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第 46 卷 第 1 期Vol.46 No.1 2024 年 1 月Jan.2024中 国 草 地 学 报Chinese Journal of Grassland添加蔗糖对高水分苜蓿青贮中真菌菌群多样性的影响李荣荣1，2，胡明1，魏睿1，徐春城2，*（1.渭南师范学院环境与生命科学学院，陕西 渭南 714000；2.中国农业大学工学院，北京 100083）摘要：通过宏基因组测序研究了高水分苜蓿单独青贮（对照组）和添加蔗糖（蔗糖组）青贮中真菌菌群多样性。结果表明：与对照组相比，蔗糖添加剂显著增加了乳酸含量（P0.05），显著降低了乙酸、丁酸和氨态氮含量以及好氧细菌数量（P0.05）。子囊菌门是苜蓿原料和两组青贮中相对丰度最大的真菌门，担子菌门次之；莫氏黑粉菌属和链格孢属是苜蓿原料上的优势真菌属，而白僵菌属是两组青贮中最丰富的属，曲霉属和青霉属的相对丰度较低。与对照组相比，蔗糖组中白僵菌属、曲霉属和青霉属的相对丰度分别下降了 24.59%、1.49%和 0.22%。南极莫氏黑粉菌和互隔交链孢霉是苜蓿原料上最丰富的真菌种，而球孢白僵菌主导两组青贮中真菌菌群，黄曲霉相对丰度较低。球孢白僵菌和黄曲霉的相对丰度与乳酸含量呈反比，与氨态氮、丁酸和乙酸含量成正比。综上所述，蔗糖添加剂组发酵品质良好，南极莫氏黑粉菌主导苜蓿原料上的真菌菌群，而球孢白僵菌主导高水分青贮中真菌菌群，添加蔗糖能够在一定程度上抑制球孢白僵菌的繁殖。关键词：宏基因组；高水分；苜蓿青贮；真菌菌群；多样性中图分类号：S816.53；S541.9 文献标志码：A 文章编号：1673-5021（2024）01-0143-06苜蓿（Medicago sativa）刈割后晾晒使水分降到50%左右制作成半干青贮，不仅能很好地保持苜蓿的营养成分而且便于运输，深受牧草生产和养殖企业的欢迎。然而，由于我国南方夏季连续的阴雨天气，北方地区的雨热同季等因素，该技术的推广和应用受到很大程度的制约。而苜蓿高水分青贮能够克服晾晒过程中阴雨天气造成的落叶和霉变损失，因此，高水分苜蓿青贮优质调控技术的研究与应用显得尤为重要。青贮是一种由乳酸菌主导的有机酸（乳酸、乙酸等）发酵过程，但由于苜蓿原料缓冲能高，可溶性碳水化合物和干物质含量低，在好氧呼吸阶段，好氧细菌和肠细菌等不良微生物与乳酸菌竞争可利用的发酵底物，产生大量的乙酸和氨态氮，使青贮pH 下降缓慢13。附着在苜蓿原料上的霉菌和酵母菌等真菌利用残留的氧气、适宜的 pH 和环境湿度等条件，利用发酵底物实现短期的快速繁殖，而且在有氧开封阶段，真菌是造成青贮有氧腐败的关键因素45。真菌繁殖导致苜蓿原料中的营养物质被大量分解，严重降低饲料的营养价值，而且部分真菌在生长繁殖过程中能够产生霉菌毒素等次级代谢产物，其在青贮环境中能够稳定存在，对动物的健康构成威胁6。之前已有通过高通量测序和 ITS 引物解析苜蓿青贮中的真菌菌群结构的报道79，但由于 ITS引物序列长度的局限性，往往只能揭示真菌菌群在属水平上的多样性。随着测序技术的发展，人们对微生物的序列分析也更加深入。全宏基因组测序将微生物的基因序列打断成小片段后，进行序列组装，能够实现菌株序列的全长测序，从而准确解析微生物在种水平上的多样性。因此，本研究采用宏基因组测序，深入解析高水分苜蓿单独青贮和添加蔗糖青贮中的真菌菌群多样性，从而为抑制真菌繁殖，减少潜在的毒素产生，保障高水分苜蓿青贮安全，开发新型青贮调制工艺提供数据支撑。1材料与方法1.1试验原料紫花苜蓿（白绿 310sc）取自北京市农林科学院小汤山试验基地，于 2021 年 8月收获第三茬初花期苜蓿，留茬高度约 10 cm。1.2青贮制作用铡刀将新鲜苜蓿切碎（2 cm 左右），混匀装入真空包装袋中，每袋约 300 g，用真空包装机抽真空并密封。蔗糖（化学纯）以 20 g/kg FM（鲜物质）的DOI：10.16742/j.zgcdxb.20230126*通信作者，E-mail：收稿日期：2023-05-05；修回日期：2023-08-12基金项目：国家自然科学基金项目（31872420）；渭南师范学院人才项目（2022RC24）作者简介：李荣荣（1992-），女，河南汝州人，博士，讲师，主要从事饲草饲料调制加工与利用研究，E-mail：.143中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 1 期比例溶于无菌水，以 20 mL/kg FM 的添加量均匀喷洒到苜蓿上，混匀后作为蔗糖组；对照组加入相同容积的无菌水，室温发酵 56 d，设置 3个重复。1.3指标测定方法取 20.0 g 样品于自封袋，加入 180 mL 灭菌去离子水，摇匀后吸取上清进行微生物计数。其中，乳酸菌的计数采用 MRS 培养基，酵母菌的计数采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，好氧细菌的计数采用营养琼脂培养基，肠细菌的计数采用蓝光肉汤培养基。称取约 200 g新鲜或青贮样品置于恒温 65 鼓风干燥箱中，用于测定干物质。依据苯酚-次氯酸钠比色法10和蒽酮-硫酸比色法11分别测定氨态氮和可溶性碳水化合物的含量；粗蛋白含量的测定采用凯氏定氮仪；有机酸含量的测定采用高效液相色谱仪12。1.4测序数据分析称取20.0 g苜蓿原料和青贮样本，加入无菌水后充分混匀，置于 4 冰箱中浸提约 2 h，过 4层纱布后将过滤液在 10000 r/min下离心 1 min，弃上清后置于20 冰箱中备用。采用PowerSoilDNA Isolation Kit试剂盒（北京奥维森基因科技有限公司）提取新鲜苜蓿和青贮样本中的 DNA，质检采用 Qubit 和 1%琼脂糖凝胶电泳。将新鲜苜蓿和青贮样品基因打断成约 300 bp的片段。采用 Agilent 2100进行文库片段检测，用 Illumina HiSeq 4000 测序平台进行测序。原始下机数据通过 Trimmomatic软件进行质控，以提高 Clean reads的质量。物种注释和测序数据组装分别采用 DIAMOND BLASTX 算法和 MEGAHIT 软件，采用 Prodigal进行序列预测，基因序列的去冗余采用 CD-HIT 软件，采用 Bowtie完成测序数据和非冗余基因集的比对，得到基因列表并对其进行标准化。1.5数据统计处理所有试验数据经过 Excel处理后，采用 SPSS 软件中的独立样本 T 检验分析发酵品质、化学成分和微生物组成，P0.40）解析真菌菌群与青贮发酵特性之间的相关关系。2结果与分析2.1苜蓿的原料特性由表 1 可知，苜蓿原料的干物质和粗蛋白含量分别为 214.43 g/kg FM 和 244.16 g/kg DM 可溶性碳水化合物的含量为 39.58 g/kg DM。野生乳酸菌的 数 量 为 4.62 log10 cfu/g FM，而 酵 母 菌 数 量 为3.11 log10 cfu/g FM。2.2苜蓿青贮中发酵品质、化学组分和微生物数量由表 2可知，与对照组相比，蔗糖组显著提高了乳酸含量（P0.05），降低了氨态氮含量以及乳酸菌和好氧细菌数量（P0.05）。2.3苜蓿青贮中真菌菌群结构由表3可知，在门水平上，子囊菌门（Ascomycota）是原料组中相对丰度最大的门，其次是担子菌门（Basidiomycota）；发酵 56 d后，子囊菌门仍然是对照组和蔗糖组中相对丰度最大的门；在属水平上，莫氏黑粉菌属（Moesziomyces）、链格孢属（Alternaria）和双极霉属（Bipolaris）是原料组中相对丰度位于前三的优势属；发酵 56 d 后，白僵菌属（Beauveria）、柄锈菌属（Puccinia）和粪壳菌属（Sordaria）是对照组中相对丰度位于前三优势属；白僵菌属、粪壳菌属和柄锈菌属是蔗糖组中相对丰度位于前三的优势属，而青霉属（Penicillium）和曲霉属（Aspergillus）的相对丰度较低；在种水平上，南极莫氏黑粉菌（Moesziomyces antarcticus）是原料组中相对丰度最大的种；青贮 56 d后，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、叶锈菌（Puccinia triticina）和大孢粪壳菌（Sordaria macrospora）是对照组中的主要优势种；球孢白僵菌、大孢粪壳菌和叶锈表 1苜蓿的原料特性Table 1Raw material characteristics of alfalfa指标Item原料化学组分Chemical composition干物质（g/kg FM）Dry matter（g/kg FM）214.43可溶性碳水化合物（g/kg DM）Water soluble carbohydrates（g/kg DM）39.58粗蛋白（g/kg DM）Crude protein（g/kg DM）244.16微生物数量Microbial counts乳酸菌（log10 cfu/g FM）Lactic acid bacteria（log10 cfu/g FM）4.62好氧细菌（log10 cfu/g FM）Aerobic bacteria（log10 cfu/g FM）5.33酵母菌（log10 cfu/g FM）Yeasts（log10 cfu/g FM）3.11肠细菌（log10 cfu/g FM）Entero bacteria（log10 cfu/g FM）6.40注：DM：干物质；FM：鲜物质，下同。Note：DM：Dry matter；FM：Fresh matter，the same below.144李荣荣 胡明 魏睿等 添加蔗糖对高水分苜蓿青贮中真菌菌群多样性的影响菌是蔗糖组中的主要优势种，而黄曲霉（Aspergillus flavus）的相对丰度较低。与对照组相比，蔗糖组有更高的大孢粪壳菌相对丰度，更低的球孢白僵菌和黄曲霉相对丰度。2.4苜蓿青贮发酵特性与真菌菌群相对丰度的相关性分析由表4可知，乙酸含量和丁酸含量与球孢白僵菌和黄曲霉的相对丰度呈极显著正相关（P0.001），而与互隔交链孢霉（Alternaria alternata）的相对丰度呈极显著负相关（P0.001）。大孢粪壳菌的相对丰度分别与乳酸菌数量和氨态氮含量呈极显著负相关（P0.001），而与乳酸含量呈极显著正相关（P0.001）。3讨论青贮发酵主要依靠乳酸菌等益生菌，将可溶性碳水化合物转化为有机酸（主要是乳酸），降低青贮pH，抑制腐败微生物的活动13。充足的发酵基质是表 3添加蔗糖对苜蓿青贮中优势真菌菌群多样性的影响Table 3Influence of sucrose on fungal community diversity in alfalfa silage生物分类Biologicalclassification门水平属水平种水平优势真菌菌群Dominant fungalflora子囊菌门担子菌门毛霉门白僵菌属粪壳菌属柄锈菌属莫氏黑粉菌属链格孢属双极霉属镰刀菌属毛霉属青霉属曲霉属多孔菌属球孢白僵菌南极莫氏黑粉菌互隔交链孢霉盾壳霉球孢菌叶锈菌大孢粪壳菌尖孢镰刀菌射纹多孔菌黄曲霉不明毛霉玫红假裸囊菌拉丁名Latin nameAscomycotaBasidiomycotaMucoromycotaBeauveriaSordariaPucciniaMoesziomycesAlternariaBipolarisFusariumMucorPenicilliumAspergillusPolyporusBeauveria bassianaMoesziomyces antarcticusAlternaria alternataSphaerospora scutellaPuccinia triticinaSordaria macrosporaFusarium oxysporumPolypora radiataAspergillus flavusMucor ambiguusPseudogymnocystis roseus相对丰度（%）Relative abundance(%)原料组Fresh alfalfa71.0528.070.580.212.400.5113.769.765.461.780.080.151.110.050.1912.019.743.140.032.400.510.010.090.040.19对照组Control group78.688.731.7169.853.395.620.390.470.130.911.120.421.762.0569.850.310.470.025.383.390.722.050.341.100.08蔗糖组Sucrose group82.6311.103.4545.2617.395.051.501.190.534.422.480.200.271.1845.261.311.190.254.9017.393.671.180.102.460.52表 2添加蔗糖对青贮发酵特性的影响Table 2Effect of sucrose on characteristics of ensiled alfalfa指标Item对照组蔗糖组P值发酵品质Fermentation qualitypH值pH value5.724.310.001乳酸（g/kg DM）Lactic acid（g/kg DM）8.8864.330.001乙酸（g/kg DM）Acetic acid（g/kg DM）38.6725.300.002丙酸（g/kg DM）Propionic acid（g/kg DM）2.091.140.001丁酸（g/kg DM）Butyric acid（g/kg DM）7.170.000.001氨态氮（g/kg DM）Ammonia nitrogen（g/kg TN）171.5325.760.001化学组分Chemical composition干物质（g/kg FM）Dry matter（g/kg FM）195.40224.2170%）的环境中19。陆晓林等20通过平板分离和生理生化鉴定试验，发现从番茄植株上分离的 3 株尖孢镰刀菌都喜酸性环境，尤其在 pH 值为 4的条件下生长速度最快。本研究中蔗糖组比对照组有更高的尖孢镰刀菌相对丰度，说明蔗糖组的酸性环境增加了尖孢镰刀菌相对丰度。依据致病性，尖孢镰刀菌可分为非致病性和致病性菌株，前者通常以腐生菌存在于土壤或植物组织中，而后者具有广泛的寄主范围，它们的菌丝体能够分泌镰刀菌酸、恩镰孢菌素和白僵菌素等毒素21，其结构在青贮环境中相对稳定，对动物健康和饲料安全产生潜在威胁。因此，今后有必要对苜蓿青贮中的真菌毒素进行研究。好氧细菌和肠细菌等腐败微生物在青贮发酵初期与乳酸菌等竞争可利用的碳水化合物，引起缓慢的 pH 值下降，为球孢白僵菌和叶锈菌等不耐酸的真菌增殖创造条件，因此，本研究中球孢白僵菌和叶锈菌的相对丰度与乙酸、丙酸和氨态氮含量以及好氧细菌的数量呈显著的正相关，与乳酸含量呈显著的负相关。黄曲霉的相对丰度与乳酸含量呈显著的负相关，而与乙酸、丁酸、氨态氮含量呈显著表 4真菌菌群的相对丰度与青贮发酵产物的相关性分析Table 4Correlation analysis of the relative abundance of fungal flora and fermentation products指标Item球孢白僵菌互隔交链孢霉叶锈菌尖孢镰刀菌黄曲霉大孢粪壳菌不明毛霉相关系数 Correlation coefficient乳酸Lactic acid-0.89*0.82*-0.77*0.91*-0.81*0.96*0.84*乙酸Acetic acid0.92*-0.80*0.80*-0.81*0.86*-0.93*-0.76*丙酸Propionic acid0.87*-0.90*0.85*-0.73*0.77*-0.88*-0.89*丁酸Butyric acid0.90*-0.86*0.84*-0.86*0.90*-0.92*-0.80*氨态氮Ammonia nitrogen0.95*-0.78*0.81*-0.90*0.93*-0.96*-0.73*乳酸菌Lactic acid bacteria0.78*-0.570.92*-0.79*0.79*-0.83*-0.85*好氧细菌Aerobic bacteria0.79*-0.490.90*-0.75*0.83*-0.84*-0.89*注：*，P0.01；*，P0.001。Note：*，P0.01；*，P0.001.146李荣荣 胡明 魏睿等 添加蔗糖对高水分苜蓿青贮中真菌菌群多样性的影响的正相关，说明青贮中乳酸的大量积累，实现酸度的快速下降，有利于抑制黄曲霉的生长，潜在减少黄曲霉毒素污染的风险。4结论白僵菌属是对照组和蔗糖组青贮中最丰富的真菌属，而曲霉属、青霉属的相对丰度较低，添加蔗糖能够在一定程度上促进子囊菌门和担子菌门的繁殖，抑制白僵菌属、曲霉属和青霉属以及球孢白僵菌和叶锈菌等真菌的繁殖。球孢白僵菌主导对照组和蔗糖组青贮中真菌菌群，而黄曲霉相对丰度较低；球孢白僵菌和黄曲霉的相对丰度与乳酸含量呈反比，与乙酸、丁酸和氨态氮含量成正比。参考文献（References）：1 Li R R，Zheng M L，Zheng M H，et al.Metagenomic analysis reveals the linkages between bacteria and the functional enzymes responsible for potential ammonia and biogenic amine production in alfalfa silageJ.Journal of Applied Microbiology，2021，132（4）：2594-2604.2 Li R R，Jiang D，Zheng M L，et al.Microbial community dynamics during alfalfa silage with or without clostridial fermentation J.Scientific Reports，2020，10（1）：17782.3 李荣荣，郑猛虎，崔欣雨，等.优良乳酸菌的筛选及对苜蓿青贮发酵品质的影响 J.中国草地学报，2021，43（11）：69-75.LI Rongrong，ZHENG Menghu，CUI Xinyu，et al.Screening of lactic acid bacteria and its effect on fermentation characteristics of alfalfa silageJ.Chinese Journal of Grassland，2021，43（11）：69-75.4 Jiang D，Li B N，Zheng M L，et al.Effects of Pediococcus pentosaceus on fermentation，aerobic stability and microbial communities during ensiling and aerobic spoilage of total mixed ration silage containing alfalfa J.Grassland Science，2020，66（4）：215-224.5 Jiang D，Zheng M L，Niu D Z，et al.Effects of steam explosion pretreatment and Lactobacillus buchneri inoculation on fungal community of unensiled and ensiled total mixed ration containing wheat straw during air exposure J.Journal of Applied Microbiology，2020，128（3）：675-687.6 Dunire L，Sindou J，Chaucheyras-Durand F，et al.Silage processing and strategies to prevent persistence of undesirable microorganismsJ.Animal Feed Science and Technology，2013，182（3）：1-15.7 Drouin P，Tremblay J，Da Silva B，et al.Changes to the microbiome of alfalfa during the growing season and after ensiling with Lentilactobacillus buchneri and Lentilactobacillus hilgardii inoculant J.Journal of Applied 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of different varieties and cutting time on fermentation quality and protein degradation of alfalfa silageJ.Chinese Journal of Grassland，2020，42（3）：94-101.13 徐春城.现代青贮理论与技术 M.北京，科学出版社，2013.XU Chuncheng.Silage science and technology M.Beijing：The Science Publishing Company，2013.14 Zheng M L，Niu D Z，Jiang D，et al.Dynamics of microbial community during ensiling direct-cut alfalfa with and without LAB inoculant and sugarJ.Journal of Applied Microbiology，2017，122，1456-1470.15 Gebremariam A，Chekol Y，Assefa F.Phenotypic，molecular，and virulence characterization of entomopathogenic fungi，Beauveria bassiana（Balsam）Vuillemin，and Metarhizium anisopliae（Metschn.）Sorokin from soil samples of Ethiopia for the development of mycoinsecticide J.Heliyon，2021，7（5）：e7091.16 况再银，童文，孙佩，等.球孢白僵菌的侵染特性及应用研究进展 J.微生物学通报，2023，6（3）：1-13.KUANG Zaiyin，TONG Wen，SUN Pei，et al.Research progress in infection characteristics and application of Beauveria bassiana J.Microbiology China，2023，6（3）：1-13.17 Pleadin J.Mycotoxins in 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Sciences，Weinan Normal University，Weinan 714000，China；2.College of Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）Abstract：This study aimed to investigate the diversity of the fungal community in high-moisture alfalfa silage，both in the control group（without sucrose supplementation）and in the sucrose group（supplemented with sucrose），using metagenomic sequencing.The results showed that，in comparison to the control group，the addition of sucrose significantly increased the lactic acid content（P0.05），while significantly reducing the concentrations of acetic acid，butyric acid，and ammonia nitrogen，as well as the population of aerobic bacteria（P0.05）.Ascomycetes were identified as the most abundant fungal phyla in both alfalfa and its silage，followed by Basidiomycetes.Genera such as Moriella and Streptospora dominated the fungi community in alfalfa，whereas Beauveria was the most abundant genus in both groups of silage.Aspergillus and Penicillium exhibited relatively low abundances.In comparison to the control group，the relative abundances of Penicillium，Aspergillus，and Alternaria in the sucrose group were reduced by 24.59%，1.49%，and 0.22%，respectively.The dominant fungi species in alfalfa were Tenebrio Moesei and Streptospora interseptum，while Beauveria bassiana dominated the two groups of silage.Conversely，the relative abundance of Aspergillus flavus was low.Furthermore，the relative abundances of Bassiana bassiana and Aspergillus flavus showed a negative correlation with lactic acid content and a positive correlation with the contents of acetic acid，butyric acid，and ammonia nitrogen.In conclusion，the sucrose addition group exhibited superior fermentation quality.Melonella australis and Beauveria bassiana were identified as the dominant fungal populations in high-moisture alfalfa and its silage，respectively.The addition of sucrose can inhibit the propagation of Beauveria bassiana to a certain extent.Key words：Metagenome；High-moisture；Alfalfa silage；Fungal community；Diversity【责任编辑 吴尧】148