仪器分析高效液相色谱.ppt

高高速速：HPLC采采用用高高压输液液设备，流流速速大大增增加加，分分析析速速度度极极快快，只只需需数数分分钟；而而经典典方方法法靠靠重重力加料，完成一次分析需力加料，完成一次分析需时数小数小时。高高效效：填填充充物物颗粒粒极极细且且规则，固固定定相相涂涂渍均均匀匀、传质阻阻力力小小，因因而而柱柱效效很很高高。可可以以在在数数分分钟内完成数百种物内完成数百种物质的分离。的分离。高高灵灵敏敏度度：检测器器灵灵敏敏度度极极高高：UV10-9g,荧光光检测器器10-11g。1 1高效液相色高效液相色谱法与法与经典液相色典液相色谱法法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。经经典典典典LCLCHPLCHPLC柱之内径柱之内径柱之内径柱之内径15cm15cm0.4cm0.4cm长长度度度度50100cm50100cm1550cm1550cm填充材料粒度填充材料粒度填充材料粒度填充材料粒度150m200m 150m200m 4m10m4m10m使用使用使用使用压压力力力力110atm110atm50200atm50200atm分离分离分离分离时间时间0.5h0.5h天天天天10min10min例例:分分离离苯苯的的羟基基化化合合物物，7个个组分分只只需需1min就就可可完完成成。对氨氨基基酸酸分分离离，用用经典典色色谱法法，柱柱长约170cm，柱柱径径0.9cm，流流动相相速速度度为30cm3h-1，需需用用20多多小小时才才能能分分离离出出20种种氨氨基基酸酸；而而用用高高效效液液相相色色谱法法，只只需需lh之之内内即即可完成。可完成。2024/5/21 周二1.2 2高效液相色高效液相色谱法与气相色法与气相色谱法法（l l）气相色）气相色谱法分析法分析对象只限于分析气体和沸点象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它低的化合物，它们仅占占有机物有机物总数的数的2020。对于占有机物于占有机物总数近数近8080的那些高沸点、的那些高沸点、热稳定定性差、摩性差、摩尔质量大的物量大的物质，目前主要采用高效液相色，目前主要采用高效液相色谱法法进行分离和分析。行分离和分析。(2)(2)气气相相色色谱采采用用流流动相相是是惰惰性性气气体体，它它对组分分没没有有亲和和力力，即即不不产生生相相互互作作用用力力，仅起起运运载作作用用。而而高高效效液液相相色色谱法法中中流流动相相可可选用用不不同同极极性性的的液液体体，选择余余地地大大，它它对组分分可可产生生一一定定亲和和力力，并并参参与与固固定定相相对组分分作作用用的的剧烈烈竞争争。因因此此，流流动相相对分分离离起起很很大大作作用用，相相当当于于增增加加了了一一个个控控制和改制和改进分离条件的参数分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。最佳分离条件提供了极大方便。(3)(3)气气相相色色谱一一般般都都在在较高高温温度度下下进行行的的，而而高高效效液液相相色色谱法法则经常常可可在在室温条件室温条件下工作下工作。P296从色从色谱分析的分析的发展来看，展来看，HPLC比比GC更更为有用、更具有用、更具发展前途展前途2024/5/21 周二2.总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。1 1、样品不必气化品不必气化2 2 2 2、分离温度低、分离温度低、分离温度低、分离温度低3 3 3 3、选择选择性好性好性好性好4 4 4 4、样样品回收容易品回收容易品回收容易品回收容易5 5 5 5、分离效果好、分离效果好、分离效果好、分离效果好 塔板数达到塔板数达到104 105/m6、采用高采用高采用高采用高压输压输液液液液泵泵，高效微粒固定相和高灵敏度，高效微粒固定相和高灵敏度，高效微粒固定相和高灵敏度，高效微粒固定相和高灵敏度检测检测器器器器 7、仪器器设备费用昂用昂贵，操作，操作严格。格。3.HPLC的特点的特点2024/5/21 周二3.广广义地地讲，除柱色，除柱色谱外，薄外，薄层色色谱（液（液固色固色谱）和）和纸色色谱（液（液液液色色谱）也属于）也属于LC。狭狭义的的LC指柱色指柱色谱。按分离机理，柱色。按分离机理，柱色谱法可分法可分为液液固吸附色固吸附色谱、液液液分配色液分配色谱、键合相色合相色谱、离子色、离子色谱等等。6.1 HPLC的主要的主要类型及型及选择2024/5/21 周二4.6.1.1液液固吸附色固吸附色谱法法 液液-固吸附色固吸附色谱是以固体吸附是以固体吸附剂作作为固定相，吸附固定相，吸附剂通常是些多通常是些多孔的固体孔的固体颗粒物粒物质（如硅胶、氧化（如硅胶、氧化铝等）等），在它，在它们的表面存在吸附中的表面存在吸附中心。液固色心。液固色谱实质是根据物是根据物质在固定相上的吸附作用不同来在固定相上的吸附作用不同来进行分离行分离的。的。1分离原理分离原理 当当流流动相相通通过固固定定相相（吸吸附附剂）时，吸吸附附剂表表面面的的活活性性中中心心就就要要吸吸附附流流动相相分分子子。同同时，当当试样分分子子（X）被被流流动相相带入入柱柱内内，只只要要它它们在在固固定定相相有有一一定定程程度度的的保保留留就就要要取取代代数数目目相相当当的的已已被被吸吸附附的的流流动相溶相溶剂，于是，在固定相表面，于是，在固定相表面发生生竞争吸附争吸附:X+nSad=Xad+nS达平衡达平衡时,有有 其中其中Kad为吸附平衡常数，吸附平衡常数，值大表示大表示组分在吸附分在吸附剂上保留上保留强，难于洗于洗脱。脱。Kad值小小,则保留保留值弱，易于洗脱。弱，易于洗脱。试样中各中各组分据此得以分离。分据此得以分离。2024/5/21 周二5.2.固定相固定相 液液-固固吸吸附附色色谱所所用用固固定定相相多多是是一一些些吸吸附附活活性性强弱弱不不等等的的吸吸附附剂，如如硅硅胶胶、氧氧化化铝、聚聚酸酸胶胶等等。由由于于硅硅胶胶的的优点点较多多，如如线性性容容量量较高高，机机械械性性能能好好，不不溶溶胀，与与大大多多数数试样不不发生生化化学学反反应等等，因此，以硅胶用得最多。因此，以硅胶用得最多。3.流流动相相 把把吸吸附附色色谱中中流流动相相称称作作洗洗脱脱剂。在在吸吸附附色色谱中中对极极性性大大的的试样往往往往采采用用极极性性强的的洗洗脱脱剂；对极极性性弱弱的的试样宜宜用用极极性性弱弱的的洗洗脱脱剂。洗洗脱脱剂的的极极性性强弱弱可可用用溶溶剂强度度参参数数（0）来来衡衡量量。0越越大大，表表示示洗洗脱脱剂的极性越的极性越强。2024/5/21 周二6.在在液液-液液色色谱中中，流流动相相和和固固定定相相都都是是液液体体，它它能能适适用用于于各各种种样品品类型型的的分分离离和和分分析析，无无论是是极极性性的的和和非非极极性性的的，水水溶溶性性和和油油溶溶性性的的，离离子子型型的的和和非非离子型的化合物。离子型的化合物。1.分离原理分离原理 液液分配色液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物都是根据物质在两种互在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色所不同的是液液色谱的分配是在柱中的分配是在柱中进行的，使行的，使这种分配平衡可反复多次种分配平衡可反复多次进行，造成各行，造成各组分的差分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。分。6.1.2液液-液分配色液分配色谱法法 2.固定相固定相 为了了更更好好解解决决固固定定液液在在载体体上上流流失失问题。产生生了了化化学学键合合固固定定相相。它它是是将将各各种种不不同同有有机机基基团通通过化化学学反反应键合合到到载体体表表面面的的一一种种方方法法。它它代代替替了了固固定定液液的的机机械械涂涂渍，因因此此它它的的产生生对液液相相色色谱法法迅迅速速发展展起起着着重重大大作作用用，可可以以认为它它的的出出现是是液液相相色色谱法法的的一一个个重重大大突突破破。最最常常用用的的强极极性性固固定定液液,-氧氧二二丙丙睛睛，中中等等极极性性的的聚聚乙乙二醇，非极性的角二醇，非极性的角鲨烷等。等。2024/5/21 周二7.3流流动相相 在液液色在液液色谱中中为了避免固定液的流失，了避免固定液的流失，对流流动相的一个基本要求相的一个基本要求是流是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差相与固定相的极性差别越越显著越好。著越好。根据所使用的流根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色正相分配色谱和反相分配色和反相分配色谱。如如果果采采用用流流动相相的的极极性性小小于于固固定定相相的的极极性性，称称为正正相相分分配配色色谱，它它适适用用于于极极性性化化合合物物的的分分离离。其其流流出出顺序序是是极极性性小小的的先先流流出出，极极性性大大的后流出。的后流出。如如果果采采用用流流动相相的的极极性性大大于于固固定定相相的的极极性性，称称为反反相相分分配配色色谱，它它适用于非极性化合物的分离适用于非极性化合物的分离，其流出，其流出顺序与正相色序与正相色谱恰好相反。恰好相反。2024/5/21 周二8.正相色谱法 反相色谱法 1.极性固定相 聚乙二醇、氨基与腈基键合相 2.相对非极性流动相 正已烷、环已烷 3.极性调节剂 乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷 4.分离中等极性和极性较强化合物.酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 5.组分流出顺序 极性小先洗出 1.非极性固定相 C18（简称ODS）、C8 2.极性流动相 水或缓冲液 3.极性调节剂 甲醇、乙腈、四氢呋喃4.分离非极性和极性较弱化合物 占整个HPLC应用的80%左右 5.组分流出顺序 极性大先洗出 液液分配色谱2024/5/21 周二9.6.1.3化学键合相色谱法采采用用化化学学键合合相相的的液液相相色色谱称称为化化学学键合合相相色色谱法法，简称称键合合相相色色谱。由由于于键合合固固定定相相非非常常稳定定，在在使使用用中中不不易易流流失失，适适用用于于梯梯度度淋淋洗洗，特特别适适用用于于分分离离容容量量因因子子k k值范范围宽的的样品品。由由于于键合合到到载体体表表面的官能面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多繁多样品的分离。品的分离。用来制用来制备键合固定相的合固定相的载体体(基体），几乎都用基体），几乎都用硅胶硅胶。键合相色谱的最大优点是：通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）。2024/5/21 周二10.键合合在在硅硅胶胶表表面面的的非非极极性性或或弱弱极极性性基基团具具有有较强的的疏疏水水特特性性，当当用用极极性性溶溶剂为流流动相相来来分分离离含含有有极性官能极性官能团的有机化合物的有机化合物时：3.被被分分离离物物极极性性部部分分受受到到极极性性流流动相相的的作作用用（或或流流动相相极极性性减减小小时），这种种疏疏溶溶剂斥斥力力下下降降，会会发生生解解缔，并并把把溶溶质分分子子释放放而而被被洗洗脱脱下下来来，促促使使它它离离开开固固定相。定相。显然然，键合合固固定定相相对每每一一种种溶溶质分分子子缔合合和和解解缔能能力力的的差差异异，决决定定了了溶溶质分子在色分子在色谱分离分离过程中的保留程中的保留值。1、溶溶质分分子子进入入极极性性流流动相相后后，即即占占据据流流动相中相相中相应的空的空间，而排，而排挤一部分溶一部分溶剂分子；分子；2、当当溶溶质分分子子被被流流动相相推推动和和固固定定相相接接触触时，溶溶质分分子子的的非非极极性性部部分分(或或非非极极性性分分子子）会会将将非非极极性性固固定定相相上上附附着着的的溶溶剂膜膜排排挤开开，直直接接和和非非极极性性固固定定相相上上的的烷基基官官能能团相相结合合形形成成缔合合物物，构成吸附构成吸附层，保留在固定相中；，保留在固定相中；2024/5/21 周二11.2024/5/21 周二12.6.1.4 凝胶色凝胶色谱法法凝胶色凝胶色谱又称分子排阻色又称分子排阻色谱法法主主要要用用于于较大大分分子子的的分分离离。与与其其他他液液相相色色谱方方法法原原理理不不同同，它它不不具具有有吸吸附附、分分配配和和离离子子交交换作作用用机机理理，而而是是基基于于试样分分子子的的尺尺寸寸和和形形状状不不同同来来实现分离的。分离的。尺寸排阻色尺寸排阻色谱被广泛被广泛应用于大分子的分用于大分子的分级，即用来分析大分子物，即用来分析大分子物质相相对分子分子质量的分布。量的分布。它具有其他液相色它具有其他液相色谱所没有的特点：所没有的特点：（1 1）保留）保留时间是分子尺寸的函数，是分子尺寸的函数，有可能提供分子有可能提供分子结构的某些信息。构的某些信息。(2)(2)保留保留时间短，短，谱峰窄，易峰窄，易检测，可采，可采用灵敏度用灵敏度较低的低的检测器（器（3 3）固定相与分子）固定相与分子间作用力极弱，作用力极弱，趋于零。由于柱于零。由于柱子不能很子不能很强保留分子，因此柱寿命保留分子，因此柱寿命长。（。（4 4）不能分辨分子大小相近的化合）不能分辨分子大小相近的化合物，相物，相对分子分子质量差量差别必必须大于大于1010才能得以分离。才能得以分离。2024/5/21 周二13.以凝胶以凝胶(gel)为固定相，它固定相，它类似于分子似于分子筛，但凝胶的孔径比分子但凝胶的孔径比分子筛要大得多。要大得多。凝胶内具有一定大小的孔穴，凝胶内具有一定大小的孔穴，小分子量小分子量的化合物可以的化合物可以进入孔中，滞留入孔中，滞留时间长；中等中等体体积的分子部分渗透；的分子部分渗透；大分子量的化合物不大分子量的化合物不能能进入孔中，直接随流入孔中，直接随流动相流出。相流出。样品分子基本上按其分子大小，排阻先品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。后由柱中流出。常用于分离高分子化合物，如常用于分离高分子化合物，如组织提取提取物、多物、多肽、蛋白、蛋白质、核酸等。、核酸等。分离原理分离原理 尺尺寸寸排排阻阻色色谱是是按按分分子子大大小小顺序序进行行分分离离的一种色的一种色谱方法。方法。2024/5/21 周二14.6.1.4亲和色谱法亲和和色色谱是是利利用用生生物物大大分分子子和和固固定定相相表表面面存存在在某某种种特特异异性性亲和和力力，进行行选择性性分分离离的的一一种种方方法法。它它通通常常是是在在载体体（无无机机或或有有机机填填料料）表表面面先先键合合一一种种具具有有一一般般反反应性性能能的的所所谓间隔隔臂臂（如如环氧氧、联氨氨等等）；随随后后，再再连接接上上配配基基（酶、抗抗原原或或激素等）。激素等）。这种种固固载化化的的配配基基将将只只能能和和具具有有亲和和力力特特性性吸吸附附的的生生物物大大分分子子相相互互作作用用而而被被保保留留，没没有有这种种作作用用的的分分子不被保留。子不被保留。2024/5/21 周二15.离子交换色谱法固定相:离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基 阳离子交换树脂在表面未端芳环上接上季胺基 阴离子交换树脂流动相：电解质溶液、有机弱酸或有机弱酸盐溶液6.1.6 6.1.6 离子交离子交换色色谱法法2024/5/21 周二16.离子交离子交换色色谱法法分离原理分离原理 树脂上可脂上可电离离子与流离离子与流动相中具有相同相中具有相同电荷的离子及被荷的离子及被测组分的分的 离子离子进行可逆交行可逆交换而分离。而分离。应用用 离子交离子交换色色谱法主要用于分析阴，阳离子，法主要用于分析阴，阳离子，凡是在溶凡是在溶剂中能中能够电离离 的物的物质通常都可以用离子交通常都可以用离子交换色色谱法来法来进行分离。行分离。分析物分析物质 有机酸、氨基酸、多有机酸、氨基酸、多肽及核酸。及核酸。离子交离子交换色色谱法分离机理法分离机理2024/5/21 周二17.6.1.5分离分离类型的型的选择 1 1根据相根据相对分子分子质量量选择 相相对分子分子质量十分低的量十分低的样品，其品，其挥发性好，适用于气相色性好，适用于气相色谱。标准液相色准液相色谱类型（液一固、液一液、及离子交型（液一固、液一液、及离子交换色色谱）最适合的相）最适合的相对分子分子质量范量范围是是20O20O20002000。对于相于相对分子分子质量大于量大于20002000的的样品，品，则用尺寸排阻法用尺寸排阻法为最佳。最佳。2 2根据溶解度根据溶解度选择 弄弄清清样品品在在水水、异异辛辛烷、苯苯、四四氯化化碳碳、异异丙丙醇醇中中的的溶溶解解度度是是很很有有用用的的。如如果果样品品可可溶溶于于水水并并属属于于能能离离解解物物质，以以采采用用离离子子交交换色色谱为佳佳；如如样品品可可溶溶于于烃类（如如苯苯或或异异辛辛烷），则可可采采用用液液一一固固吸吸附附色色谱；如如样品品溶溶解解于于四四氯化化碳碳，则多多采采用用常常规的的分分配配和和吸吸附附色色谱分分离离；如如样品品既既溶溶于于水水又又溶溶于于异异丙丙醇醇时，常常用用水水和和异异丙醇的混合液作液一液分配色丙醇的混合液作液一液分配色谱的流的流动相，以憎水性化合物作固定相。相，以憎水性化合物作固定相。3根据分子根据分子结构构选择 用用红外光外光谱法，可法，可预先先简单地判断地判断样品中存在什么官能品中存在什么官能团。然后，确定采用。然后，确定采用什么方法合适。例如，酸、碱化合物用离子交什么方法合适。例如，酸、碱化合物用离子交换色色谱；脂肪族或芳香族用液一液；脂肪族或芳香族用液一液分配色分配色谱、液一固吸附色、液一固吸附色谱；异构体用液一固吸附色；异构体用液一固吸附色谱；同系物不同官能；同系物不同官能团及及强氢键的用液一液分配色的用液一液分配色谱。2024/5/21 周二18.色谱类型选择2024/5/21 周二19.6.2 高效液相色高效液相色谱仪6.2.1基本构成和工作基本构成和工作过程程 1.1.基本构成基本构成高效液相色高效液相色谱仪的的结构示意构示意见，一般可分，一般可分为5 5个主要部分：个主要部分：高高压输液系液系统、进样器、色器、色谱柱、柱、检测器和工作站（数据器和工作站（数据处理系理系统）。此外此外还配有配有辅助装置助装置：如梯度淋洗，自如梯度淋洗，自动进样等。等。2.2.工作工作过程程其工作其工作过程如下：程如下：高高压输液液泵将将储液器中的流液器中的流动相以相以稳定的流速（或定的流速（或压力）力）输送到分析系送到分析系统，在色，在色谱柱之前通柱之前通过进样器将器将样品品导入，流入，流动相将相将样品依次品依次带入入预柱、色柱、色谱柱，在色柱，在色谱柱中各柱中各组分被分离，并依次随流分被分离，并依次随流动相流至相流至检测器，器，检测器的信号送至工作站器的信号送至工作站记录、处理和保存，理和保存，由此得到液相色由此得到液相色谱图。2024/5/21 周二20.高高压泵流流动相相溶溶剂废液液色色谱柱柱进样口口检测器器2024/5/21 周二21.1高高压输液系液系统 由于高效液相色由于高效液相色谱所用固定相所用固定相颗粒极粒极细，因此，因此对流流动相阻力很大，相阻力很大，为使流使流动相相较快流快流动，必，必须配配备有高有高压输液系液系统。它是高效液相色。它是高效液相色谱仪最重要最重要的部件，一般由的部件，一般由储液罐、高液罐、高压输液液泵、过滤器、梯度洗脱装置器、梯度洗脱装置等等组成，其中成，其中高高压输液液泵是核心部件。是核心部件。6.2.2 仪器基本器基本结构构 p 贮液器液器材材质：玻璃、不：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK）容容积：0.52.0L 放置位置：高于放置位置：高于泵体，保持一定的体，保持一定的输液静液静压差差 注意：密封、注意：密封、过滤2024/5/21 周二22.p高高压输液液泵 要求：要求：泵体材料能耐化学腐体材料能耐化学腐蚀；能在高；能在高压（3060MPa）下）下连续工工作；作；输出流量出流量稳定（定（1%），无脉冲，重复性高（），无脉冲，重复性高（0.5%），而且），而且输出流量范出流量范围宽；适用于梯度洗脱。；适用于梯度洗脱。类型：一般可分型：一般可分为恒恒压泵和和恒流恒流泵两大两大类 恒恒流流泵特特点点是是在在一一定定操操作作条条件件下下，输出出流流量量保保持持恒恒定定而而与与色色谱柱柱引引起起阻阻力力变化化无无关关；恒恒压泵是是指指能能保保持持输出出压力力恒恒定定，但但其其流流量量则随随色色谱系系统阻阻力力而而变化，故保留化，故保留时间的重的重视性差。目前恒流性差。目前恒流泵正逐正逐渐取代恒取代恒压泵。2024/5/21 周二23.p梯度洗脱装置梯度洗脱装置梯梯度度洗洗脱脱装装置置类似似于于GC中中的的程程序序升升温温。已已成成为现代代高高效效液液相相色色谱中中部缺少的部分。部缺少的部分。作作用用是是使使保保留留值相相差差很很大大的的多多种种组分分在在合合理理的的时间内内全全部部洗洗脱脱并并达达到到相相互互分分离离。所所谓梯梯度度洗洗脱脱，就就是是载液液中中含含有有两两种种（或或更更多多）不不同同极极性性的的溶溶剂，在在分分离离过程程中中按按一一定定的的程程序序连续改改变载液液中中溶溶剂的的配配比比和和极极性性，通通过载液液中中极极性性的的变化化来来改改变被被分分离离组分分的的分分离离因因素素，以以提提高高分分离离效效果果。它它可可以分以分为两种：两种：低低压梯梯度度（也也叫叫外外梯梯度度）：在在常常压下下，预先先按按一一定定程程序序将将两两种种或或多多种不同极性的溶种不同极性的溶剂混合后，再用一台高混合后，再用一台高压泵输入色入色谱柱。柱。高高压梯梯度度(或或称称内内梯梯度度系系统)：利利用用两两台台高高压输液液泵，将将两两种种不不同同极性的溶极性的溶剂按按设定的比例送入梯度混合室，混合后，定的比例送入梯度混合室，混合后，进入色入色谱柱。柱。2024/5/21 周二24.梯度洗脱装置梯度洗脱装置 低低压梯度梯度 高高压梯度梯度 通通过改改变流流动相的相的组成来成来调整整组分的分的k k值，改，改变分离因子分离因子值，以达到最，以达到最短短时间内得到最佳分离的目的。内得到最佳分离的目的。梯度洗脱梯度洗脱2024/5/21 周二25.等度洗脱与梯度洗脱等度洗脱与梯度洗脱2024/5/21 周二26.梯度洗脱梯度洗脱的特点的特点改善分离改善分离,加快分析速度；加快分析速度；改善峰形改善峰形,减少拖尾减少拖尾;可能引起可能引起基基线漂移漂移分配比分配比变化范化范围宽的的复复杂样品品应采取采取梯度洗脱方式分离梯度洗脱方式分离2024/5/21 周二27.2进样系统高效液相色高效液相色谱柱比气相色柱比气相色谱柱短得多（柱短得多（约530cm），所以柱外展），所以柱外展宽（又称柱外效（又称柱外效应）较突出。柱外展突出。柱外展宽是指色是指色谱柱外的因素所引起的峰展柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括，主要包括进样系系统、连接管道及接管道及检测器中存在死体器中存在死体积。柱外展。柱外展宽可可分柱前和柱后展分柱前和柱后展宽。进样系系统是引起往前展是引起往前展宽的主要因素，因此高效液的主要因素，因此高效液相色相色谱法中法中对进样技技术要求要求较严。p 液相色液相色谱进样针：类似于气相色似于气相色谱进样针，只是其，只是其针头为平平头，以，以免扎破六通免扎破六通阀管路。用于可管路。用于可变体体积进样2024/5/21 周二28.p六通阀进样器：用于固定体积进样2024/5/21 周二29.3分离系统色谱柱 色色谱柱是液相色柱是液相色谱的心的心脏部件，它包括部件，它包括柱管与固定相柱管与固定相两部分。柱管材料有两部分。柱管材料有玻璃、不玻璃、不锈钢、铝、铜及内及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，有限，故金属管用得故金属管用得较多。多。一般色一般色谱柱柱长5 530cm30cm，内径，内径为4 45mm5mm，凝胶色，凝胶色谱柱内柱内径径3 312mm12mm，制，制备往内径往内径较大，可达大，可达25mm 25mm 以上。一般在分离前以上。一般在分离前备有一个前置有一个前置柱，柱，前置柱内填充物和分离柱完全一前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶可使淋洗溶剂由于由于经过前置柱前置柱为其中的固定相其中的固定相饱和，使它在流和，使它在流过分离柱分离柱时不再洗脱其中固定相，保不再洗脱其中固定相，保证分离分离技的性能不受影响技的性能不受影响。2024/5/21 周二30.4检测系统在液相色在液相色谱中，有两种基本中，有两种基本类型的型的检测器。一器。一类是是溶溶质性性检测器器，它，它仅对被分被分离离组分的物理或化学特性有响分的物理或化学特性有响应，属于，属于这类检测器的有紫外、器的有紫外、荧光、光、电化学化学检测器等。另一器等。另一类是是总体体检测器，器，它它对试样和洗脱液和洗脱液总的物理或化学性的物理或化学性质有响有响应，属，属于于这类检测器的有示差折光，器的有示差折光，电导检测器等。器等。1）紫外）紫外检测器器 其其检测原原理理和和UV-Vis方方法法一一样。只只是是此此时所所采采用用的的吸吸收收池池为微微量量吸吸收收池池，通通常其光程常其光程为2-10mm,体体积约为110 L。HPLC分分析析中中，约有有80%的的物物质可可以以在在254 nm或或280nm处产生生紫紫外外吸吸收收。因因此此该类检测器器应用很广。用很广。在在选择测量量波波长时注注意意：溶溶剂必必须能能让所所选择的的光光透透过，即即所所选波波长不不能能小小于溶于溶剂的最低使用波的最低使用波长。石英窗石英窗接色接色谱柱柱UV光光电倍增管倍增管废液液2024/5/21 周二31.两种两种检测器的色器的色谱图(a)：可：可变波波长紫外紫外检测器；器；(b)：二极管：二极管阵列列检测器器(b)(a)2024/5/21 周二32.2）荧光光检测器器 许多多有有机机物物具具荧光光活活性性，尤尤其其是是芳芳香香族族化化合合物物具具有有很很强的的活活性性。荧光光检测器器是是一一种种选择性很性很强的的检测器，其灵敏度比器，其灵敏度比UV检测器高器高23个数量个数量级。灵敏度高，灵敏度高，选择性好，可用于梯度性好，可用于梯度洗脱。洗脱。2024/5/21 周二33.紫外吸收紫外吸收检测器器(a)可可变波波长紫外紫外检测器器(b)二极管二极管阵列列检测器器氘灯灯光光栅流流通通池池测量量光光电二二极极管管参比光参比光电二极管二极管二极管二极管阵列列检测器器2024/5/21 周二34.3）示差折光）示差折光检测器器原理：利用两束相同角度的光照射溶原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和相和样品品+溶溶剂相，利用二者相，利用二者对光光的折射率不同，其中一束（通常是通的折射率不同，其中一束（通常是通过样品品+溶溶剂相）光因相）光因为发生偏生偏转造成两束光的造成两束光的强度差度差发生生变化，将此差示信号放大并化，将此差示信号放大并记录，该信号信号代表代表样品的品的浓度。度。为通用型通用型检测器，灵敏度器，灵敏度为10-7g/mL。但。但对温度温度变化敏感，且不适于化敏感，且不适于梯度淋洗。梯度淋洗。光源光源调零零光学零光学零参比参比样品品平面平面镜透透镜光光电转换记录仪放大器放大器遮光板遮光板2024/5/21 周二35.4）电导检测器器 电导检测器主要用于离子色器主要用于离子色谱的的检测。其其原原理理是是基基于于待待测物物在在一一些些介介质中中电离离后后所所产生生的的电导（电阻阻的的倒倒数数）变化来化来测量量电离物离物质的含量。的含量。电导检测器器的的主主要要部部件件是是电导池池。其其响响应受受温温度度影影响响较大大，因因此此需需要要将将电导池置于恒温箱中。另外，当池置于恒温箱中。另外，当pH7时，该检测器不器不够灵敏。灵敏。高效液相色高效液相色谱分析方法的一般步分析方法的一般步骤：第一：了解第一：了解样品的基本情况品的基本情况第二：明确分离目的第二：明确分离目的第三：了解第三：了解样品的性品的性质和需要的和需要的预处理理第四：第四：检测器的器的选择第五：分离模式的第五：分离模式的选择第六：固定相和流第六：固定相和流动相的相的选择2024/5/21 周二36.6.36.3高效液相色高效液相色谱基本原理基本原理溶溶质在液相流在液相流动相相中的中的扩散系数，散系数，约为气相中气相中扩散系数散系数的万分之一的万分之一2024/5/21 周二37.流流动相流速相流速对板高的影响板高的影响1)小小颗粒填料，填充均匀；粒填料，填充均匀；2)选择较低的流低的流动相流速；相流速；3)选择粘度小的溶粘度小的溶剂作流作流动相，改善相，改善传质。修正的速率方程：修正的速率方程：提高柱效提高柱效途径途径2024/5/21 周二38.