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饲料液态酶及其后喷涂工艺研究和应用
饲料安全是关系到食品安全和消费者利益一件大事，是全社会关注热点。实现畜产品“绿色化”关键问题是正确使用抗生素等药品类添加剂，更多地应用诸如酶制剂、微生物制剂等“绿色”生物技术产品，以处理畜牧生产中疾病预防、生产性能提升等问题。饲用酶制剂作为一个新型“绿色”环境保护添加剂，自从1975年美国饲料工业首次把酶制剂作为添加剂应用于配合饲料中并取得显著效果后，饲用酶制剂日益受到世界养殖业重视。其效能特点有：
① 补充动物内源酶不足，提升饲料酬劳；
② 降解植物细胞壁，促进营养物质消化吸收；
③ 消除饲料中抗营养因子，提升饲料安全性；
④ 增强动物抗病能力，提升畜禽成活率；
⑤ 降低氮、磷排泄量，降低环境污染。
⑥ 降低饲料成本。
饲料酶按功效关键分为两类：一类是降解单底物植酸酶、淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶等单酶，其中以植酸酶和木聚糖酶、甘露聚糖酶应用最普遍，多采取基因工程菌液体发酵生产。另一类是以非淀粉多糖为底物，真菌固体或液体发酵，深入复配单酶加强复合酶。
为了提升饲料酶使用效果，需要从酶学性质改善和使用方法优化两方面研究。酶学性质包含酶活、底物适应性、pH曲线、温度曲线、结构稳定性等酶蛋白本身特征，关键由生产菌种和生产工艺决定。使用方法包含酶剂型、储存稳定性、加工稳定性、酶配比和剂量和作用饲料底物对应降解效果。康地恩生物集团等酶制剂生产商建设现代化生产基地，构建高效工程菌株，改善发酵工程技术，配合颗粒饲料大力推广优异液态酶后喷涂工艺，成为饲料酶一大亮点。
一、基因工程菌株构建

大家为了处理单胃动物不能利用植物中植酸磷、非淀粉多糖问题而寻求并发觉了植酸酶、木聚糖酶、纤维素酶等饲料酶。对这种应用性很强酶所进行基因工程研究紧紧围绕着工业化应用这一中心目标。基因工程饲料酶在养殖业中应用，有三种可能路径。
第一，经过植物基因工程改造饲料用作物，直接在植物籽实中表示适宜植酸酶，省去了植酸酶生产及其在饲料中添加。Pen等(1993)首先在烟草种子中成功地表示了外源基因植酸酶，植酸酶表示量达成种子中可溶蛋白1%、叶片可溶性蛋白14.4%[1]。Li J于1997年在大豆(Glycine max)籽实中成功表示来自黑曲霉植酸酶，而且其酶学性质和出发菌株所产相同；饲喂试验结果表明一样能够提升家禽对植酸磷利用率[2]。多年来，在水稻、苜蓿、玉米、油菜中成功表示植酸酶。不过因为植物籽实作为配合饲料原料经过饲料生产全过程，所以其中所包含植酸酶必需经历高温制粒过程。同时因为各地用作动物饲料作物种类甚或品种往往不一样，极难仅仅为了提升家畜家禽植酸磷利用率而大规模弃用原来优势品种。植酸是植物体内第二信使之一，在植物生长发育过程中起着关键作用，也是种子储存磷关键机制，假如植酸酶过量表示，会对植物造成伤害，出芽率较低[3-6]。转基因植物能够表示含有活性β-葡聚糖酶和木聚糖酶，并正常生长发育。作为结构物质非淀粉多糖，假如非淀粉多糖相关酶合成量提升，也会打破该植物整体生理平衡，出现倒伏、减产[7]。
第二，利用现代转基因动物技术，使饲料酶基因在单胃动物消化道内源表示，无须外部添加。Serguei P等于将ECP编码基因appA转化入小鼠中。55kDa活性植酸酶蛋白经过唾液腺分泌入唾液中。转植酸酶基因小鼠粪便中磷含量和阴性对摄影比降低了11%。Golovan SP等于将植酸酶基因转入猪内，分泌含有植酸酶唾液以分解食物中植酸磷，它排出粪便中含磷量和对摄影比降低了75%。这方面研究起步较晚，仍有很多问题有待处理，其中最关键是转基因过程对动物体损伤，及怎样避免等问题[3-5]。
第三，微生物发酵生产饲料酶，作为固体饲料添加剂预混在粉状配合饲料中，或制备液体酶在高温制粒后喷涂于颗粒饲料表面。这种策略对使用者来说最为简单易行，但对植酸酶生产者提出了很高要求。在微生物体内，植酸酶并非持家基因，所以天然菌株生产植酸酶能力十分低下，远远不能满足饲料成本控制需要。野生型黑曲霉NRRL3135菌株产植酸酶最高水平为6.8 U/ml，采取现代基因工程技术大幅提升生产植酸酶能力是最为直接方法。
第一个被分离纯化植酸酶起源于Aspergillus terreus No. 9 A 1，以后以后,陆续从十多个微生物中分离到植酸酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶，如枯草芽孢杆菌、假单孢杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、酵母、曲霉、隔孢伏革菌等，并对酶生理生化性质进行了较深入研究[8-11]。
中国以中国农科院饲料所姚斌等为代表研究者构建了上述饲料酶大肠杆菌、毕赤酵母等高效表示系统，并快速产业化[12]。利用转基因技术构建毕赤酵母表示系统和液体深层发酵工艺相结合，大大拓展了饲料酶基因起源，为提升饲料酶产量和酶活提供了强大技术支持。国家高技术研究发展计划(863计划) “饲料用酶分子改良和产品研制”立足饲料行业对酶制剂急需，组织中国农科院、吉林大学、华东理工大学、康地恩、挑战等科研单位和企业，在酶分子改良、高效表示、工程菌高密度发酵、饲料酶规模化生产和应用技术等方面联合攻关，经过分子改良，将满足饲料酶高比活、耐酸性、抗胃肠道蛋白酶等要求，预期木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶在工程菌中表示量高于5g/L，发酵液效价分别达成100000IU/mL、50000IU/mL、8000IU/mL、5000IU/mL。
植酸酶已成为二十一世纪世界公认、最有前景无公害饲用酶制剂。1999年植酸酶全球销售额为全部饲用酶制剂49%。在德国和荷兰，超出90%猪鸡饲料添加了植酸酶。欧美等国植酸酶每十二个月以20%左右速度在递增，亚洲地域以每十二个月80%~100%速度在递增。中国是全世界首屈一指饲料需求大国，和，中国饲料需求量分别为3.4亿t和4.08亿t，植酸酶添加量以0.1‰计算，植酸酶纯蛋白需求量应达成3.4~4.08万t以上，由此产生直接经济效益每十二个月将超出30亿人民币，含有良好市场前景。
二、液态酶生产和后喷涂工艺
酶作为一个蛋白质，对环境原因很敏感。温度、pH值、水分、强酸、强碱、紫外线和贮存过程等全部会对酶活产生很大影响。如上所述，分子改良饲料酶基础适合饲料和消化道作用环境，但伴随大型饲料厂中越来越多地装备有强调质设备和高温（80-150℃）短时加工设备。在饲料制粒、挤压和膨化过程中受温度、压力和水分强烈作用下，酶制剂等热敏性微量组分大部分活性全部丧失了。康地恩检测深圳某企业提供11个添加植酸酶预混料样品，结果60天酶活平均降低50%。
将酶制剂进行“包被”处理，制成微胶囊，降低了外界原因影响，酶热稳定性也有所提升，但液态酶后喷涂工艺因为高均匀度及避免高温蒸汽对酶活不利影响，越来越普及，成为颗粒饲料生产必备配套设备。KDN液态植酸酶、木聚糖酶、复合酶和后喷涂设备相配套，在六和、新期望、中惠、双胞胎、正邦、海新、粤星、永达、得利斯等中国关键大型饲料企业推广应用，能显著降低饲料成本，提升消化率，降低氮磷排放，受到饲料企业欢迎，已经安装300余台，对饲料酶普及应用含相关键推进作用。
1、理想后喷涂设备要求
① 微量添加，高均匀度。用高压空气作载体，气液双料喷嘴，将微量（50-200ml/吨饲料）酶液充足雾化，弥漫包涂饲料颗粒；喷酶颗粒饲料成品硬度无影响，水分几乎不增加；并辅设空气清洗系统，杜绝喷嘴处酶液滴漏问题。
② 自动化，高正确度。经过压力传感器连续测定干料流量，经PLC信息处理，自动控制酶蠕动泵流量，使酶喷涂量正确跟踪干料流量改变。
③ 兼容性好。多液仓，多泵，多喷嘴，适合多酶种和其它液体添加剂喷涂。各液仓设置传感器，方便监控酶液用量和盘点。
④ 触摸屏人机界面，总览全部过程，操作方便，参数设置简单，可依据饲料不一样粒度选择对应校正曲线。
⑤ 加缓存仓，使颗粒干料流量稳定，均匀度提升。

2、KDN-PPA液态酶后喷涂设备组成和工作原理
KDN-PPA根据上述要求，采取最优异自动化控制技术研制而成，关键电控件、泵、传感器、阀均采取国际名牌产品，确保产品运行可靠，计量正确。KDN-PPA设备硬件由泵室、添加室、控制箱组成：
① 泵室含有液仓、液体流量测定装置、液泵等。
② 添加室含有颗粒饲料流量传感器、喷涂装置等。
③ 控制箱含有PLC、触摸屏等。
合格饲料颗粒经分级筛进入缓冲仓（C），控制箱内PLC收到仓料料位传感器（A）有料输入信号，产生输出，给控制箱内颗粒饲料流量表开启信号，依据人为指定目标流量（t/h）进行PID调整，对应打开添加室进料门（B），饲料靠自重流下，同时，安装在添加室内喷涂电磁阀（D）打开，泵室依据触摸屏中指定酶制剂流量（1/h）、酶泵选择和颗粒饲料流量表开门信号开启，将高压空气和酶（E和F）按要求流量和压力送到添加室，喷涂到颗粒料。
3、高均匀度、高喷涂率
饲料关键以固体和液体形态存在，多种原料混合方法无非三种方法：固-固、固-液、液-液。
添加剂在颗粒饲料中分布均匀度受添加量、添加剂粒度、颗粒饲料粒度、混合机性能等原因影响，设某原料添加量为x（g/kg），添加剂颗粒度为y（粒/g），颗粒饲料粒度为z（粒/g），则每颗饲料含有原料粒数为：

如固体植酸酶x=0.1, y=1500, z=15，则

2-3kg高压空气，能够将0.1ml液体酶能够分散为0.8-6.4×106个雾滴。液体植酸酶x=0.1, y=3000000, z=15，则

对已经安装后喷涂设备进行了30多台次均匀度检测，平均变异系数CV=13%，喷涂效率（喷涂颗粒实际酶活占理论值比率）85%。而植酸酶颗粒剂直接混合到颗粒饲料中，则混合过程酶活从418IU/mL降到217IU/mL，73.5°C调质后降到114 IU/mL，制粒后降到97IU/mL97，植酸酶活性降低了75%，均匀度CV=39%（滨州六和实地测定数据）。
4、高保留率
在潍坊六和测定结果表明，植酸酶粉剂（ 5897u/g）4倍添加于饲料（400g/t），经高温制粒（75°C），残留酶活很低，仅50U/kg，和理论值 2300u/kg和预期值 500u/kg差距甚远。和后喷涂效果450u/kg差距也很大。
因为液体酶喷涂于颗粒饲料表面，担心易脱落或不稳定。临沂六和模拟养殖场室外饲料筒仓处理：相对湿度75％，60℃保持10小时；37℃保持14小时交替处理，共处理10天，比较进口固体耐制粒植酸酶直接混合、KDN液体植酸酶后喷涂生产颗粒饲料，分别存留41%和56%。
5、液体酶生产
KDN液态饲用复合酶棕褐色，澄清透明，经过稳定化处理，稳定性高，完全能满足饲料企业运输，贮存和生产需要本品为生物活性物质，避光、密闭保留，低温4～10℃贮存，保质期六个月。
6、颗粒饲料中酶活测定方法
因为饲料成份复杂，磷、糖类背景值高，用常规酶活测定方法难以正确测定，所以制约了酶制剂推广。曾经一度形成无法比较粉酶、颗粒酶和液态酶效果局面。康地恩在推行液态酶后喷涂工艺同时，参考国外文件率先建立了颗粒饲料中植酸酶活性测定方法，在浸提饲料中植酸酶后，用超滤柱滤除游离磷酸根后，根据常规方法测定[13-14]。这对于指导新工艺改善和普及起到关键作用。
四、饲料酶体外酶解评价
动物喂养试验周期长，成本高，影响原因多，经过模拟家禽胃肠道环境，建立体外酶解评价体系，能够为饲料酶使用提供试验依据。

1、木聚糖酶对消化道适应性
采集中国不一样企业生产木聚糖酶，保留于4℃冰箱。根据KDN企业标准测定酶活（酶活力定义：1g酶粉于40℃，pH＝5.0条件下，每分钟水解木聚糖生成相当于1μg木糖还原物质，即为1个酶活力单位，以U/g表示）。
胃蛋白酶耐受性分析：取上述酶浸体液20ml，调pH 2.6，加入90μl 50mg/ml胃蛋白酶，在40℃培养箱中温育1.5h，定容至25ml，经过合适稀释后测定残留酶活。
胰蛋白酶耐受性分析：取上述酶浸体液20ml，调pH 6.5，加入45μl 100mg/ml胰蛋白酶，在40℃培养箱中温育2h，定容至25ml，经过合适稀释后测定残留酶活。胃-胰蛋白酶耐受性分析：前后进行上述处理后测定酶活。
表1.模拟肠道环境对木聚糖酶活力影响（U/g、%）
试验组别
酶活
初始
胃蛋白酶组
胰蛋白酶组
胃+胰蛋白酶组
KDN
3496026
100
30.3
38.8
36.8
Y
1214118
100
23.8
19.2
21.1
X
3608228
100
6.2
10.9
6.9
J
3397849
100
31.0
34.4
39.2
由表1中可知，胃蛋白酶和胰蛋白酶对木聚糖酶影响相同，且二者前后作用并未深入影响木聚糖酶活性。KDN和Y、J对酸、胃-胰蛋白酶耐受性很好，X较差，仅剩下6.9%活性。
2、KDN木聚糖酶对不一样饲料原料体外消化率
模拟体内消化过程，建立四步酶解法，考察KDN木聚糖酶对饲料原料降解效果，建立小型酶解数据库。
菜粕、棉粕、花生粕、DDGS、复合底物均研磨，过10目筛。小麦：大豆：玉米= 4：3：3组成复合底物。无酶成品颗粒饲料为肉鸡2号料。对照组（胃蛋白酶﹢胰酶）、试验组（胃蛋白酶﹢胰酶﹢木聚糖酶），二次反复。
1) 正确称取5.00g底物（过10目筛）于150ml三角瓶内，加入30ml去离子水。沸水浴5min，补加10ml去离子水。
2) 冷却后调整pH至2.6，加入胃蛋白酶，使终浓度为1mg/ml在37℃培养箱中酶解1.5h。
3) 调pH至 6.5，加入胰酶，使终浓度为2.5mg/ml，转入透析袋内，用15ml pH 6.5磷酸盐缓冲液冲洗三角瓶，洗液并入透析袋。在37℃培养箱中、盛有4000ml去离子水三角瓶中透析2h。
4) 加入木聚糖酶(相当于10万U)，37℃培养箱中酶解、透析4h。
测定透析袋内容物及外部透析液中可溶性戊聚糖（间苯三酚法）和还原糖（DNS法）含量，计算总释放量。还原糖表征糖还原末端，包含不一样聚合度和不一样糖类，如戊糖、六糖；戊聚糖关键包含不一样聚合度木糖和阿拉伯糖。
表2. KDN木聚糖酶对不一样饲料原料体外酶解产生还原糖和戊聚糖
底物
戊聚糖（mg/5g底物）
还原糖（mg/5g底物）
对照组
试验组
对照组
试验组
大豆
38.1 (12.9)
42.4 (15.5)
169 (88)
256 (82)
玉米
21.3 (7.8)
28.1 (7.7)
1924 (847)
2484 (876)
小麦
49.4 (4.4)
148.3 (34.4)
1581 (588)
1812 (781)
麸皮
81.2 (6.1)
300.6 (81.7)
434 (185)
726 (286)
菜粕
51 (10.3)
70.8 (15.8)
114 (58)
246 (101)
棉粕
60.6 (9.5)
79 (22.3)
119 (77)
168 (101)
花生粕
40.6 (15.6)
51.6 (19.8)
254 (112)
372 (144)
DDGS
50.2 (18.9)
103.6 (24.7)
160 (121)
217 (129)
复合原料
47.5 (8.3)
98 (24.5)
1248 (524)
1379 (545)
成品料
46.2 (1.9)
81.6 (22.8)
409 (197)
501 (228)
注：表中括号内数值为外部透析液中含量，括号前数值为总量。

图1、KDN木聚糖酶对不一样饲料原料体外酶解产生戊聚糖

图2、KDN木聚糖酶对不一样饲料原料体外酶解产生还原糖

图3、KDN木聚糖酶对不一样饲料原料体外酶解产生净还原糖

由图1能够看出，经过消化酶降解，各底物仅产生极少许小分子戊聚糖透过透析袋，大分子戊聚糖也多在50 mg/5g底物以下。经过木聚糖酶降解后，溶解大、小分子戊聚糖提升1-3倍，大分子戊聚糖多在50 mg/5g底物以上。尤其含木聚糖较高小麦和麸皮提升幅度2-3倍，且水溶性小分子戊聚糖提升8倍和13倍，对于麦类降解显著，有利于降低食糜粘度。
图2显示，木聚糖酶作用后，还原糖增加幅度不大，也是麦类提升显著。
图3，以“试验组小分子还原糖-试验组小分子戊聚糖-对照小分子还原糖”作为水溶性净六碳糖，近似认为可被肠道吸收糖，以提供能量。结果除了小麦酶解产生净糖增加3%，其它差异不显著。
另外，单一原料酶解和复合原料酶解正相关，但没有叠加性，不能依据单一原料酶解来推测配合饲料酶解情况。
3、不一样木聚糖酶体外消化比较
考察木聚糖酶（KDN、X和Y）对饲料原料（麸皮、菜粕、棉粕、花生粕、DDGS和成品颗粒饲料）降解效果。对照组（胃蛋白酶﹢胰酶）、试验组（胃蛋白酶﹢胰酶﹢木聚糖酶），做一次反复。
正确称取底物5.00g于150ml三角瓶内，加入30ml去离子水。沸水浴5min补加10ml去离子水，冷却后调整pH至2.6，加入胃蛋白酶，使终浓度为1mg/ml，在37℃培养箱中酶解1.5h。调pH至 6.5，加入胰酶，使终浓度为2.5mg/ml，转入透析袋内，用15ml pH 6.5磷酸盐缓冲液冲洗三角瓶，洗液并入透析袋。在37℃培养箱中、盛有4000ml去离子水三角瓶中透析2h。加入木聚糖酶浸提液 (相当于10万单位)，37℃培养箱中酶解4h。
测定透析袋内容物及外部透析液中戊聚糖和还原糖含量，计算总量。结果如表4所表示。
表3、不一样酶制剂对多种饲料原料酶解
底物
戊聚糖（mg/5g底物）
对照
KDN
X
Y
麸皮
81.2 (6.1)
300.6 (81.7)
304.1 (71.5)
393 (91.9)
菜粕
51 (10.3)
70.8 (15.8)
53.1 (10.1)
68.2 (17.2)
棉粕
60.6 (9.5)
79 (22.3)
62.3 (13.8)
71.4 (13.9)
花生粕
40.6 (15.6)
51.6 (19.8)
42.4 (18.7)
46.6 (19.4)
DDGS
50.2 (18.9)
103.6 (24.7)
59.6 (8.2)
104.4 (24.3)
成品料
46.2 (1.9)
81.6 (22.8)
78.5 (14.3)
94 (18.7)
底物
还原糖（mg/5g底物）
对照
KDN
X
Y
麸皮
434 (185)
726 (286)
599 (254)
684 (245)
菜粕
114 (58)
246 (101)
127 (72)
160 (89)
棉粕
119 (77)
168 (101)
121 (75)
126 (75)
花生粕
254 (112)
372 (144)
260 (113)
262 (113)
DDGS
160 (121)
217 (129)
186.5 (108)
210 (131)
成品料
409 (197)
501 (228)
426 (184)
462 (213)

注：表中括号内数值为外部透析液中含量，括号前数值为总量。
三种木聚糖酶体外酶解效果表明，加酶组均显著高于对照，三组很靠近，KDN略优。另外，分析戊聚糖这一指标发觉，外部透析液中含量比较低，表明试验中所用木聚糖酶以内切木聚糖酶为主。
结言
酶是饲料消化营养关键研究内容，植酸酶和木聚糖酶是成功范例。围绕植酸、糖类、蛋白质消化酶解，多年来在基因工程、酶工程、发酵工程和体外酶解评价、液体酶稳定性和后喷涂设备等很多方面全部有深入研究和丰富文件，新技术建立和成熟给饲料养殖行业带来福音。液体后喷涂工艺作为颗粒饲料生产工艺配套技术日趋成熟，尤其适合于禽料生产，本文仅以此为根本作了概要综述，但并非此单一模式。对于饲料原料固有酶保持利用、对消化道固有消化酶利用、对微生物在液体饲料中应用等全部值得从技术层面研究和经济价值评定。