DP基因家族胁迫响应表达分析将0h 处理作为对照组，利用荧光定量 PCR 检测系统分析发现杧果 E2F/DP 家族基因不同程度地响应病原菌的侵染和植物激素的胁迫(图 5)。MiE2F4、MiE2F5、MiE2F6 在 Xcm 和 Cg 处理下，表达量均显著上调。MiE2F7 在 Xcm 处理下，表达量显著下调；在 MeJA 处理下，表达量显著上调，同处理下，其他基因则表现为下调。MiE2F1、MiE2F2、MiE2F3、MiE2-F4、MiE2F5、MiE2F8 在处理 24 h 和 48 h 阶段，在 Me-JA 处理下显著下调，在 SA 处理下显著上调。2讨论植物受到外界各种非生物及生物胁迫时，胁迫信表 2 杧果 E2F/DP 家族的二级结构主要元件Table 2 The main secondary structural elements of E2F/DP fami-ly in mango蛋白ProteinMiE2F1MiE2F2MiE2F3MiE2F4MiE2F5MiE2F6MiE2F7MiE2F8-螺旋(%)-helix(%)26.8032.3923.6322.6928.3136.3634.4337.50延伸链(%)Extendstrand(%)9.8016.5511.1810.7117.7217.279.027.03-转角(%)-turn(%)2.222.461.482.737.025.913.691.82无规则卷曲(%)Random coil(%)61.1848.5963.7163.8746.9540.4552.8753.65杧果 E2F/DP 转录因子家族生物信息学分析BioinformaticsAnalysisof E2F/DPTranscriptionFactorFamilyin Mangifera indica775分子植物育种Molecular Plant Breeding号经传导，最终激发转录因子的表达，或形成同源、异源二聚体，或与其他蛋白互作，形成一个相互制衡的转录因子调控网络，从而特异性地调控应答基因的转录表达，对内、外界信号做出调节反应(陈儒钢等,2017)。本研究以高立志研究团队破译的染色体级的杧果全基因组序列信息，借助 TBtools 等生物信息学软件分析得到 8 个杧果 E2F/DP 转录因子家族成员(Chen et al.,2020)，可分为 E2F、DP 和 DEL 3 类，均属于不稳定亲水性蛋白，与双子叶植物的亲缘关系较近，不同程度地响应病原菌的侵染和植物激素的胁迫。通过对杧果 E2F/DP 转录因子家族进行保守结构域分析结果来看，E2F_DD 是 E2F 转录因子的二聚结构域，MiE2F1、MiE2F2、MiE2F3、MiE2F4 和 MiE2-F5 都有该保守结构域。E2F_TDP 家族有翼螺旋 DNA结合结构域，能刺激E2F依赖性转录，MiE2F1MiE2F8均包含 DNA 结合结构域。转录因子 DP 为 MiE2F6 特有，会与 E2F形成异源二聚体，并调节参与细胞周期进程。MiE2F7 和 MiE2F8 同时包含两个重复的 DNA结合结构域，符合 DEL的成员的分子特征，这也与非典型E2F 家族成员结构特点一致(Lammens et al.,2009)。通过对杧果 E2F/DP 转录因子家族进行保守基序分析，我们得到 3 个 motif，motif1为 MiE2F1MiE2-F8 共有的 DNA 结合结构域，且 MiE2F5、MiE2F6 和MiE2F7 包含两个重复结构域，motif 2 和 motif 3 为图 3 杧果 E2F/DP 家族的保守基序Figure 3 Conservative motif of E2F/DP family in mango776MiE2F1MiE2F5共有，分析其为 E2F转录因子的二聚结构域，这三个 Motif 的结果与保守结构域分析一致。通过对杧果、大豆、烟草、毛果杨、拟南芥、阿月浑子、葡萄 E2F/DP 基因家族构建系统发育树，发现杧果 E2F/DP 基因与阿月浑子亲缘关系接近，杧果E2F/DP 家族可分为 3 个分支，MiE2F1MiE2F5 为一个分支，MiE2F6 为一个分支，MiE2F7 和 MiE2F8 为一个分支，闫新阳等(2018)发现毛竹和拟南芥 E2F 转录因子氨基酸序列构建的家族进化树具有 3 个分支，李紫薇(2015)发现蒺藜苜蓿和拟南芥 E2F 转录因子都具有 3 个分支。这些研究说明 E2F/DP 基因在进化上结构较为稳定、保守。蒺藜苜蓿 E2F/DP 基因在盐处理下上调表达(Ma et al.,2014)，毛竹启动子大多都有茉莉酸甲酯和水杨酸调控元件，E2F/DP 基因的表达，可能受到环境因子调控(Perrotta et al.,2021)，这与本研究发现图 4 杧果,大豆,烟草,毛果杨,拟南芥,阿月浑子,葡萄 E2F/DP 基因家族系统发育树Figure4Thephylogenetic tree ofE2F/DPgene in Mangifera indica(MiE2F),Glycine max,Nicotiana tabacum(XP),Populus trichocarpa(Potri),Arabidopsis thaliana(AT),Pistacia vera(XP),Vitis vinifera(GSVIVT)杧果 E2F/DP 基因对 MeJA 和 SA 等非生物胁迫处理有应答反应相似。茉莉酸甲酯胁迫处理下，只有MiE2F7 基因上调表达，其他均下调表达，对于该基因的研究还有待进一步的深入。与拟南芥 E2F DEL1同源的 MiE2F7 在胶孢炭疽菌胁迫过程中呈先下调再上调后下调的表达趋势，而水杨酸胁迫时，在 3 h时下调、648h 呈上调表达，说明 MiE2F7 参与了植物的防御反应；在开展白粉病真菌感染拟南芥时，发现拟南芥非典型 E2F DEL1 通过调控水杨酸水平进而调控了叶片防御反应的结果相似(Chandran et al.,2014)，为探究其参与的植物防御反应机制奠定基础。3材料与方法3.1杧果全基因组数据的来源从 NCBI(PRJNA487154)获取杧果全基因组数据和转录组数据，大豆、烟草、毛果杨、拟南芥、阿月浑杧果 E2F/DP 转录因子家族生物信息学分析BioinformaticsAnalysisof E2F/DPTranscriptionFactorFamilyin Mangifera indica777分子植物育种Molecular Plant Breeding图 5 杧果 E2F/DP 基因家族在不同胁迫处理下表达量热图Figure 5 Heatmap of expression of E2F/DP family in mango under different stress treatments子和葡萄 6 个物种的 E2F/DP 转录因子基因组来源于 PlantTFDB 数据库。3.2杧果E2F/DP基因家族成员的鉴定运用 TBtools 软件，将杧果基因组与拟南芥 E2F/DP 转录因子蛋白质进行 BLAST 分析(Chen et al.,2020)，将 E 值设置为 10-5，并使用在线网站 Pfam 获取杧果 E2F/DP 蛋白序列结构域。3.3杧果E2F/DP基因家族的生物信息学分析ProtParam 在线分析工具预测氨基酸数、蛋白质的相对分子质量、等电点、稳定性指数、脂肪系数、总平均亲水性等理化性质。利用 NCBI Conserved Do-main Search 预测基因的保守结构域。再通过 DNA-MAN6.0 软件进行高同源蛋白的氨基酸序列比对。应用在线软件 MEME 对杧果 E2F/DP 基因家族的蛋白质保守基序进行分析(Baileyet al.,2009)。通过在线工具 SOPMA 预测蛋白质的二级结构。3.4系统进化树分析利用 ClustalW 程序对杧果、大豆、烟草、毛果杨、拟南芥、阿月浑子、葡萄的 E2F/DP 基因家族成员的蛋白质序列进行多序列比对(孙宇等,2021)。再使用MEGA 7.0 软件，选择最大似然法构建进化树，其中Bootstrap 参数值设置为 1 000，分析杧果和 6 个物种中的 E2F/DP 基因家族进化关系(Kumar et al.,2016)。3.5杧果病害胁迫处理对杧果嫁接苗(由农业农村部儋州杧果种质资源圃提供,品种为 贵妃杧)进行两种类型胁迫处理，测定 E2F/DP 家族基因其抗性。第一种类型为生物胁迫处理：分生孢子浓度为 2107CFU 的细菌性黑斑病菌778表 3 RT-qPCR 引物序列Table 3 RT-qPCR primer sequences基因GeneMiE2F1MiE2F2MiE2F3MiE2F4MiE2F5MiE2F6MiE2F7MiE2F8Mi18S正向引物(5-3)Forward primer(5-3)ACACTTTCATGCAGCAGTCGGGCTGTTGACTATCCCCAGAGGCTGAAGTTGAAAGCCTTGCAAAGCTCCCCATGGAACTACTCTTTCCCCTGTGAGCAAGGCATGCCGTCGAATATTTTTTGACCTTGTGCAATCGAGAGGAAAGCGTTGGAGTTCTTGCGGCAAGTCTGGTGCCAG反向引物(5-3)Reverse primer(5-3)CAGATGTCCGCTCACTTGAATCTCAGGTGTCATCGTCGTCGGGGATAGTCAACAGCCTCAAGGGACCATCTCCCTCACTTGCAAAAGGGGCTGAATATGAGCACCTCCAAGCATCTCTTCTCCCCAACCAGTAACTTTGCGGCCTAGCGCTCACACTATCACGGTATCTATCTCTTCG悬浮液、浓度为 2106个/mL 的胶孢炭疽菌分生孢子悬浮液(菌株均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所分离并保存)；第二种类型为非生物胁迫处理：5 mmol/L水杨酸、5 mmol/L 茉莉酸甲酯。将株高约 60 cm，1 年生的杧果嫁接苗移栽到花盆内，在室温 25 下，对新抽的嫩叶进行处理，设置 Xcm、Cg、MeJA、SA 四个处理，每个处理 3 株苗，0 h 处理作为对照组，分别对杧果嫁接苗叶片均匀喷雾，取样时间分别为 0、3、6、12、24、48 h，之后将杧果叶片剪碎，液氮速冻，保存在-80 下备用(刘志鑫等,2021;孙宇等,2021)。3.6 RNA提取及cDNA合成运用 RNAprep Pure 多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取杧果总 RNA，测定总 RNA 的浓度(超微量紫外分光光度计)，置于-80 保存备用(孙宇等,2021)。运用 FirstKing cDNA试剂盒中的方法反转录生成第一链 cDNA 并保存。3.7杧果E2F/DP基因家族表达分析利用实时荧光定量 PCR 检测系统和 UltraSYBRMixture 试剂盒(北京康为世纪)，测定杧果细菌性黑斑病菌、胶孢炭疽菌、茉莉酸甲酯和水杨酸胁迫下杧果 E2F/DP 家族基因的差异表达情况，反应体系为18 L，每个处理样本设置 3 个重复(孙宇等,2021)。根据 MiE2Fs 基因序列利用在线引物设计软件Primer3Plus 设计实时荧光定量 PCR 引物 MiE2F-F/MiE2F-R(表 3)，以杧果 Mi18S 作为内参基因，运用2-Ct法和 SPSS 软件对获得的样品 Ct 值进行数据统计并绘制热图，以老叶(35 d)的相对表达量作为对照，记为 1，相对表达量高于 1.5 定义为显著上调表达，用“#”标识，小于 0.5 定义为显著下调表达，用“*”标识。作者贡献张贺和高庆远是本研究的实验设计者和实验研究的执行人；高庆远完成数据分析和论文初稿的写作；孙宇和刘志鑫参与实验设计和试验结果分析；张贺、蒲金基和杨石有是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析和论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。致谢本研究由国家重点研发专项(2019YFD1001103;2019YFD1000504)、贵州省农业科技支撑项目(黔科合支撑 2018 2284)和中国热带农业科学院基本科研业务费专项(1630042021022;1630042017019)共同资助。参考文献Bailey T.L.,Boden M.,Buske F.A.,Frith M.,Grant C.E.,ClementiL.,Ren J.Y.,Li W.W.,and Noble W.S.,2009,MEMESuite:tools for motif discovery and searching,NucleicAcids Res.,37(W):202-208.Chandran D.,Rickert J.,Huang Y.X.,Steinwand M.A.,Marr S.K.,and Wildermuth M.C.,2014,Atypical E2F transcriptionalrepressor del1 acts at the intersection of plant growth andimmunity by controlling the hormone salicylic acid,CellHost Microbe.,15(4):506-513.Chen C.J.,Chen H.,Zhang Y.,Thomas H.R.,Frank M.H.,He Y.H.,and Xia R.,2020,TBtools:An integrative toolkit devel-oped for interactive analyses of big biological data,Mol.Plant.,13(8):1194-1202.Chen R.G.,Gong Z.H.,Li M.H.,Li D.W.,and Huang W.,2017,Research advance of the transcription factors networks re-lated to plant adverse environmental stress,Nongye Sheng-wu Jishu Xuebao(Journal of Agricultural Biotechnology),杧果 E2F/DP 转录因子家族生物信息学分析BioinformaticsAnalysisof E2F/DPTranscriptionFactorFamilyin Mangifera indica779分子植物育种Molecular Plant Breeding18(1):126-134.(陈儒钢,巩振辉,逯明辉,李大伟,黄炜,2017,植物抗逆反应中的转录因子网络研究进展,农业生物技术学报,18(1):126-134.)Jin P.,Duan Y.F.,Wang L.,Wang J.,and Zheng Y.H.,2014,Re-ducing chilling injury of loquat fruit by combined treatmentwith hot air and methyl jasmonate,Food Bioprocess Tech-nol.,7(8):2259-2266.Jin P.,Zheng Y.H.,Tang S.S.,Rui H.J.,and Wang C.Y.,2008,Acombination of hot air and methyl jasmonate vapor treat-ment alleviates chilling injury of peach fruit,PostharvestBiol.Tec.,52(1):24-29.Klaas V.,Jeroen R.,Lieven V.,Pierre R.,Stephane R.,and DirkI.,2002,Genome-wide analysis of core cell cycle genes inarabidopsis,Plant Cell.,14(4):903-916.Kumar S.,Stecher G.,and Tamura K.,2016,MEGA7:Molecularevolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger data-sets,Mol.Biol.Evol.,33(7):1870-1874.Lammens T.,Li J.,Leone G.,and Veylder L.D.,2009,