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柴胡有效成份提取工艺研究
肖功胜，王启帅, 杨云*，
（河南中医学院药学院，河南 郑州 450008）
摘要：目标：确定柴胡有效成份提取最好工艺。方法：以柴胡中挥发油吸收度和柴胡皂苷a含量为指标，采取单原因试验筛选关键原因和水平，再以正交试验筛选柴胡有效成份提取最好工艺。结果：最好工艺参数为40℃温浸，搜集相当于药材2倍量蒸馏液，继用8倍量含5%氨水95%乙醇回流1h提取柴胡皂苷，可使挥发油吸收度达0.941，柴胡皂苷a含量达0.32%。结论：该工艺为柴胡有效成份提取提供了可靠依据，且工艺条件稳定可靠，反复性好。
关键词：提取工艺；柴胡皂苷a；挥发油；正交试验
Study on Extraction Technology of Active Ingredients from Bupleurum chinense DC
XIAO Gong-sheng,WANG Qi-shuai,YANG Yun *
（College of Pharmacy, Henan University of traditional Chinese medicine, Zhenzhou 450008.China ）
ABSTRACT OBJECTIVE To determine the optimum technology of active ingredients from Bupleurum chinense DC. METHODS With the absorbance of volatile oils and the content of in Bupleurum chinense DC as indexes, selecting the major influencing factors and levels by the single factor experiment, and selecting the optimum technology by orthogonal experiment. RESULT The optimum condition shows the impregnating temperature is 40℃ ,the volume of distilled fluid is 2 times of weight of Bupleurum chinense DC, and the volume of 95%alcohol with 5%ammonia water to reflux extraction for 1hour is 8 times of weight of Bupleurum chinense DC, then the absorbance of volatile oils is 0.941 and the content of saikosaponin a is 0.32%.CONCLUSION The optimum technology provides reliable evidence for extraction of active ingredients from Bupuleurum chinense DC, and the conditions are accurate and reliable with good reproducibility。
KEY WORDS：Extraction technology; saikosaponin a; volatile oils; orthogonal experiment
基金项目：国家十一五科技支撑计划资助项目（BAIO6A10）
作者介绍：肖功胜（1982—），男，湖南邵阳人，硕士硕士，从事天然药品化学研究。
*通讯作者：杨云，女，硕士生导师，教授。
Tel:0371—65680605 E-mail:
柴胡为伞形科植物柴胡（ Bupleurum chinense DC）或狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Wild）干燥根[1]。含有疏散退热，疏肝解郁，升阳举陷之功效，为中医诊疗少阳症首选要药。其关键化学成份为柴胡皂苷和挥发油类。柴胡作为临床常见药，中成药制剂品种众多，且大多以煎煮法提取柴胡皂苷类成份，而多以水蒸气蒸馏法提取挥发油[2]，因为柴胡皂苷a、d化学结构均具不稳定性，遇酸或受热易分别降解生成活性较弱次生苷b1、b2，，所以伴随水蒸气蒸馏法提取时间延长，柴胡皂苷a、d量将逐步降低，以致严重影响了柴胡制剂质量和临床疗效。现在中国相关柴胡提取工艺文件报道较多，但多以挥发油或柴胡皂苷a单独为指标进行考察，极少有同时考察挥发油和柴胡皂苷a文件报道，更是未曾有文件报道过在确保挥发油提取率同时还兼顾柴胡皂苷a充足提取。所以，本文采取正交试验综合考察柴胡中挥发油吸收度和柴胡皂苷a含量，筛选最好工艺，为提升柴胡制剂质量和疗效打下坚实基础。
1 仪器和试药
1.1仪器
岛津LC-20A高效液相分析仪（SPD-20A紫外检测器）；752紫外分光光度计（上海精密仪器科技）；RE 52—86A 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；METTLER AE240电子分析天平（瑞士）
1.2试药
柴胡药材购于河南省药材企业，经本院陈随清教授判定为伞形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC）干燥根，柴胡皂苷a对照品自制，经峰面积归一化测定含量为：99.91% ；乙腈为色谱纯；水为双重蒸馏水；其它试剂均为分析纯。
2方法
2.1 单原因试验
分别以药材浸渍温度、浸渍时间、料液体积比、蒸馏液搜集量等为原因，在不一样水平下进行单原因试验，筛选出影响柴胡挥发油提取关键原因和水平，一样分别以乙醇浓度、PH值、柴胡皂苷提取时间、料液体积比等为原因，在不一样水平下进行单原因试验，筛选出影响柴胡皂苷提取关键原因和水平。从而为正交试验设计提供依据。
2.2挥发油提取和测定方法
随机称取50g柴胡干燥粗粉，置于500ml圆底烧瓶中，采取水蒸气蒸馏法在不一样条件下提取柴胡挥发油，搜集蒸馏液，加3%丙二醇摇匀，精密量取上述蒸馏液2ml两份，一份置5ml容量瓶中，加水定容，摇匀，作为样品液，另一份置蒸发皿中，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水溶解，转移至5ml容量瓶中，加水定容，摇匀，作为空白。用752紫外分光光度计在277nm波优点测定蒸馏液中挥发油吸收度。
2.3柴胡皂苷提取
取提取挥发油后药渣，滤干，置于500ml圆底烧瓶中，在不一样条件下回流提取柴胡皂苷，过滤得滤液,减压低温浓缩成每1ml含0.5g柴胡浓缩液,备用。
2.4柴胡皂苷a 含量测定
2.4.1色谱条件
大连伊利特C18(4.6mm×250mm,5µm)；流动相：乙腈-水37：63；流速：1ml/min；检测波长208nm；柱温：35℃；进样量20µl.
2.4.2 对照品溶液制备
精密称取柴胡皂苷a对照品5.09mg，加甲醇溶解并定容至10ml，摇匀，配成0.509mg/ml对照品溶液,冷藏备用。
2.4.3 供试品溶液制备
取上述浓缩液10ml减压蒸干，加20ml甲醇溶解残渣，过滤得滤液。再取2ml滤液至10ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，冷藏备用。
2.4.4 线性范围考察
精密吸收对照品贮备液2.0、6.0、10.0、14.0、18.0µl，在“2.4.1”项下色谱条件下进样测定,统计峰面积，以峰面积积分值Y为纵坐标，对照品溶液进样量X（µl）为横坐标，进行线性回归（n=5）, 得线性回归方程为Y=209413.7X－162379.4，线性范围为：0.9720~ 9.635µg，相关系数为r=0.9997，线性关系良好。
2.4.5 精密度试验
精密吸收对照品20µl，在“2.4.1”项下色谱条件下反复进样5次测定，统计峰面积，RSD为1.5%（n=5），表明精密度良好。
2.4.6 稳定性试验
将供试品溶液在室温下贮存，在“2.4.1”项下色谱条件下，分别于0，2h，4h，6h，8h进样测定，统计峰面积，RSD为2.0%，表明样品在8h内稳定。
2.4.7重现性试验
精密称取同一批样品5份，按供试品溶液处理方法制备样品溶液，在“2.4.1”项下色谱条件下反复进样测定5次，统计峰面积，RSD为2.1%（n=5）
2.4.8样品测定
精密吸收20µl样品溶液，在“2.4.1”项下色谱条件下进样测定，统计峰面积，计算各样品中柴胡皂苷a含量。
2.5正交试验
以柴胡蒸馏液中挥发油吸收度和柴胡皂苷a含量为检测指标，参考单原因试验结果，分别以药材浸渍温度、挥发油搜集量、柴胡皂苷提取时间、柴胡皂苷提取溶剂料液比等关键原因及不一样水平进行（L9(34)正交设计，筛选最好工艺。正交试验原因和水平见表1
表1 正交试验原因及水平
Tab1 Factor and level of orthogonal test
原因
水平
原因
浸渍温度A
搜集量B
提取时间C
料液比D
1
40℃
2倍
1h
5倍
2
60℃
4倍
2h
6倍
3
80℃
5倍
3h
8倍
3结果和分析
3.1 浸渍温度对挥发油提取效果影响
分别在30℃、40℃、60℃、80℃温度下浸渍6h,料液比1:6，提取一次，考察浸渍温度对挥发油提取效果影响。测得吸收度依次为：0.303、0.984、0.758、0.587。由测定结果可知，在40℃下浸渍吸收度达成最大。且改变显著，所以浸渍温度应选在40℃左右。
3.2浸渍时间对挥发油提取效果影响
在40℃下，分别浸渍0h、2h、4h、6h、8h,料液比1：6，提取一次，考察浸渍时间对挥发油提取效果影响。测得吸收度依次为：0.470、0.559、0.650、0.940、0.722。由测定结果可知，浸渍6h吸收度最大，浸渍4h和8h吸收度相当。
3.3料液比对挥发油提取效果影响
料液比分别为1：5、1:6、1：8、1:10,提取一次，考察料液比对挥发油提取效果影响，测得吸收度依次为：0.316、0.443、0.337、0.258。由测定结果可见，料液比1：6吸收度最大。且改变显著。
3.4挥发油搜集量对挥发油提取效果影响
分别搜集100ml、200ml、300ml蒸馏液，考察挥发油搜集量对挥发油提取效果影响，测得吸收度依次为：0.454、0.507、0.596。由测定结果可知。伴随搜集量增多，吸收度逐步增大，但增加趋势不显著。
3.5乙醇浓度对柴胡皂苷提取效果影响
分别以95%、75%、60%、45%乙醇料液比为：1:6，提取柴胡皂苷。考察不一样乙醇浓度对柴胡皂苷提取效果影响，柴胡皂苷a含量依次为：0.20%、0.15%、0.12%、0.12%。由测定结果可知，柴胡皂苷提取率随乙醇浓度降低而降低。在95%乙醇浓度时最大。且改变较显著。所以选择95%乙醇提取。
3.6 PH值对柴胡皂苷提取效果影响
分别用0、5%、10%、15%氨水95%乙醇液提取皂苷。考察PH值对柴胡皂苷提取效果影响，柴胡皂苷a含量依次为：0.20%、0.25%、0.24%、0.24%。由测定结果可知，碱性乙醇提取效果比很好，含5%～10%氨水95%乙醇条件下提取液中柴胡皂苷a改变不显著，所以选择含5%氨水。
3.7提取时间对柴胡皂苷提取效果影响
用95%乙醇分别在0.5h、1h、2h、3h、提取皂苷。考察提取时间对皂苷提取效果影响。柴胡皂苷a含量依次为：0.20%、0.25%、0.20%、0.20%。由测定结果可知，提取1h时提取率最大。提取时间再长提取率就逐步下降。
3.8料液比对柴胡皂苷提取效果影响
在10倍、8倍、6倍、5倍、3倍不一样料液比条件下回流提取柴胡皂苷。考察料液比对柴胡皂苷提取效果影响。柴胡皂苷a含量依次为：0.15%、0.15%、0.20%、0.21%、0.14%。由测定结果可知，料液比为在5～６倍时提取率最大。
3.9 正交试验结果和分析
3.9.1 综合评分标准:因柴胡中挥发油和柴胡皂苷a均为有效成份,权重应相等。则要求吸收度中最大值0.945及柴胡皂苷a含量中最大值0.33%为100,其它值对应比较,两项加和后平均得综合评分值,结果见表2,方差分析见表3。
表2 正交试验结果和分析
Tab 2 Result of orthogonal test
试验号
列号
试验结果
综合评分
1
2
3
4
原因
吸收度
含量（%）
y(%)
A
B
C
D
y1
y2
1
1（40℃）
1（2倍）
1（1h）
1（5倍）
0.945
0.24
86.26
2
1（40℃）
2（4倍）
2（2h）
2（6倍）
0.47
0.27
66.22
3
1（40℃）
3（5倍）
3（3h）
3（8倍）
0.573
0.28
73.84
4
2（60℃）
1（2倍）
2（2h）
3（8倍）
0.718
0.32
87.93
5
2（60℃）
2（4倍）
3（3h）
1（5倍）
0.435
0.22
56.03
6
2（60℃）
3（5倍）
1（1h）
2（6倍）
0.633
0.24
69.06
7
3（80℃）
1（2倍）
3（3h）
2（6倍）
0.54
0.29
71.79
8
3（80℃）
2（4倍）
1（1h）
3（8倍）
0.468
0.33
74.76
9
3（80℃）
3（5倍）
2（2h）
1（5倍）
0.465
0.26
64
综合评分
Ij
226.32
245.98
230.08
206.29

Ⅱj
213.02
197.01
218.15
207.07

Ⅲj
210.55
206.9
201.66
236.53

Rj
5.26
16.32
9.47
10.08

表3误差分析
Tab 3 Error analysis
方差起源
离均差平方和
自由度
方差
F值
显著性
A
47.96
2
23.98
1.00

B
447.01
2
223.505
9.32
显著
C
135.77
2
67.885
2.83

D
198.11
2
99.055
4.13
通常显著
由表2和表3可知，搜集量极差最大，其次是料液比和提取时间，故对于柴胡提取效果影响大小次序为B>D>C>A,因为A和C影响不显著，故综合考虑，选择最好提取方案为A1B1C1D3，即40℃浸渍，搜集100ml挥发油，8倍量含5% 氨水95%乙醇提取1h。
3.10最好方案验证试验
取50g柴胡粗粉置500ml圆底烧瓶中，在最好提取条件下提取。反复两次。验证试验结果见表4

表4 验证试验结果
Tab 4 Result of verification test
试验次数
挥发油吸收度
柴胡皂苷a含量
1
0.938
0.33
2
0.943
0.32
平均值
0.941
0.32
由表4可见，采取优化最好工艺提取有效成份柴胡挥发油和皂苷，其挥发油吸收度和柴胡皂苷a含量全部较高，且工艺条件稳定可靠，反复性好。
4 讨论
4.1 柴胡挥发油和柴胡皂苷为柴胡关键有效成份，二者提取是较为矛盾。据文件资料，柴胡皂苷在6h内稳定，而要完全提取挥发油则要较长时间。这将造成柴胡皂苷分解、降解等一系列不稳定反应，使柴胡皂苷含量降低。所以要同时兼顾挥发油和柴胡皂苷提取，可考虑采取水蒸气蒸馏法提取柴胡挥发油，采取碱性醇提工艺替换传统水提工艺提取柴胡皂苷。且在提取过程中发觉，柴胡皂苷a受热轻易分解，伴随加热时间增加，含量逐步降低，所以在各加热步骤，如提取，浓缩，干燥过程中应尽可能采取低温，以降低柴胡皂苷a损失。
4.2 中药成份复杂,应综合考虑各有效成份性质及其在制备过程中改变,以确保制剂质量和疗效。据文件资料，柴胡中含柴胡皂苷a大约在0.2～0.4%，从本试验最好工艺提取液中测得柴胡中柴胡皂苷a含量为0.32%，所以本工艺提取效果很好。至于挥发油含量，多种文件所得结果不尽相同，甚至相差10倍以上，因为药材原因，如药材部位，采收时间，产地等影响；难以衡量。所以本试验在不影响挥发油提取前提下还兼顾了柴胡皂苷a提取。从而为柴胡提取提供可靠依据和参考。
REFERENCES
[1] Ch.P Vol I（中国药典，一部）[S]. ：198.
[2]YANG Y. Chemical composition of natural medicine extraction and separation Manual (revised edition) [M].Beijing: China Publishing House of Chinese medicine(中国中医药出版社), ：612—615.