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1、摘要 嗜酸乳杆菌作为益生菌的一种，在促进人体健康和预防疾病中具有重要作用，并日益成为乳品科学研究的热点。对于嗜酸乳杆菌，不管是活菌制剂的开发还是嗜酸乳杆菌的分离培养及其酶学研究、发酵剂的制备等，都需要良好的增菌培养基，使嗜酸乳杆菌得以大量增殖。因此，优化设计嗜酸乳杆菌培养基是一项十分重要的基础研究工作。 本实验以普通培养基为对照，加入不同的碳源、氮源，以及不同的碳氮源之比，不同的增值因子，对嗜酸乳杆菌进行研究，最后还有进行静态培养条件的优化选择，以此来确定最好的增菌培养基。结果表明： 1 绪论 1.1嗜酸乳杆菌概述 嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）属
2、革兰氏阳性无芽孢杆菌科的乳杆菌属，其DNA中G+C含量少于34%~37%mol，形态呈细长杆状，杆的末端呈圆形，以单个、成对或短链形式存在，不运动，无鞭毛，无芽孢，过氧化氢酶阴性，不产生细胞色素。不液化明胶，不分解酪素，不产生吲哚和硫化氢。细胞壁肽聚糖为L-D-天冬氨酸盐型，通常缺乏磷酸壁，在某些菌株中，可以测出少量甘油磷酸壁，细胞中不含有任何可以鉴别的己糖和戊糖，是广泛存在于人体和一些动物肠道中的益生菌[1]。 近年来，随着人们健康意识的逐步增强，益生菌及其制品逐渐成为食品商今后发展的重点。嗜酸乳杆菌是乳酸菌家族中极为重视研究与开发的菌种之一，被视为第三代乳酸发酵剂菌种，嗜酸乳杆菌是人体肠
3、道中的重要微生物，与人体健康息息相关[2]。当其达到一定数量时，可以起到健康促进效果。作为益生制品中常用的主要菌种之一，嗜酸乳杆菌培养的研究极具意义的[3]。 1.1.1嗜酸乳杆菌的健康促进特性 健康促进特性是指对人体有益细菌所产生的细菌素、多糖、特殊酶系等，通过改善机体的微生态平衡，刺激特异性或非特异性的免疫机制，达到增强机体健康、防止某些疾病的作用。20世纪二三十年代，人们用能在人体胃肠道内存活的嗜酸乳杆菌制备酸奶并进行临床尝试，发现对便秘、痢疾等疾病产生暂时的缓解作用[4]，嗜酸乳杆菌其健康促进特性如下： (1)生物屏障作用[5] 嗜酸乳杆菌与肠粘膜上皮细胞相互作用、密切结合，构
4、成了生物屏障；同时，通过其自身及其代谢物与其它细菌之间的相互作用，调整菌群之间的关系，维持和保证菌群最佳优势组合以及组合的稳定，阻止了致病菌的定殖和入侵，拮抗致病菌和有害微生物的生长及其毒素的粘附引[6]。 (2)营养作用[7] 乳酸菌发酵后产生的乳酸，可提高胃内食物的预消化，提高钙、磷、铁的利用率和维生素D的吸收。乳糖分解产生的半乳糖，是构成脑神经系统中脑苷脂的成分，与婴幼儿出生后的生长有密切的关系；产生的大量维生素B群能促进人体神经细胞的发育；提高人体肠内的β一半乳糖苷酶的活性，促进奶质中乳糖的吸收，从而缓解乳糖不耐症。能分泌蛋白酶，促进蛋白质的消化吸收。 (3)抗癌作用[8] 流
5、行病学研究表明，腐败性细菌作用于食物成分和胆汁酸盐类，能生成亚硝基化合物、胆固醇及胆汁酸的代谢物、氨基酸代谢物(酚类、吲哚、硫化氢)等有机致癌物质。与这些致癌物质有关的肠内细菌酶有β一葡萄糖醛酸酶、巯基还原酶、偶氮还原酶等。嗜酸乳杆菌能改善肠道菌群，抑制了致癌物质的产生[9]；同时，嗜酸乳杆菌及其代谢物活化了免疫功能，抑制癌细胞的形成和增殖[10-12]。 (4)降低胆固醇水平 普遍认为，高胆固醇症是引起心脏发病的主要原因之一，因此降低胆固醇水平意味着减少心脏病发作的风险，Gilliland[13-14]等、Lin[15]等、Thompson[16]等对嗜酸乳杆菌降低胆固醇的能力作了研究，
6、他们指出，在厌氧和胆汁盐存在的情况下，嗜酸乳杆菌能够明显的降低培养介质中胆固醇的含量。有关乳酸菌降低胆固醇的机理尚不清楚。目前存在两种看法：一种看法认为，乳酸菌拥有能够修饰胆固醇的酶系，胆固醇能够被细菌细胞同化；另一种认为，某些乳酸菌种具有使牛磺胆酸和甘氨氮酸两种胆汁酸脱结合的能力，结合后的胆汁酸影响肠道内脂类物质的吸收，进而导致胆固醇的吸收能力降低。影响胆固醇的水平。 (5)延缓衰老效应 人的衰老与肠内有害细菌产生的氨、胺、硫化氢、吲哚、酚、粪臭素等有害腐败产物有很大关系。嗜酸乳杆菌代谢产生的乳酸能够抑制这些腐败物，使机体衰老的过程变得缓慢。 1.1.2嗜酸乳杆菌的应用 (1)在乳
7、品中的应用 乳是乳酸菌良好的天然培养基，含有能促进人类生长发育及维持健康水平的几乎一切的必须营养成分，被认为是迄今为止一种比较理想的完全食品。乳中含有4．6％一4．9％乳糖[17]，是乳酸菌代谢中重要的碳水化合物来源。因此乳酸菌的应用首先体现在乳制品上。公元前641年就有“酸奶"的记载，诺贝尔医学奖得主梅其尼科夫在20世纪初就提出“酸奶长寿说”。嗜酸乳杆菌在乳品中应用最多的是发酵乳产品。用于传统酸奶的发酵菌种主要是保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌。普通酸奶生产所用的发酵菌种为前两种。前两种菌具有优良的发酵性能并能赋予酸奶良好的风味，但是耐受胃酸和胆汁酸的性能差，其存活率0．01％'-'
8、0．65％，也不能在肠道内定殖，所以有益作用受到很大限制。嗜酸乳杆菌产酸和产黏能力强，但是风味差。与前两种菌结合使用，既能获得良好风味，又能发挥其生理功能使发酵乳具有很好的益生作用。Sander[18] (1994)报道，在法国，含有双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的新型乳制品占整个乳消费量的的4％，在瑞典则占25％，而且在产品名称前加“bio”即“生物性”。Sandine报道，利用超滤乳制得类似于普通乳制品中，含有108个／ml活性嗜酸乳杆菌。Nilson[19]等报道，在印度，嗜酸乳杆菌已应用于冰激凌中，这种产品是将嗜酸乳杆菌的细胞制剂加入到冰激凌中，制成可口、具有疗效的冰冻产品。目前，嗜酸乳杆菌已经
9、用于酸奶、奶酪、酸奶油、马奶酒等常见的发酵乳制品。基于人们的健康需求看乳品市场前景，嗜酸乳杆菌是理想的第三代发酵剂。 (2)在医药上的应用 嗜酸乳杆菌在医学上的应用主要是由于其所具有的保健作用。自20世纪50年代以 来，抗生素得到了广泛的应用，然而给人们带来的危害也越来越多，长期使用抗生素会导致肠道菌群紊乱，造成肠道功能失调和耐药菌株增加[19]，因此，人们试图求助于生物防治疗法。国外嗜酸乳杆菌制剂的研究较为普及，产品种类繁多。德国的Malutka，法国的Synerlac等适用于不同生理，病理人群，具有明显的医疗效果。我国对嗜酸乳杆菌的研究应用相对较少，如能采用现代的生物技术筛选出具有优
10、良性能的菌株，开发出具有明显疗效的作用的产品，必将受到消费者的青睐，获得良好的社会、经济效益。 (3)在工业上的应用 目前嗜酸乳杆菌在工业上的应用主要是生产乳酸。乳酸是具有重要的工业价值的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工纺织业、电镀等。目前全世界乳酸的产量为30kt。我国在1994年于重庆率先生产药用乳酸钙。随着技术的发展，国内外对乳酸菌的发酵、回收和精致等一系列技术进行了很多研究，以便为嗜酸乳杆菌产乳酸的发展找到一条更为便捷、经济的方法[20]。 1.2嗜酸乳杆菌研究开发建议[21] 1.2.1菌种资源的开发与保护 益生菌市场的核心问题是菌种的选择和菌种的活性。开发新菌种、培育优
11、良菌种，是该领域前沿性的、独占性利益的研究。前端时间伊利集团购买了芬兰维利奥公司益生菌LGG的五年使用权，就是菌种资源价值的实际例证。我国地域辽阔，气候多样，菌种丰富。如内蒙古地区东西跨度大，草原类型齐全，利用自然有益菌的历史悠久，所以乳酸菌种类非常丰富。近年，有日本学者来内蒙古、甘肃等地采集马奶酒等产品的菌种，对我国应该有所启示。我国政府应该从物种唯一性的战略高度，采取保护呵呵开发对策。有的传统特色产品中含有独特菌种和菌株，可能具有特殊的生理功能，是开发特色产品的重要资源。另外，开发与保护稀有菌种，也是生物保护的重大问题。 1.2.2菌株的差异性研究 研究表明，同一菌种的不同菌株，生理功
12、效存在较大差异，实际应用中依赖相近菌株推测后直接使用，必须对菌株和产品进行严格检验鉴定后方可使用。 1.2.3相关因素研究 嗜酸乳杆菌的商品化在技术层面涉及生理特性、生物学特性、功能与效用，其相关因素有生长促进剂、抑菌剂、螯合剂、防冻剂和菌种保护剂等。目前，我国对这些要素的研究与运用还处于探索与改善阶段，应该从商品化角度对潜力大的菌株进行重点系统研究，如嗜酸乳杆菌生长缓慢，如果予以适当的生长促进剂，就可以降低产品成本。应该加快商品化的研究。 1.2.3成品的形态研究 传统的嗜酸乳杆菌剂型都是液态，目前研究重点几种在冻干型剂型上。已经应用于实践的冻干型剂型其优点是活菌含量高，保存和管理简
13、单，保藏期长，接种方便，不含有酵母、霉菌等杂质。缺点是储存条件要求高，无论液态还是冻干型，都有明显不足。故低成本、方便储存和使用的剂型仍然是今后的主要研究内容。 1.2.4作用机理研究 这是直接关系功能与应用的研究。目前，嗜酸乳杆菌在体内的竞争排斥机理及其影响因素还没有完全清楚，某些预防疾病的机理需要进一步明确。例如，胆固醇同化吸收机理，在菌体死亡后可能被重新释放出，对机体的影响是什么？嗜酸乳杆菌可能会产生过敏，机理与诱发条件是什么[22]？嗜酸乳杆菌是种重要的益生菌，应该加快嗜酸乳杆菌作为保健食品的商品化进程，应该明确对特殊人群的排除，如免疫功能障碍的人（如AIDS感染者）是否可以使用尚
14、待研究。应该加快饲料方面的实用化研究，用于临床的医药品还需进一步探明作用机理，进而通过临床验证方可考虑实际应用。 1.3嗜酸乳杆菌未来研究方向 未来的嗜酸乳杆活菌制剂的发展必然是基础研究与应用相结合，高技术筛选和培育新菌种与嗜酸乳杆菌生长因子的开发相结合，并考虑技术的工业化生产的可行性。随着技术的进步和人们对嗜酸乳杆菌生理功能的认识，嗜酸乳杆菌益生菌必然会为人类的健康发挥越来越大的作用。当前及今后的一段时间中，益生菌的研究将主要集中在： （1） 筛选更具优良性能的益生菌菌株，全面了解某一菌株的生理特性，从不同的角度进行评价，并进行动物模型和人体临床实验的功能验证。 （2） 进一步加强对
15、益生菌作用机理的研究，以指导益生菌制品的研制、生产及使用。 （3） 加强对益生菌剂型的研究，增加益生菌菌株的稳定性。主要是提高活菌的浓度和活菌对不良环境的耐受力、延长产品的保存期，这是目前益生菌研究的一个难点。作为益生菌的菌株，必须具有很高的稳定性，包括耐酸和耐胆盐性等。为使投放的益生菌发挥预期的效力，投放菌必须以较高的活菌数通过胃到达肠道并定居在肠道内增值。然而，即使所投给的益生菌是肠道的固有菌，也很难通过胃部的极端环境而在肠道内定居。这是影响益生菌效果的重要原因之一。因此，应开发多种剂型如粉剂、片剂（胃溶剂和肠溶剂）、颗粒剂及微胶囊剂等，以确保益生菌能顺利通过肠胃道而发挥其益生菌作用。
16、 （4） 开发与各种益生菌因子配合的产品。如寡糖可作为双歧杆菌的促生长因子，但不容易被吸收、热量低，可将寡糖添加到食品中。 （5） 在分子生物学水平上初步研究不同生理功能的菌株质检的差异，深入了解益生菌的作用机制，为采用基因工程技术改造或构建新菌种、培育优良菌株和开发新的益生菌产品奠定理论基础。 1.4存在的问题和本研究的目的和意义 1.4.1存在的问题 1.4.1.1嗜酸乳杆菌制品的有效性 嗜酸乳杆菌益生菌因其广泛而重要的生理功能在保健食品和饲料的开发中具有远大的发展前景，在替代抗生素方面也带来了希望。但是，目前益生菌作用效果、稳定性、有效性均有待于提高。国内于20世纪80年代初开
17、始了活菌制剂方面的研究工作，但目前国内市场上的微生态制剂仍然存在着许多问题，如菌种的真伪、活菌的数量、产物有效成分和耐药因子的有无等。 1.4.1.2细菌素 随着研究的深入，乳酸菌细菌素的应用前景越来越受到人们的广泛关注，然而在细菌素的研究中仍存在许多有待解决的问题，主要体现在： （1） 细菌素的产量普遍较低，目前的研究方向主要集中在筛选高产菌株及构建工程菌株上； （2） 细菌素的抑菌谱普遍较窄，目前报道的细菌素一般只对革兰氏阳性菌有抑制作用，而对革兰氏阴性菌、霉菌和酵母菌没有作用，而且不同种属的抑菌机制尚不十分清楚； （3） 细菌素在不同食品介质中的溶解性和稳定性较差，限制了它们的
18、广泛应用； （4） 评价其应用潜力的工作仍然是以一般性报道为主，尚有待更深入的研究； 因此，在今后的一段时间中，乳酸菌细菌素的研究重点可能会集中在以下几方面： （1） 根据已知蛋白质结构设计全新的氨基酸序列，人工合成新型细菌素或对现有的细菌素进行改造，提高乳酸菌细菌素的应用潜力； （2） 通过修饰编码蛋白质的DNA序列，利用DNA重组技术产生满足人们要求的活性多肽或蛋白质； （3） 提高细菌素产量水平； （4） 拓宽细菌素抑菌谱，改进细菌素溶解性及在靶位系中的扩散性，提高细菌素稳定性； （5） 提高细菌素抑菌比活力； （6） 对细菌素产生菌株的自身免疫性机制进行深入研究。 1
19、4.1.3益生菌的安全性 在未来嗜酸乳杆菌和其他益生菌一样存在安全性问题，在评估时必须考虑以下的因素：致病性、侵染性、毒力因子（包括毒性）、代谢活力及益生菌的生物学特征等。 Donohue和Salmine等认为可采用体外试验、动物试验和临床试验等方法来评估益生菌的安全性，根据这几项指标，少数目前应用的益生菌能满足安全性标准。Marteau则建议研究益生菌的本质特征、药代动力学、与宿主的相互作用等，作为评估其安全性的依据[23]。 1.4.1.3.1致病性和感染性 不存在致病性和感染性是益生菌安全性的前提之一。最近几年，长期被认为不具有感染性的这些乳酸菌和双歧杆菌，不断从临床感染病例被
20、分离到，引发了对其安全性及其是否具有感染性的争议。然而，它们不太可能具有广泛的感染性，这些临床分离到的菌株更像是一些偶然性感染的结果。尽管乳酸菌和双歧杆菌可通过转位或其他方式侵入宿主机体，因其菌血症。但是，内心肌炎或其他感染到败血症的系统性感染的感染过程需要细菌和宿主双方因素的共同参与。然而，要评估这种相互作用涛困难了。因此，在评估益生菌的安全性时，考虑如下的问题可能更切实可行，即考虑对宿主的入侵是否引发严重后果以及入侵后对宿主产生的作用等。 益生菌是否具有感染性危害难以证明，尤其是厌氧菌，通常认为它们不具有感染性，尽管采取口服方式，这些细菌通常不会引起健康动物感染。对于那些具有轻微感染性的
21、益生菌细菌，这一点尤为明显。即使那些具有强感染性的细菌，如果采用单一的种也不容易使动物发生感染，需要采用多种技术（方法）。例如，对试验体系采取各种预处理或使用混合感染的方式，才能使感染建立。通过急性及慢性毒性试验可获得某种细菌毒性的资料。例如，对B.longum BB536而言，其对小鼠的急性（单次口服）半数致死量（LD50）大于50g/kg（或5×1013cfu/kg）；而口服的话，即使按2.5×1011cfu/(kg.d)的方式持续口服一年，也不表现出毒性。 1.4.1.3.2代谢活性 对益生菌的另一眼球是在其代谢过程中不能产生有害的物质。方法之一是检测这些是否会将食物成分或宿主的分泌
22、物转化成不利于宿主的次级有害物。例如，某些肠道细菌在分解食物蛋白时会产生NH3、吲哚、酚及胺等有害物质；尽管尚无有关双歧杆菌或乳酸菌产生毒性极强化合物的报道，但能产生和利用NH3仍然引起人们的关注。 Hraya-Kojima等测定了人源双歧杆菌中与氨的产生和利用有关的酶的活性，与其他的肠道菌群相比，双歧杆菌分解氨基酸产生氨的脱氨酶活性较弱，但同化NH3的能力较强；二次胆盐是肠道菌群产生的另一类重要的有害物质，它们能作用于黏液分泌细胞，促进其增值，因而具有致癌性或者是一种致癌促进剂。许多肠道菌群，包括双歧杆菌和乳杆菌，能分解结合胆酸盐，然而，对多种双歧杆菌（10种），乳酸菌（5种）、Leuco
23、nstoc lactis subsp.Lactis及S.thermophilus研究后发现，它们缺乏脱氨酶基酶活性，而后者正与二次胆盐的产生有关。对于肠球菌而言，已发现它们能产生多种裂解细胞物质及其他毒性因子[24]。 1.4.1.3.3血小板凝聚力 在考虑益生菌安全性时，对血小板的凝聚活力是必须检测的项目之一，由细菌引起的血小板凝聚被认为是引发感染性内心肌炎的主要原因。Harry等测定了从感染性内心肌炎样本分离的Lb.rhamnosus和Lb.paracasei subsp.Paracasei（可能归入Lb.casei）及其实验室保存菌株、Lb.acidophlilus、Lb.fermn
24、tum、Lb.oris、Lb.plantarum和Lb.salivarius的血小板凝聚活力。结果发现，不同的菌株之间对血小板凝聚活性差异非常大。实验室保存的16株Lb.rhamnosus中的8株以及所有从临床感染性内心肌炎样本分离到的5株Lb.rhamnosus都具有血小板凝聚活性，这种凝聚作用与其细胞表面存在的某些蛋白质有关。此外，还测定了这种细胞表面成分的憎水性、吸附羟基磷石灰及唾液凝聚性。与实验室保存菌株相比，从临床感染性内心肌炎分离的Lb.rhamnosus菌株的凝聚活性更高。另外，测定了L.paracasei subsp.Paracasei及其他菌株可能产生的其他毒性因子，如糖苷酶
25、活性及蛋白酶活性（胺化酶），这两种酶分别降解人体内的糖蛋白和阻碍人体内凝血纤维素原的合成并引起其溶解。结果发现，部分菌株可产生这些酶，表明它们具有潜在的侵染性，可能引起内心肌炎。 1.4.1.3.4黏膜降解活力 Ruseler等对多株乳杆菌及双歧杆菌降解肠道黏膜糖蛋白的酶的活力进行了测定，结果未发现这些菌株具有此类活性。不过在研究益生菌安全性时，仍需要更深入地研究前面所提及的细胞表面成分及酶的作用。无论是这种主要由表面蛋白、糖蛋白和凝聚素组成的细胞表面结构是否与其感染性有关，还是前面所提及的糖苷酶、蛋白酶活性（胺化酶）及其他能降解人肠道黏膜的酶是否与其感染性有关，仍有待进一步阐明。如果这种
26、联系被证明确实存在，那么目前被认为是益生菌必要特征的对人肠道细胞的粘附性，就需要慎重考虑了。 1.4.1.3.5益生菌的抗药性 抗药性乳酸菌已不断被分离到并引起广泛关注，尤其是对于肠球菌，许多肠球菌菌株，包括那些从感染部位分离的菌株，已被证明具有多重抗药性。这种抗药性可能是通过与药物的接触产生，也可能通过被其他抗药菌株转化产生。已报道双歧杆菌和乳酸菌可通过与药物的接触产生抗药性。为了防止向体内土著菌群传递或转移其抗药性，除某些特定目的外，所使用的益生菌原则上不应携带超出自然获得的抗药谱以外的抗药性。 1.4.2本研究的目的与意义 本研究以普通培养基为对照，对嗜酸乳杆菌培养基碳源，氮源，
27、缓冲盐，微量元素，增值因子各组成成分的优化，以及静态培养条件的优化，最后确定最优培养基的组成成分，以此培养基来进行生长动力学的研究，为增加保健食品活菌数，以此来提高国民生活质量提供一个可靠的参考依据。 2 材料与方法 2.1 材料试剂与仪器设备 2.1.1 原料和试剂 发酵菌种：嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。（由广西工学院生物与化学工程系微生物实验室提供） 表2-1实验主要试剂 试剂名称 规格 生产厂商 琼脂粉 大豆蛋白胨 细菌学蛋白胨 酵母浸膏 牛肉浸膏 葡萄糖 磷酸氢二钾 盐酸 蔗糖 氯化钠 柠檬酸三铵 三水
28、合乙酸钠 酒精 硫酸锰 硫酸镁 蛋白胨，鱼粉 D-果糖 乳糖 吐温-80 营养琼脂 麦芽糖 邻苯二甲酸氢钾 月示蛋白胨 胰蛋白胨 酪氨酸 氢氧化钠 酪蛋白胨 L-谷氨酸,L-Glutamic aicd D-泛酸钙 盐酸硫胺维生素B1 核黄素维生素B2 低聚果糖 蛋氨酸 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯
29、 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 广东环凯微生物科技有限公司 广东环凯微生物科技有限公司 广东环凯微生物科技有限公司 广东环凯微生物科技有限公司 广东环凯微生物科技有限公司 天津市科密欧化学试剂有限公司 广东汕头市西陇化工厂 广东汕头市西陇化工厂 广东汕头市西陇化工厂 广东汕头市西陇化工厂 广东台山粤侨试剂塑料有限公司 广东台山粤侨试剂塑料有限公司 广东台山粤侨试剂塑料有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海试剂二厂 广东环凯微生物科技有限公司 广东汕头市西陇化工厂
30、上海润捷化学试剂有限公司 山东隆大生物工程有限公司 上海康润生物科技有限公司 上海康润生物科技有限公司 生工生物工程（上海）有限公司 广东化学试剂工程技术研究开发中心 上海源吐生物科技有限公司 天津市博迪化工有限公司 天津市博迪化工有限公司 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 2.1.2 实验主要仪器 表2-2实验主要仪器、设备 设备名称 型号 生产厂商 水浴恒温箱 电子天平 电子分析天平 光栅分光光度计 双目生物显微镜 实验室PH计 垂直流超净工作台 干燥箱 生化培养箱 恒温培养振荡器 电冰箱 立式压力蒸汽消毒器 数码显微镜
31、 ZHWY—110X T—200 AB104—N 722 E220LED PHS—25 ZHJH-1112C 101—3型 ZSP1270 ZHWH—2112C 13C—127TW 银州牌628B—2型 DM85 上海智城分析仪器制造有限公司 美国双杰兄弟（集团）有限公司 Mettier—Toledo Group 上海精密科学仪器有限公司 麦克奥迪实业集团有限公司 上海理达仪器厂 上海智城分析仪器制造有限公司 中华人民共和国上海市实验仪器总厂 上海智城分析仪器制造有限公司 上海智城分析仪器制造有限公司 柳州市鸿沛电器有限公司 铁岭市医疗器械总厂
32、 克奥迪实业集团有限公司 京君龙实验仪器有限公司 试管规格：15X150 18X180 17X180 小试管 移液管 1ml、2ml、5ml、10ml 移液枪 1ml、5ml 载玻片、剪刀、鼻塞比色管、烧杯、玻璃棒、标签、三角瓶、培养皿ＰＨ试纸。 2.2 实验方法 2.2.1发酵菌种的活化[25] （1）MRS培养基配制：大豆蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g、吐温80 1g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、柠檬三铵2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.54g，加蒸馏水至1000mL，1N HCl调PH为6.2-6.4，121℃15分钟灭菌。 （2）活化方法：
33、将斜面保藏菌种接种于10 mL 10％的脱脂乳试管中进行三次活化，然后按体积比2％的接种量接种于MRS液体培养基中，以适应菌株在培养基中生长，活化好的菌株放于4℃冰箱中，备用。每次测定前，各菌株均在MRS液体培养基中转接两次，以便菌株活力得到恢复。 2.2.2培养基碳、氮源的优化 为确定嗜酸乳杆菌最高活菌数时间，以便下面实验进程，配制普通MRS培养基1000ml，1N HCl调PH为6.2-6.4，用100ml量筒分装到250ml的三角锥形瓶当中，包扎好进行高温灭菌（121℃20分钟灭菌），将制备好的培养基置于37℃恒温培养24h，若无菌生长，即为合格。取1瓶培养基出来，在垂直流超净工作台
34、按4%的接种量接种，分装到密封小试管当中，每管分装5ml，放到37℃恒温箱培养，计时培养，每隔两小时测定一次吸光度。 在MRS培养基的基础上采用各种不同的碳源和氮源分别取代MRS中的碳源和氮源（用量分别为2%）配制培养基，接种菌种发酵，根据菌体生长情况（以菌体密度为指标，下同）判断碳源和氮源的优劣。优选的碳源或氮源之间的复合效果采用复合配比实验确定最佳复合氮源或氮源。可选的碳源有：海藻糖、蔗糖、淀粉、麦芽糖、果糖、乳糖、低聚果糖。可选的氮源有： 2.2.3培养基不同碳氮源之间搭配的优化 固定盐溶液的量，对选出的碳源及氮源进行正交实验，确定最优碳氮源之比。由前面优化的碳源及氮源结果来看，碳
35、源选出三种，分别为乳糖，葡萄糖和果糖，氮源也选出三种，分别是大豆蛋白胨代替牛肉膏，胰蛋白胨代替药理学蛋白胨和大豆蛋白胨代替药理学蛋白胨，实验结果如下： 2.2.4培养基增值因子的优化 在普通培养基基础上，添加不同的生长因子(包括多种氨基酸和维生素等)，接种发酵，根据菌体生长情况，确定微量元素及生长因子的作用。添加的生长因子分别为维生素B1，维生素B5，谷氨酸，以及蛋氨酸。实验结果如表2-6 2.2.5培养基静态培养条件的优化 在试管瓶中，普通培养基为研究基础一设置不同温度、接种量，以OD为指标反映菌体增殖情况，并选出优化条件。 2.2.5.1培养温度的筛选 将100 ml的MR
36、S液体培养基中接人4．0％的菌液，分别于35、37、39℃下恒温培养，以OD值为指标反映菌体增值情况，并选出优化条件。 2.2.5.2接种量的确定 按2、4、6％接种量接活化菌液，39℃下静置培养，测定OD值。 2.2.6菌液吸光值（OD600）的测定 用721#分光光度计在600nm条件下比色，测定菌液的吸光值。 2.2.7菌液pH值的测定 用PHS—25型精密pH计在室温下测定pH值。 操作步骤 开机前的准备 a） 将电极梗旋入电极梗固定座中； b） 将电极夹插入电极梗中； c） 将pH复合电极安装在电极夹上； d） 将 E-201-C型pH复合电极下端的电极保护套
37、套拔下，并且拉下电极上端的橡皮套使其露出上端小孔； e) 用蒸馏水清洗电极。 2.2.7.1仪器的标定 仪器使用前首先要标定。一般情况下仪器在连续使用时, 每天要标定一次。 a) 将测量电极插座处拔掉Q9短路插头； b) 在测量电极插座处插入复合电极； c) 打开电源开关，仪器进入pH测量状态； d) 按“温度”键，使仪器进入溶液温度调节状态（此时温度单位℃指示），按“△”键或“▽”键调节温度显示数值上升或下降，使温度显示值和溶液温度一致，然后按“确认
38、键，仪器确认溶液温度值后回到pH测量状态(温度设置键在mV测量状态下不起作用)； e) 按“标定”键，此时显示 “标定1”“4.00”及“mV”， 把用蒸馏水或去离子水清洗过的电极插入pH＝4.00的标准缓冲溶液中，仪器显示实测的mV值，待mV读数稳定后按“确认”键，仪器显示“标定2”“9.18”及“mV”，把用蒸馏水或去离子水清洗过的电极插入pH＝9.18的标准缓冲溶液中，仪器显示实测的mV值，待mV读数稳定后按“确认”键,标定结束，仪器显示“测量”进入测量状态。 注：仪器在标定状态下，可通过按“△”键选择三种标准缓冲溶液中的任意二种（pH=4.00、pH=6.86 、pH=9.
39、18）作为标定液（选定的标准缓冲溶液会在温度显示位置显示出来）标定方法同上，第一种溶液标定好后仍须按“△”键选定第二种标准缓冲溶液。 f） 用蒸馏水及被测溶液清洗电极后即可对被测溶液进行测量。一般情况下，在24h内仪器不需再标定。 2.2.7.2测量 pH值 经标定过的仪器，即可用来测量被测溶液，根据被测溶液与标定溶液温度是否相同，其测量步骤也有所不同。具体操作步骤如下： ( l ) 被测溶液与标定溶液温度相同时，测量步聚如下： a) 用蒸馏水清洗电极头部，再用被测溶液清洗一次： b) 把电极浸入被测溶液中，用玻璃棒搅拌溶液，使其均匀，在显示屏上读出溶液的 pH
40、值。 ( 2 ) 被测溶液和标定溶液温度不同时，测量步骤如下： a) 用蒸馏水清洗电极头部，再用被测溶液清洗一次； b) 用温度计测出被测溶液的温度值； c) 按“温度” 键，使仪器进入溶液温度设置状态（此时“℃”温度单位指示），按“△”键或“▽”键调节温度显示数值上升或下降，使温度显示值和被测溶液温度值一致，然后按“确认”键，仪器确定溶液温度后回到pH测量状态。 d) 把电极插入被测溶液内， 用玻璃棒搅拌溶液， 使其均匀后读出该溶液的pH值。 2.2.7.3缓冲溶液的配制方法 1． pH4.00溶液：用GR邻苯二甲酸氢钾10.12g，溶解于1000ml的高纯去离子水中
41、 2． pH6.86溶液：用GR磷酸二氢钾3.387g、GR磷酸氢二钠3.533g，溶解于1000mL的高纯去离子水中。 3. pH9.18溶液：用GR硼砂3.80g、溶解于1000mL的高纯去离子水中。 注意：配制2、3溶液所用的水，应预先煮沸（15~30）min，除去溶解的二氧化碳。在冷却过程中应避免与空气接触，以防止二氧化碳的污染。 2.2.8菌液滴定酸度（°T）的测定 NaOH滴定法，按GB5409-89方法测定。 （1）NaOH溶液的标定 准确称取基准邻苯二
42、甲酸氢钾0.4-0.5g之间的质量→用大约25ml水溶解于锥形瓶内→加2滴酚酞指示剂（无色）→用配置好的NaOH溶液滴定邻苯二甲酸氢钾溶液→粉红色30s不褪停止滴定→记录所用NaOH溶液的体积（滴定时右手摇动锥形瓶，左手控制碱式滴定管，边滴边观察滴定管的刻度防止NaOH溶液用尽。平行标定2次） 1 2 邻苯二甲酸氢钾质/g 0.3028 0.3024 消耗NaOH体积/mL 16.34 16.30 NaOH浓度/(mol/L) 0.09074 0.09084 平均值/ mol/L 0.09079 （2）1%酚酞指示剂 称取酚酞1g溶解于100ml95%乙醇中。
43、变色范围pH（8.2-10.0）。 （3）测定 滴定用移液枪吸取菌液5ml，注入三角瓶中，加入45ml的蒸馏水，加入酚酞指示剂3-5滴。用0.09079 mol/L的NaOH溶液滴定至浅（微）红色且30秒不褪色。记录消耗的NaOH量。 2.2.9菌落计数 （一）样品的处理和稀释： 1．操作方法：以无菌操作取菌液1ml，放于9mL灭菌生理盐水试管内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理
44、盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。2．无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。 操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均
45、匀稀释液。 4．样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。为减少稀释误差，SN标准采用取10mL稀释液，注入90mL缓冲液中。5．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。 （二）倾注培养 1．操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制
46、10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。2．倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太
47、薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。3．为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。4．培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％。5．为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培
48、养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。注意事项：（1）操作要快而准，包括材料、加样、倒培养基。（2）吸液体时液体不能进入吸头。（3）样品稀释时一定要混匀。（4）倒培养基前，瓶口要过火焰。（5）一定要有空白对照。（6）培养基温度控制，培养基薄厚。（7）检测时一定要使平皿完全暴露于空气中。 （三）计数和报告 1．操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原
49、始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。 2．到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。 3．计数时应选取菌落数在30~300之间的平板（SN标准要求为25~250个菌落），若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。 4．若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30
50、但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。 5．不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。 6．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要
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