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1、氨基酸发酵工艺学关键点 2淀粉生产步骤 原料→清理→浸泡→粗碎→胚分离→磨碎→分离纤维→分离蛋白质→清洗→离心分离→干燥→淀粉 13在谷氨酸发酵中怎样控制细胞膜渗透性。 ①生物素亚适量②添加表面活性剂、高级饱和脂肪酸或青霉素③选育温度敏感突变株、油酸缺点型或甘油缺点型突变株 15谷氨酸生产菌育种思绪 （1）.切断或减弱支路代谢（2）解除本身反馈抑制(3).增加前体物合成 (4).提升细胞膜渗透性 (5).强化能量代谢(6).利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株 16现有谷氨酸生产菌关键有哪四个菌属。 棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中细菌 17谷氨酸发酵生产菌关键生化特点
2、 现有谷氨酸生产菌关键特征:（1）细胞形态短杆形、棒形；（2）革兰氏阳性菌，无鞭毛，无芽孢，不能运动；（3）需氧型微生物；（4）生物素缺点型；（5）脲酶强阳性；（6）不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白、明胶等；（7）发酵中菌体发生显著形态改变，同时细胞膜渗透性改变；（8）二氧化碳固定反应酶系强；（9）异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循环弱；（10）α-酮戊二酸氧化能力微弱；（11）柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶活性强；（12）含有向环境泄露谷氨酸能力；（13）不分解利用谷氨酸，并能耐高谷氨酸，产谷氨酸8%以上；(14)还原性辅酶II进入呼吸链能力弱（15） 利用醋酸
3、不能利用石蜡 22氨基酸生产菌菌种起源有哪些。 （1）向菌种保藏机构索取相关菌株，从中筛选所需菌株。 （2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。 （3）从部分发酵制品中分离目标菌株。 27谷氨酸发酵培养基包含哪些关键营养成份。 碳源 谷氨酸产生菌均不能利用淀粉，只能利用葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖。谷氨酸产量随糖浓度增加而增加 氮源 无机氮源: (1)尿素(2) 液氨(3)氨水 有机氮源:关键是蛋白质、胨、氨基酸等。谷氨酸发酵有机氮源常见玉米浆、麸皮水解液、豆饼水解液和糖蜜等。 无机盐 磷酸盐 硫酸镁 钾盐 微量元素 生长因子1) 生物素 (2)
4、维生素B1 29影响发酵产率原因有哪些。 培养基 碳源 氮源 无机盐 生长因子 温度（首先影响酶活性，其次影响生物合成路径，还影响发酵液物理性质） PH（影响酶活性，影响细胞膜所带电荷，影响培养基一些营养物质和中间代谢物离解，影响微生物对这些物质利用，PH改变一起菌体代谢路径改变使代谢产物发生改变） 供氧对谷氨酸发酵影响(谷氨酸生成期需大量氧) CO2对发酵影响（通常控制在13%左右，CO2含量判定发酵过程是否正常（1）提前发觉噬菌体感染 在通常规律通风下 CO2快速下跌说明污染噬菌体，菌体一死立即停止呼吸，不在放CO2（2）帮助发觉染菌感染 在正常规律通风条件下，CO2连续上升，
5、说明感染杂菌，须及早采取方法） 30谷氨酸发酵过程调整pH值方法 流加尿素、液氨、添加碳酸钙法。 31谷氨酸发酵不一样阶段对PH要求：前期pH7.3、中期pH7.2 、后期pH7.0 放罐pH6.8 32谷氨酸发酵时,出现泡沫过多,通常是什么原因,该怎样处理? 原因P92原因 (1)水解糖质量不好(2)染菌； 处理方法(1)改善水解糖质量(2)按染菌处理 33谷氨酸发酵过程，菌体生长缓慢或不长原因及处理方法？ 原因(1)感染噬菌体 (2)培养基贫乏(3)菌种老化 (4)前期风量过大,或初尿过多抑制生长 处理(1)按感染噬菌体处理(2)补料,并停搅拌(3)换种、补种(4)停搅
6、拌、小通风 34谷氨酸发酵过程，耗糖快,pH偏低, 产酸低原因及处理方法 原因(1) 培养基丰富,生物素过量 (2) pH低,流尿不立即(3) 通风不足,空气短路,搅拌转速低(4) 感染杂菌 处理方法(1)提升风量,提升pH(2)立即流尿,提升pH(3)提升风量,提升pH(4)按染菌处理 35谷氨酸生产菌最适生长温度为？发酵谷氨酸最适发酵温度？最适合生长pH为？P101 P84 谷氨酸产生菌：最适生长温度30~34℃ 最适产酸温度35~37℃ 最是适生长PH为6.5~8.0 36发酵过程中CO2快速下降，说明污染噬菌体， CO2连续上升，说明污染杂菌 37消泡方法有哪多个？
7、消泡方法（1）物理消泡 改变温度（2）机械消泡：消泡器（3）化学消泡 加消泡剂 天然油脂类 高碳醇脂肪酸和脂类 聚醚类 39噬菌体侵染异常现象 P114 “二高三低”即pH高、残糖高、OD值低、温度低、谷氨酸产量低 (1)二级种子污染噬菌体 二级种子0-3h感染噬菌体，泡沫大，pH高，种子基础不生长；6h以后感染噬菌体，泡沫多，pH偏高，种子生长较差，轻度感染或后期感染长看不出异常改变，可用快速检测法，半小时之内就能确定是否污染噬菌体。8~9小时感染，OD值不长，pH上升，泡沫增大，耗糖慢，不产酸等噬菌体污染现象 (2)发酵前期污染噬菌体 ①吸光度开始上升后下降，甚至4~8h内O
8、D值下跌到零以下 ②pH逐步上升，升到8.0以上，不再下降，CO2快速下降OD值下跌pH上升等 ③耗糖缓慢或停止，也有时会出现睡眠病现象，发酵缓慢，周期长，提取困难 ④产生大量泡沫，发酵液黏度大，甚至展现黏胶状，可拔丝，发酵液发红，发灰，有刺激性气味 ⑤谷氨酸产量甚少 ⑥镜检时可发觉菌体数量显著降低，菌体不规则，缺乏八字排列，发圆 ⑦平板检验有噬菌体斑，摇瓶检验发酵液清稀， ⑧二次种子营养要求逐步加多个龄延长 ⑨送往提取车间发酵液发红，发灰，有刺激性气味，黏度大，泡沫大 ⑩精制中和时色素深，泡沫大，碱加不进去，过滤困难 (3)发酵后期污染噬菌体 对产酸影响不大，甚至有时竟有
9、提升产酸趋势 40染菌分析 （1）从染菌时间分析： 早期：培养基灭菌不根本、种子带菌等； 中后期：设备渗漏、空气系统。 （2）从染菌类型分析： 耐热芽孢杆菌：灭菌不根本，净化空气带菌，设备渗漏； 无芽孢球菌、酵母等：设备渗漏。 （3）从染菌幅度分析： 部分罐：料液或设备灭菌不根本； 大面积罐：空气系统、种子、公用设备存在染菌。 41发酵染菌预防方法。 1．空气净化（1）降低滤前空气尘粒（2）降低滤前空气油水含量（3）确保压缩空气温度（4）妥善装填过滤介质（5）选择高效滤材（6）保持一定气流速度 2.培养基和设备灭菌（1）合理调配培养基（2）确保灭菌温度和时间（3）确保
10、设备无积污和渗漏（4）确保流动蒸汽质量（5）降低泡沫（6）正确进行空气保压 3.发酵设备安装（1）预防轴封渗漏（2）合理安装罐内设备（3）合理安装管路（4）阀门连接（5）管路部署（6）管路试漏（7）管路吹洗 4.培养物移接（1）严格进行斜面和摇瓶菌种无菌操作（2）严格进行种子罐无菌操作 42污染噬菌体后挽救方法 （1）并罐法（2）菌种轮换或使用抗性菌株（3）放罐重消法（4）罐内灭噬菌体法 43提炼概念P127 将谷氨酸生产菌在发酵过程中积累L-谷氨酸从发酵液中提取出来，再深入中和，除铁、脱色、加工精制成谷氨酸单钠盐（俗称味精）过程称为谷氨酸提炼 44生产上选择谷氨酸提取工艺标准是：工
11、艺简单、操作方便、所用原材料价格低廉，起源丰富、提取收率高、产品纯度高、劳动强度小、尽可能不造成或降低环境污染。 45谷氨酸提取关键方法有哪多个？ 1.等电点法2.离子交换法3.金属盐法4.离子交换膜电渗析法 46谷氨酸等电点法提取最终调PH为？3.0~3.2锌盐法提取谷氨酸最终调PH为？一步锌盐法 2.4 等电点锌盐法2.8 47影响谷氨酸结晶原因。 ①菌体② Glu含量③温度（温度越低，溶解度越小，有利于结晶）④加酸速度及放罐pH（操作时一定要缓慢，控制pH缓慢下降）⑤起晶方法（自然起晶和加晶种起晶）⑥搅拌（是液体不停翻动从而达成溶液温度和pH均匀一致）⑦残糖（在结晶时，这些残
12、唐会沉淀析出，这不仅增大谷氨酸浓度，轻易以β-型晶体析出）⑧其它副产物⑨杂菌和噬菌体⑩糖液质量⑾发酵液放罐pH（发酵后期pH偏碱或偏酸，对谷氨酸结晶很不利） 48Glu结晶有哪多个晶形，俗称轻质谷氨酸属于哪种晶形。 β-型晶体和α-型晶体 俗称轻质谷氨酸属于β-型晶体 α-型晶体理想结晶 避免形成β-型晶体 50离子交换树脂和这些离子交换能力各不相同，这关键取决于该离子相对浓度，和该离子对交换树脂亲和力。 强酸性阳离子交换树脂对谷氨酸发酵液中多种离子亲和力大小Ca2+>Mg2+>K+>NH4+>Na+>Ala>Leu>Glu>Asp 51离子交换树脂离交过程有五步，非别为？P1
13、45 （1） 溶液中谷氨酸离子经过溶液向树脂表面扩散 （2） 谷氨酸离子穿过树脂表面向树脂内部扩散 （3） 谷氨酸离子和树脂上活性基团可交换离子氢离子进行离子交换 （4） 交换下来氢离子从树脂内部像树脂表面扩散 （5） 氢离子从树脂表面扩散到溶液中 52结柱定义及离子交换树脂提取谷氨酸时，产生结柱现象原因及预防方法。 原因：（1）上柱液谷氨酸含量高（2）洗脱剂浓度高（3）树脂破碎或菌体等杂质干扰 预防方法：（1）调换破碎树脂（2）控制洗脱剂浓度（3）上柱完成，自来水反洗除菌体（4）结柱后，必需根本 处理树脂 53洗脱谷氨酸时，能够用NaOH或NaCl作为洗脱剂，也可混合使用。
14、55谷氨酸发酵废液关键成份。P199 （1） 无机盐，如钾离子，铵离子镁离子，还有残糖，色素等 （2） 菌体，蛋白质等固形物质悬浮物，其中湿菌体含量为50~80/L （3） 微量微生物代谢副产物，有机酸类，有乳酸，琥珀酸等， （4） 残糖10g/L一下 57味精生理作用 (1)合成其它氨基酸（2）作为脑组织能源（3）降低血液中氨中毒（4）转化为糖 58谷氨酸中和时中和剂选择和用量。 生产上要求使用含盐分少碳酸钠或固体氢氧化钠进行中和 中和时纯碱用量：1mol碳酸钠可中和2mol谷氨酸，即106g碳酸钠可中和147*2=294g谷氨酸即每种中和100g谷氨酸需要36.1g碳酸钠，
15、才能达成谷氨酸完全中和 59谷氨酸中和液中色素起源 淀粉制糖、培养基灭菌、发酵液浓缩等。 60谷氨酸中和液脱色方法有哪多个。活性炭脱色、树脂脱色 62制取谷氨酸钠需要活性炭脱色,脱色好坏和活性炭再生好坏直接相关,再生时需用NaOH和HCL处理目标是什么？氢氧化钠解吸附在炭中色素，4%氢氧化钠 盐酸解吸附在炭中铁离子4%盐酸P179~180 63谷氨酸中和液中铁离子起源及存在形式。 1.铁离子起源 原辅材料不纯、设备腐蚀而游离出来较多铁离子等 2.铁存在形式 Fe2+、 Fe3+ 64现在中国除铁、锌离子方法 .硫化钠法 .树脂除铁 65结晶过程分三个阶段，分别为：形成
16、过饱和溶液、晶核形成、晶体长大 66起晶概念及方法。 晶核形成叫做起晶 起晶方法 自然起晶 刺激起晶 晶种起晶 67饱和溶液、过饱和溶液和过饱和系数概念。P185 饱和溶液:晶体溶解和析出处于平衡状态，溶解速度=晶析速度 晶体大小基础不变，溶液浓度不变 过饱和溶液：晶体从溶液中析出，晶析速度>溶解速度，自然形成新晶核，而且晶粒能长大之至溶液降至饱和溶液 过饱和系数：过饱和溶液中溶质浓度同温度同条件下饱和溶液中溶质浓度之比 68工业上谷氨酸溶液浓缩得方法关键有？ 常压蒸发 减压蒸发 69饱和曲线和过饱和曲线将图分为三个区域，分别为：？析晶操作通常要求在那个区域？P1
17、86 稳定区 （不饱和溶液）亚稳定区（饱和溶液） 不稳定区（过饱和溶液） 析晶操作通常要求在不稳定区（） 70味精结晶具体操作过程可分为：浓缩、起晶、整晶、育晶、养晶等多个阶段。 71养晶作用。（1）溶解伪晶（2）调整浓度 72味精干燥方法有：箱式烘房、真空箱式干燥、气流干燥、传送带式干燥、震动床式干燥。 73味精溶解后浑浊原因及处理方法 （1）产生原因①硫化钠过量②消泡剂过量 ③含有DL-谷氨酸钠 ④原材料质量差 （2）处理方法①中和、结晶操作规范 ②控制硫化钠质量和用量③控制消泡剂用量 ④控制原材料质量 74味精带有颜色原因及处理方法 产生原因 味精发黄 料液脱色不根本
18、带有色素；味精分离不干，母液带入味精，使色素增加；味精干燥温度过高或过长，引发焦化变质；洗活性炭中残留谷氨酸钠时，将被吸附色素解析出来；烘盘布清洗不洁净，出现底层发黄 味精发红 母液除铁不洁净；母液接触铁器或味精将诶出铁器；活性炭再生不完全，铁离子没清除根本 味精发灰发青 发灰：活性炭带入味精中 发青：硫化钠过量 味精久放变黄 料液除铁不根本，带入成品；谷氨酸含残糖高，带入成品 处理方法 加强脱色操作；加强结晶操作，合理控制参数；加强分离操作；采取振动式干燥器；采取树脂除铁；提升谷氨酸质量；控制好硫化钠用量 75味精发臭原因及处理方法 产生原因：室内卫生差，母液染菌变
19、质，带入味精；活性炭渣子和洗水没立即处理，造成杂菌繁殖；母液存放时间长或存放母液容器长时间没用清洗，杂菌繁殖；全中和操作时泡沫溢出，回收时带入杂菌；湿谷氨酸堆放时间长，长菌霉变 处理方法 搞好环境卫生；母液和湿谷氨酸立即处理；设备立即清洗 76强力味精是哪些呈味核苷酸按不一样百分比和谷氨酸钠混合制成添加了 5′-鸟苷酸、5′-肌苷酸，或二者混合物 77脱敏作用定义 经特定处理后，不丧失酶活性而失去对变构效应物敏感性，称脱敏作用 78酶活性控制方法 终产物抑制或激活；辅酶水平活性调整；酶原活化；潜在酶活化 79氨基酸发酵代谢控制中，酶活性调整类型有哪些？P226 变构效应
20、 共价修饰寡聚酶解聚、蛋白质水解激活等 氨基酸生产方法 蛋白质水解、抽提法 以豆粕为原料，采取酸水解大豆蛋白方法来获取氨基酸。如早期味精生产方法。现在有用废蛋白质原料如动物毛发等水解法转为复合氨基酸。 化学合成法 该方法是20世纪50年代伴随石油化工工业发展而兴起，是利用有机合成和化学工程相结合来生产氨基酸。现在DL－蛋氨酸、甘氨酸、DL－丙氨酸等就采取此方法生产。 微生物发酵法 是借助微生物含有本身合成所需氨基酸能力，经过对菌株筛选、诱变处理及代谢过程调整来达成合成某种氨基酸目标。现在60％以上氨基酸是采取生物发酵法进行生产，其中产量最大是谷氨酸，其次是赖氨
21、酸。 酶法 利用微生物中特定酶作为催化剂，由底物经过酶催化生成所需产品。现在应用酶法生产氨基酸有10多个，如L－丙氨酸、L－色氨酸、L－丝氨酸等。 谷氨酸采取发酵法，多以淀粉为原料，少数用糖蜜 存在问题： 菌种性能：中国平均产酸水平为5%－6%，日本为10%－12%，日本糖酸转化率在55%左右，中国45%左右 工艺过程控制：中国采取低糖中糖发酵工艺，日本采取高糖发酵并实施流加糖工艺，同时提升罐压，确保溶氧供给从而提升了生产率。日本普遍对温度、压力、空气流量、pH、溶解氧采取计算机控制。 消耗：中国谷氨酸发酵粮耗平均在3t左右，国外为2t左右。水、电、汽消耗也较国外高
22、 生产规模：日本最大单罐体积达500m3,中国仅200m3,多数厂为50m3,小人有20m3 每立方米发酵罐年产量，日本为20t，中国为5－8t 污染：国外已普遍地对味精废液进行综合利用，中国在培养单细胞蛋白方面已取得成功，但应用不广。 生产方法关键是发酵法和酶法。发酵法是以糖蜜、淀粉为原料经微生物直接发酵而制得赖氨酸。酶法是以一些化工产品为原料，经酶转化而制得赖氨酸。 赖氨酸总产量65%、蛋氨酸63%和苏氨酸55%均为亚太地域国家所消费。 谷氨酸生产菌株形态及生理共性 细胞为球形、棒形或短杆形 革兰氏染色阳性，无芽孢，无鞭毛，不能运动 全部是需氧型 微生物 全部是生物素缺点
23、型微生物 发酵中菌体发生显著形态改变，同时发生细胞膜渗透性改变 中国谷氨酸生产关键菌株 天津短杆菌 (T613)及其突变株 钝齿棒杆菌(AS1.542)用其突变株 北京棒杆菌(AS1.299)及其突变株 北京棒杆菌(AS1299)形态和生理特征 (1) 形态特征 短杆至小棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝，呈多个形态。 单个、成对及“V”字形排列。 G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。 钝齿棒杆菌(AS1542)形态和生理特征 (1) 形态特征 短杆至棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝。 单个、成对及“V”字形排列。
24、 折断分裂。 G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。 天津短杆菌(T613)形态和生理特征 (1) 形态特征 经典短杆状，有时微弯曲，两端稍钝圆，不分枝。 单个、成对及“V”字形排列。 折断分裂。 G+。不运动。无芽孢。 北京棒杆菌(7338)和钝齿棒杆菌(B9)比较 天津短杆菌(T613)和钝齿杆菌(B9)比较 现在味精行业采取关键菌株 钝齿棒杆菌B9和天津短杆菌TG-866是中国味精行业生产上关键菌种。 二者融合子F263. 谷氨酸生产菌在发酵过程中形态改变
25、 细胞壁 à 细胞形态 + 生物素 à 细胞壁 选育细胞膜渗透性好突变株 抗VP类衍生物 选育对溶菌酶敏感突变株 选育二氨基庚二酸缺点突变株 选育温度敏感突变株 生物素：是脂肪合成中关键酶—乙酰CoA羧化酶辅助因子，生物素限量时，就会抑制脂肪酸合成，从而造成膜结构不完整。青霉素 诱变育种基础过程： 选择选择适宜出发菌株 制备待处理菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大试验 出发菌株： (1)要有一定目标产物生产能力 (2)对诱变剂敏感 (3)生产性能好，如生长快、营养要求低、产孢子多且早，最好是生产上自然选育菌株。 生物素降低1à草酰乙酸降低à乙酸降低à关闭DCA
26、 2à琥珀酸氧化酶能力低à 积累琥珀酸，阻遏异柠檬酸裂解酶，关闭DCA环。 黄色短杆菌中： 进入分解路径情况： 1 PEP浓度低（减弱亲和力）；2 TCA中间产物浓度高（反馈抑制，预防草酰乙酸过剩。 固定CO2情况：1 乙酰CoA浓度增加，和F16P共同激活PEP羧化酶；2 乙酰CoA氧化，产生ATP抑制丙酮酸激酶。 氨导入1α-酮戊二酸还原氨基化 2冬氨酸或丙氨酸经过氨基转移作用将氨基转给α-酮戊二酸 3谷氨酸合成酶路径：谷氨酸合成酶对NH4+亲和力更强，不受谷氨酸反馈抑制，当NH4+浓度低时循此路径。 1选育强化CO2固定反应突变株 选育在以琥珀酸为唯一碳源培养基上生长
27、快、大菌株 选育对氟丙酮酸敏感突变株 选育丙酮酸缺点、天冬氨酸缺点突变株4强化丙酮酸羧化酶基因 2选育减弱乙醛酸循环突变株 选育对琥珀酸敏感突变株 选育不利用乙酸突变株 经过基因工程技术使异柠檬酸裂解酶活力降低 3选育强化TCA中柠檬酸至α-酮戊二酸代谢突变株 选育柠檬酸合成酶强突变株 选育抗氟乙酸、氟化钠、氮丝氨酸和氟柠檬酸突变株 4选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调整突变株 选育抗酮基丙二酸抗性突变株 选育耐高谷氨酸突变株 选育抗谷氨酸结构类似物突变株 选育抗谷氨酰胺突变株 5选育强化能量代谢突变株 选育抗呼吸抑制剂突变株 选育抗ADP磷酸化抑制剂突变株
28、选育抗抑制能量代谢抗生素突变株 6选育减弱HMP后段酶活突变株 选育莽草酸缺点型或添加芳香族氨基酸能促进生长突变株 选育抗嘌呤、嘧啶类似物突变株 选育抗核苷酸类抗生素突变株 谷氨酸菌种扩大培养 斜面菌种 斜面培养基必需有利于菌种生长而不产酸，要求斜面菌种绝对纯，培养条件有利于菌种繁殖，培养基以多含有机氮不含或少含糖为标准。 斜面菌种不宜数次移接，通常只移接三次。常常进行菌种分离纯化，提供新菌株供生产使用。 一级种子培养 一级种子培养目标在于大量繁殖活力强菌体，培养基组成应少含糖分，多含有机氮。培养条件有利于长菌。 二级种子培养 影响种子质量关键原因 培养基组成 培养
29、基营养易于被菌体直接吸收和利用，营养成份要合适地丰富和完全，氮源和维生素含量较高，碳源含量少，能够使菌丝粗壮并含有较强活力。其次，种子培养基应尽可能和发酵培养基靠近，以适合发酵需要。 温度 pH 溶解氧浓度 前期需氧量少，后期需氧量多 接种量 种龄 谷氨酸代谢路径 菌体代谢调整异常化 在累积谷氨酸时需限制培养基中生物素添加量 菌体形态有显著差异 生产发酵条件控制是关键 在最适条件下，谷氨酸产生菌可把60%以上葡萄糖转化为谷氨酸，而只有极少许副产物。 培养条件不宜，得大量菌体或转换为乳酸、琥珀酸、α－酮戊二酸等。 发酵培养基对谷氨酸发酵影响 斜面菌种培养
30、目标：纯菌生长繁殖 方法：多含有机氮，不含或少含糖 一级种子培养 目标：大量繁殖活力强菌体 方法：少含糖分，多含有机氮，培养条件有利于长菌。 二级种子培养 目标：取得发酵所需足够数量菌体 为发酵培养基配制标准 供给菌体生长繁殖和谷氨酸生产所需要适量营养和能源 原料起源丰富，价格廉价，发酵周期短，对产物提取无妨碍等 碳 源 现在采取谷氨酸产生菌均不能利用淀粉，只能利用葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖等，有些能利用醋酸、乙醇、正烷烃。 常采取淀粉水解糖，要求淀粉水解完全，但要避免水解时间过长。不一样淀粉原料中生物素含量不一样，会影响生物素含量。 糖浓度对发酵影响 一定范围内g
31、lu产量随糖浓度增大而增大 糖浓度过高时，渗透压增大，对菌体生长和发酵不利，当工艺配合不妥时，转化率低 糖浓度过高时，氧溶解阻力大，影响供氧效率。 发酵糖浓度选择 通常控制在125－150g/L，产酸55－70g/L 采取一次高糖发酵工艺（糖浓度170－190g/L），产酸可达80g/L。因为渗透压大，影响菌体生长，使发酵周期长，产酸不易稳定。 流加低浓度糖发酵工艺 氮源是合成菌体蛋白质、核酸和生成谷氨酸氮起源，在发酵过程中一部分氨用于调整pH值，形成谷氨酸铵盐。 谷氨酸发酵氮源（碳氮比为100：15－30）比其它发酵工业（碳氮比为100：0.2－2.0）高。 当碳氮比在10
32、0：11以上才开始累积谷氨酸，在谷氨酸发酵中，用于合成菌体氮 仅占总耗用氮3－8%，而30－80%用于合成从谷氨酸。 在实际生产中用尿素或氨水作氮源时，因为一部分氨用于调pH,部分分解而逸出，使实际用量增大，培养基中糖浓度140g/L,总尿用量为38.5g/L，碳氮比为100：32.8。 不一样发酵阶段对氮源要求 在长菌阶段，NH4＋过量会抑制菌体生长。 在产酸阶段，NH4＋不足会积累α－酮戊二酸。 氮源种类及添加方法 氮源分类 有机氮（蛋白质、胨、氨基酸等，谷氨酸发酵有机氮源常见玉米浆、麸皮水解液、米糠水解液、豆饼水解液和糖蜜等） 无机氮（尿素、液氨、氨水、碳酸氢铵、硫酸铵、
33、氯化铵和硝酸铵等） 菌体利用无机氮比有机氮快速，铵盐、尿素、氨水等比硝基氮优越，因为硝基氮需先经过还原才能被利用。 添加方法： 铵盐、液氨等可采取流加方法，液氨作用快，采取连续流加，尿素少许数次分批流加。 用硫酸铵等生理酸性盐为氮源时，因为铵离子被利用而残留SO42-等酸根，使PH下降，需在培养基中加入碳酸钙以自动中和pH。但添加碳酸钙易形成污染，生产上通常不用此法。 无机盐 功效 组成菌体成份、酶组成成份、酶激活剂或抑制剂、调整培养基渗透压、调整pH和氧化还原电位等。 微生物对无机盐需要量极少，但无机盐对菌体生长和代谢产物生成影响很大 微生物所需要无机盐 硫酸盐、磷酸盐、
34、氯化物和含钾、钠、镁、铁化合物 微量元素：如铜、锰、锌、钴、钼、碘、溴等 1. 磷酸盐 功效 蛋白质和核酸组成成份，ATP、ADP是关键能量传输者，参与一系列代谢反应 缓冲作用 需要量：0.005－0.01mol/L.需三水磷酸氢二钾1-1.5g/L,十二水磷酸氢二钠1.7-2.0g/L 起源： 磷酸盐。 玉米浆、糖蜜、淀粉水解糖等原料中还有少许磷。 磷量对谷氨酸发酵影响：磷浓度过高时，菌体代谢转向合成缬氨酸，磷含量过低时，菌体生长不好。 2. 硫酸镁 功效 叶绿素组成成份。 镁离子是很多关键酶（如己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）激活剂。假如镁离子太少会基质
35、氧化速度降低，谷氨酸生成量降低。 G+对镁离子最低要求量是25ppm。G-为4－5ppm，添加七水硫酸镁0.25-1g/L时，镁离子浓度为25-90mg/Kg 硫是含硫氨基酸组成成份，组成酶活性基团。培养基中硫酸镁供给硫已充足，不需另加。 3. 钾盐 很多酶激活剂,钾盐少长菌体，钾盐足够产谷氨酸。 谷氨酸发酵产物生成期需要钾盐比菌体生长久高。 菌体生长久需硫酸钾量约为0.1g/L,谷氨酸生成期需硫酸钾量为0.2－1.0g/L. 微量元素 微量元素是指微生物需要量十分微小，但又不可完全没有元素 锰是一些酶激活剂，羧化反应必需锰，如谷氨酸生物合成路径中，草酰琥珀酸脱羧生成α-酮戊
36、二酸是在锰存在下完成。 铁是细胞色素氧化酶、过氧化氢酶成份，还是另外部分酶激活剂。 汞、铜离子含有显著毒性，抑制菌体生长和谷氨酸生成，所以必需避免有害离子污染。 温度对谷氨酸发酵影响 酶活 改变生物合成路径，使代谢产物发生改变 改变发酵液物理性质 影响菌种对营养物分解和吸收 不一样微生物最适生长温度不一样 同一个微生物，菌体生长和产物合成最适温度不一定相同 pH对谷氨酸发酵影响 酶活性 影响微生物细胞膜所带电荷，改变细胞膜渗透性 影响物质分解速率，影响微生物对培养基物质吸收利用 改变菌体代谢路径，使代谢产物发生改变。 比如 中性和微碱条件下积累谷氨酸，在酸性条件下
37、形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。 谷氨酸发酵pH控制 菌种（通常pH6.5-8.0） 黄色短杆菌672为PH7.0-7.5 AS1.299为pH6.0-7.5 T6-13为PH7.0-8.0。 发酵阶段 前期7.3左右 偏低，菌体生长旺盛，消耗营养物质快，菌体正常代谢，繁殖菌体而不产谷氨酸。 过高，抑制菌体生长，糖代谢缓慢，发酵时间延长。 中期pH7.2左右，发酵后期pH7.0，在快要放罐时，为了后工序提取谷氨酸，pH6.5-6.8为好。 发酵过程pH值调整方法 添加碳酸钙法 (适适用于采取酸性铵盐作为氮源工艺) 尿素流加法(小试或中试) 优点:尿素分解、利用及p
38、H值改变含有一定规律性，易控制。 依据 时期 外观表现 菌种 避免波动，努力争取稳定。 液氨或氨水添加法(主流) 作用快而显著 易于实现连续自动流加。 供氧对谷氨酸发酵影响 临界溶解氧浓度 好气微生物对培养液中溶解氧浓度最低要求，在某一浓度以下，微生物呼吸速率随溶解氧降低而显著下降，此溶解氧浓度称为临界溶解氧浓度。 在临界氧浓度以下，氧成为微生物限制性基质，微生物耗氧速率符合Michaelis-Menfen方程。 从微生物生理学考察发酵供氧问题 氨基酸代谢氧关键性： 经过好气性能量代谢产生菌体生长和氨基酸生物合成所需ATP 氨基酸生物合成过程中产生还原性辅酶需氧
39、来氧化。 多种氨基酸生物合成时需要ATP和产生还原性辅酶量不一样，以此数据为基准，推断氨基酸发酵通风量很有意义。 v 不一样代谢路径产生不一样数量NAD(P)H，再氧化所需要溶氧量不一样。供氧大小是和产物生物合成路径相关。 第一类包含谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和脯氨酸等谷氨酸系氨基酸，它们在菌体呼吸充足条件下，产量才最大，假如供氧不足，氨基酸合成就会受到强烈抑制，大量积累乳酸和琥珀酸。这类氨基酸经过乙醛酸循环和磷酸烯醇式丙酮酸羧化系统两个路径形成，产生NADH量最多。 第二类包含异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸和天冬氨酸等天冬氨酸系氨基酸，供氧充足可得最高产量，但供氧受限，产量受影响并不显著；其
40、合成路径是产生NADH乙醛酸循环或消耗NADH磷酸烯醇式丙酮酸羧化系统，产生NADH量不多，所以和供氧量关系不显著。 第三类有亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸 ，不经过TCA循环，NADH产量极少，过量供氧，反而起到抑制作用。肌苷发酵也有类似结果。 不一样发酵阶段供氧需求P96 在菌体生长久，供氧不足时，菌体生长受到抑制，积累乳酸，菌体收率少；但过高氧水平会造成浪费，抑制菌体生长，在高氧水平下生长菌体不能有效地合成谷氨酸。 谷氨酸生成期，在细胞最大呼吸速率时，谷氨酸产酸量最大。所以，在谷氨酸生成期要求充足供氧，以满足最大呼吸需氧量。 供氧和其它发酵工艺条件关系 培养基营养丰富，糖浓度高，生
41、物素含量高，需氧量大。 培养基浓度大，氧传输阻力大，需要增加供氧。 生物素浓度浓度增加，耗糖速度增大，需要增加供氧。 采取间断或连续测定排气中CO2浓度方法调整通气量，满足供氧需求。以13%为分界点。有利于发觉噬菌体感染 发觉杂菌污染 利用溶氧改变自动控制补糖速率，间接控制供氧速率和pH值，实现菌体生长、溶氧和pH值三位一体控制体系。 除控制补料速度外，在工业上，还可采取调整温度(降低培养温度可提升溶氧浓度)、液化培养基、中间补水、添加表面活性剂等工艺方法，来改善溶氧水平。 泡沫对发酵影响 泡沫过多会引发大量逃出发酵液而造成浪费和污染 泡沫上升到罐顶时，可能从轴封渗漏，造成
42、浪费和污染 泡沫过多就会降低发酵罐装填系数，降低设备利用率 泡沫过多影响通气搅拌效果 当泡沫稳定时，代谢气体不能立即排出，影响菌体正常呼吸作用，甚至使菌体自溶 形成：气液两相共存(泡沫分散相是空气和二氧化碳，连续相是发酵液)，有能降低液体表面张力物质存在。具体包含： 物质条件：蛋白，黏度增大可使之更稳定。 操作：通气、搅拌 泡沫稳定性取决于 液体表面张力，粘度。 泡沫表面积、温度、pH、溶液浓度。 分类 表面泡沫 内部泡沫：出现在粘稠发酵液中，当谷氨酸发酵感染杂菌和噬菌体等不正常发酵时就形成这种泡沫。 泡沫消除方法 物理方法(经过改变温度使泡沫破裂) 机械消泡：
43、耗式消泡器，离心式、刮板式、蝶片式 优点：不城在发酵液中加其它物质 缺点：不能从根本上消除引发泡沫稳定原因，消泡效果不如这消泡剂快速可靠，需一定设备和消耗动力。 化学消泡： 优点：消泡效果好，作用快 缺 点：需消泡剂 ，存在影响菌体生长或代谢产物积累可能，增加了染菌机会，影响氧传输。 消泡剂消泡机理 破泡：降低表面张力 抑泡：抑泡剂分子优先被吸附，除去发泡剂吸附层，使表面粘度局部地方显著降低。 选择标准： 消泡剂必需是表面活性剂，含有较低表面张力 消泡剂对气-液界面铺展系数必需足够大，含有一定亲水性 在水中溶解度极小，保持持久消泡或抑泡作用 无毒 不干扰溶解氧、pH
44、等测定仪表使用，不影响氧传输 含有良好热稳定性 起源方便，价格廉价 常见消泡剂 天然油脂(消泡活性差、用量多，通常为发酵液0.1-0.2%). 种类：花生油最好，米糠油最差 新鲜程度：油脂新鲜，所含天然抗氧化剂多，过氧化物少，酸价低，消泡能力强。 生物素含量 聚醚类 醇类(十八醇) 硅酮类 谷氨酸发酵过程中关键改变及中间代谢控制方法 以糖蜜为原料发酵生产谷氨酸，可省去淀粉水解工艺，降低成本，节省能源,常采取大种量（10%左右）、添加青霉素或表面活性剂，低糖流加发酵，有利于产酸和转化率提升。 甜菜糖蜜添加吐温发酵工艺 工艺特点：高生物素、大接种量、添加表面活性剂(吐温
45、60)，产谷氨酸高、转化率高。 基础原理 发酵期间，向发酵培养基中添加吐温-60，高级饱和脂肪酸(C16-18)及其亲水醇酯类，对脂肪酸合成有拮抗作用，控制磷脂合成，形成不完全细胞膜，谷氨酸向膜外泄漏能力增强。 在生产过程中，必需控制好添加吐温-60、饱和脂肪酸等拮抗物质时间和浓度，通常在发酵阶段对数生长久早期(4-5h)添加。 发酵工艺控制关键点 添加吐温-60时间和添加量：4.5h,添加0.2% 接种量： 接种量少，菌体增殖缓慢，吐温添加时间延长，发酵周期长； 接种量过多，菌体繁殖快速，营养消耗快，产酸期缩短，后期产酸速度不高。4%-5% pH控制：整个发酵过程中pH不
46、低于6.4,控制在6.5以上。若低于6.4产酸率、产酸速率显著下降；发酵后期，pH若高于7.0，OD值下降，菌体发生自溶。 温度控制：WTH-1发酵过程中温度控制条件为：0-12h，30-33℃； 12-24h，33-34℃； 24-36h，34-35℃。发酵前期温度必需稳定，不然菌体生长受影响。 风量控制：采取梯形通风控制，分3级或4级提风，达最高风量后维持10h，再分3级4级降风。生产过程中，依据生产菌在发酵过程中代谢特点及其改变，由排气中CO2含量，反馈控制通气强度，实现排气中CO2含量恒定(13%左右)。 放罐处理：添加吐温60发酵生产谷氨酸，细胞有很好渗透性，残糖降至1.3%-
47、1.4%时，采取合适工艺条件，充足发挥残余酶活，使糖氧化中间产物继续转化。在放罐前1-2h，采取低通风（或停搅拌保压）、合适温度、合适pH，可取得很好效果 添加青霉素可抑制糖肽转肽酶，阻止细胞壁肽聚糖生成，使谷氨酸生产菌形成不完全细胞壁，造成细胞膜不完全。 甘蔗糖蜜添加青霉素流加糖发酵 添加青霉素时间和浓度是关键，因菌种、接种量、培养基组成和发酵条件而异。 发酵控制剂：发酵3.5-5h，添加3-5U/mL青霉素以后，视OD值净增、菌体有否变形、耗糖等情况，考虑是否需再补加一次或两次青霉素 发酵过程中用液氨控制pH6.7-7.0 添加青毒素时间和量 青霉素必需在细胞对数生长久早期加
48、入，确保在加入青霉素后，菌体培增，由长菌型细胞向产酸型细胞转化。生产过程中，在添加青霉素前u半小时，每隔5min测一次OD、粘度、菌体重，当△ＯＤ为０.35-0.4时加入，最终△ＯＤ为0.8左右。当接种量为10%时，在发酵3-4.5h加入，当接种量为20%时，在发酵2.5-3.5h加入。加入剂量为3-5U/mL。有时需要补加1-2次适量青霉素。 通风控制 经过测定溶解氧、排气中CO2、排气中O2等参数，来调整通气量、搅拌转速等。可用控制排气CO2为12%-13%来调整风量。梯形控制通风，分3-4次提风，最高风量维持10h左右，再分3-4次降风。最高风量比一次糖发酵法高50%-100%.
49、温度控制 开始控制温度30-32℃，以后每隔5-6h升一度。发酵前期温度不能过高。 pH控制 用液氨调整pH6.7-7.0，停止流加糖后，残糖降至2%左右，pH不低于6.7，不再加液氨。 流加糖 发酵初糖8%，接种量10%，发酵3.5-5h后添加青霉素3-5U/mL；发酵8-10h，当残糖降至４％时，开始流加含糖50%甘蔗糖蜜，至总糖浓度达20%（发酵时糖浓度一直保持在4%左右），产酸10%以上，转化率50%-55%，发酵周期30h左右。 工艺特点 发酵稳定，较粗放，不易染菌，产酸时间提前，发酵周期缩短(30h左右) 初糖8%，渗透压低，粘度小，氧传输系数大，有利于菌体生长和胞
50、内谷氨酸向胞外渗透，且谷氨酸合成酶系酶活均显著提升，直到发酵终了时仍能保持较高水平 低糖流加工艺，接种量大，缩短了长菌期和发酵周期。 产酸率、转化率和设备利率高 甘蔗糖蜜预处理 水解脱除、脱钙： 含糖分45%-55%糖蜜稀释à蒸汽加热à泥渣分离机或沉淀槽分离杂质à 蒸汽间接杀菌à 冷却入罐发酵 低糖流加工艺及后期补糖工艺 关键点： 流加入发酵罐糖浓度必需是高浓度 提升流加糖占总糖百分比； 将摄氧率（通风）和补料速率关联； 经验：时间选择发酵中前期，即在12-14h时开始流加，此时残糖3%-5%，尽可能使流加糖和耗糖速率保持平衡。 采取温度敏感突变株发酵生产谷氨酸机理
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