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3种5RACE技术的比较与优化 【摘要】 目的 研究环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法和SMART反转录酶法3种常用5RACE的技术的特点，并对它们进行了优化。方法 以播娘蒿RNA为模板，先按文献标准方法进行5RACE，然后通过增加反应时间，提高部分反应物浓度等方法进行优化。结果 未优化前环化法和TdT酶法条带几乎不可见，SMART反转录酶法隐约可见条带，但不清晰。优化条件后，环化法出现弥散条带，TdT酶法胜之，但条带依旧弥散，而SMART反转录酶法最佳，获得清晰特异性条带。结论 SMART 5RACE效果最好，其次为TdT酶法，环化法效果有待改进，同时通过优化条件可以明显增加产物的特异性，为实验研究中5RACE方法的选择提供了依据。【关键词】 5RACE；比较；优化 Abstract：Objective To study the characters of Cycling 5RACE,TdT 5RACE and SMART 5RACE methods and optimizeStandard 5RACE ways were done at first with RNA templet of Descurainiathey were optimized with delaying the reaction time and increasing the concentrations of someBefore optimized,the gel-straps in Cycling 5RACE and TdT 5RACE weregel-strap in SMART 5RACE could be found but notoptimized,dispersed gel-straps appeared in Cycling 5RACE,the result of TdT 5RACE was better and stillbest was SMART 5RACE,which got the clear and specificThe result of SMART 5RACE was best,TdT 5RACE was better,and Cycling 5RACE way was still underoptimization,the specificity of the results could be obviouslyprovided bases for choosing of 5RACE methods in research. Key words:5RACE;comparison;eptimization 经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病，即实验操作繁琐，周期较长、工作量繁重，且不易得到全长cDNA序列。近年来随着PCR技术的快速兴起和成熟，cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)为简洁方便的基因克隆发展道路指出了新的方向。RACE是利用PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA末端的方法，又称为锚定或单边PCR，一般有两种RACE方法，分别用于扩增3端或5端。5RACE比3RACE更具有挑战性，其特异性较低，产物可能是单一产物、多个产物，甚至是不能分辨的连续条带。最终质量取决于扩增所使用锚定引物的特异性、目的mRNA 5端结构的复杂度和丰度及产物的长度等因素。可利用巢式引物扩增，增加逆转录保温温度和PCR退火温度，降低扩增反应中的镁离子浓度等方法增加5RACE的特异性。本试验通过利用5RACE技术获得播娘蒿CBF基因的5端序列，对常用的环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法1及SMART反转录酶法2,33种5RACE方法进行比较和优化。 1 试验材料 模板 播娘蒿在25下生长30 d后，将完整植株放置于4下冷驯化12 h后，取其叶片提取RNA。 引物设计与合成 根据已知播娘蒿CBF基因的EST序列，设计5RACE反应所需引物。由于不同的原理，5RACE有3种克隆扩增方法，因此根据不同的方法设计5RACE引物DK 01、DK 04、DK 05、DK 06。此外合成RACE通用引物Oligo dT-3sites Adaptor Primer、3sites Adaptor Primer、5-CDS Primer、SMART II oligo、UPM和NUP。引物合成及测序由上海博亚生物工程公司完成。 2 试验方法 环化法 利用Takara公司的5- Full RACE Core Set 首链cDNA的合成 反转录体系l 10RT Butter， l RNase Inhibitor，1 l AMV Reverse Transcriptase XL，1 l 5端磷酸标记反转录引物，5 l总RNA，再加入RNase Free dH2O至总体积15 l。反应条件为30反应10 min，50反应1 h，80反应2 min。RNA的分解 反应体系15l cDNA反应液，15 l5Hybrid RNA Degeneration Buffer，再加入d H2O至总体积75 l。将上述反应液加入1l RNase H，30反应1 h；再加入100 l灭菌蒸馏水，500 l无水乙醇混匀后-20沉降30 min；12000 r离心10 min后去上清，用500 l 70%乙醇洗涤后干燥。通过连接反应将单链cDNA环化 向干燥的单链cDNA中加入8 l的5RNA(ssRNA)Ligation Buffer和12 l的d H2O溶解，再加入20 l的40%PEG#6000均匀混合，再加入1 l T4 RNA Ligase，16反应24 h。PCR反应 将上述反应液作为模板，以DK09与DK05为引物，用Ex Taq酶PCR，体系与反应条件与相同，反应中退火温度为60； 将第一次PCR反应液稀释10倍后作为模板，以DK 04与DK 06为引物，用Ex Taq酶进行第二次PCR，反应体系和条件如前，仅条件中的退火温度改为50。将第二次PCR产物电泳观察结果。 末端脱氧核糖核酸转移酶法 利用Takara公司的AMV Reverse Transcriptase 首链cDNA的合成 将14 l的RNA与 l的引物DK01和1 l的RNase inhibitor混合均匀，70放置10min后冰浴1min，短暂离心；随后加入 l的10RT Buffer， l的dNTP Mixture和 l的DTT(100 mmol/L)，加去RNase水至总体积24 l，混匀后42放置1 min，再加入1 l的AMV Reverse Transcriptase XL，55下反应2 h，再70处理15 min后，短暂离心。RNA的降解和cDNA的纯化 将前一步得到的25 l cDNA和1 l的RNase混合，37下放置30 min；随后加入80 l无水乙醇沉降18h，12000 r离心10 min后去上清，加入100 l的70%乙醇洗涤干燥，加入20 l ddH2O溶解。cDNA末端加尾 反应体系5 l 5TDT Buffer，15 l cDNA， l %BSA， l dATP，加入ddH2O至总体积24 l。将上述反应液94处理23 min后冰浴1 min，加入1 l TdT，37放置12 h，然后65处理10 min，冰上冷却后短暂离心。PCR反应 以上一步获得的反应液为模板，以DK01和Oligo dT-3sites Adaptor Primer为引物，用Ex Taq酶PCR，反应中退火温度为50，扩增15个循环；将第一次PCR的反应液稀释10倍为模板，以DK09与3sites Adaptor Primer为引物，用Ex Taq酶进行第二次PCR，反应中退火温度为60，扩增30个循环。将第二次PCR产物电泳观察结果。SMART反转录酶法 利用CLONTECH公司的SMART 5RACE反转录酶PowerScriptTM Reverse Transcriptase特殊的反转录能力进行5末端的扩增。 首链cDNA的合成 将2 l的RNA与1 l的5-CDS Primer、1 l的SMART II oligo和 l的RNase inhibitor混合均匀，70放置5 min后冰浴2 min，短暂离心；随后加入2 l的5First-Strand Buffer，1 l的dNTP Mix和2 l的DTT(100 mmol/L)，混匀后再加入1 l的PowerScriptTM Reverse Transcriptase，55下反应90min，加入50 l的Tricine-EDTA Buffer稀释，再72处理7 min后，短暂离心。PCR反应 将前一步获得的反应液为模板，以DK01和UPM为引物，用Ex Taq酶PCR，反应条件94变性5 min；94反应30 s，72反应3 min，进行5次循环；94反应30 s，70反应30 s，72反应2 min，进行5次循环；94反应30 s，68反应30 s，72反应2 min，进行25次循环；然后72延伸10 min。 将第一次PCR的反应液用Tricine-EDTA Buffer稀释100倍为模板，以DK09与NUP为引物，用Ex Taq酶进行第二次PCR，反应条件94变性5 min；94反应30 s，68反应30 s，72反应2 min，进行20次循环；然后72延伸10 min。将第二次PCR产物电泳观察结果。 3 结果与分析 环化法5RACE 利用环化法5RACE技术PCR的结果如图 1 中的A道，在1%琼脂糖凝胶电泳中几乎看不见目的大小条带，甚至是成型条带的出现，仅仅能够模糊的观察到一些弥散的扩增产物。没有出现目的大小扩增片段的原因可能是播娘蒿CBF mRNA反转录出的首链cDNA自身形成了高级结构，不适合RACE反应中关键的环化反应的进行，从而导致后期的特异引物扩增无法进行下去。至于模糊的弥散扩增产物可能是由于模板使用的总RNA中包含了播娘蒿几乎全部的遗传信息，特异性引物与其它基因非特异性退火扩增造成的。 末端脱氧核糖核酸转移酶(TDT酶)法5RACE TDT酶法5RACE技术PCR电泳结果如图2中的A道，在1%凝胶电泳中可以观察到一条弥散的扩增条带，大约在400500 bp之间的位置可以隐隐约约地分辨出一条较亮的条带，但是由于处在弥散的扩增产物条带中，无法进行胶回收测序。弥散扩增产物的出现可能有多个原因，除了由于模板使用总RNA导致背景较为复杂，Oligo dT退火温度较低易形成错误扩增的因素外，最大的可能是由于mRNA 5端的结构复杂，GC含量高，易形成二级结构，进而导致反转录出的首链cDNA长短不一，之后TDT酶进行加尾时在所有的cDNA 3末端都加上了一条ploy A尾。而较短的cDNA相对于较长的cDNA更容易进行PCR扩增，因此导致后面的扩增出现弥散的条带。SMART反转录酶法5RACE 利用SMART反转录酶进行5RACE技术PCR电泳结果如图3中的A道，在1%凝胶电泳中可以明显观察到450bp左右的扩增条带，同时几乎没有非特异性扩增。导致5RACE结果良好的原因除了由于SMART反转录酶本身的特性导致反转录到mRNA 5末端才加上同聚尾的酶活性质外，还因为同聚尾与多聚引物采用G/C配对，这样后期的PCR中可以使用较高的退火温度，从而减少了引物与模板之间发生的非特异性扩增。 4 讨论 5RACE方法的比较 通过分子克隆技术获得未知mRNA的5端序列不容易取得成功。通常存在于cDNA基因文库中的部分克隆，由于反转录酶未能沿全长mRNA模板延伸完全，或起始mRNA模板过长或模板二级结构含量过高，导致合成的cDNA第一条链往往5端不完整4。以往研究者们通过调整试验条件反复筛选cDNA文库来获得全长的cDNA克隆，但经常试验结果令人失望。这种技术的唯一出路在于重新构建与筛选额外的cDNA文库，复杂又繁琐。1988年Frohman等提出了RACE技术，为获得mRNA的5端序列提供了新的方法。 利用环化法5RACE技术的原理即反转录后先用基因特异性引物PCR 扩增目的cDNA，接着在T4 RNA连接酶催化下使第一条cDNA 链环化，将得到的单链DNA做为模板， 用基因特异性引物进行PCR扩增5端。因为这种方法的引物都是基因特异性的，所以非特异PCR产物基本上不会产生。但是在这种方法至关重要的关键性的环化中，可能由于mRNA的5端结构复杂，导致合成的第一条单链cDNA的3端易形成高级结构，从而很容易导致环化反应失败。 末端脱氧核糖核酸转移酶法5RACE技术原理即利用序列特异性引物1反转录总RNA，然后分离纯化反转录产物，用脱氧核糖核酸末端转移酶(TDT)给反转录的首链cDNA加上polyA尾，以Oligo(dT)-Adaptor为引物合成第二条cDNA链。然后用接头引物Adaptor和位于延伸引物序列上游的序列特异性引物2进行PCR扩增。 SMART反转录酶法的5RACE技术原理基本上与末端脱氧核糖核酸转移酶法相似，如图4。利用3末端序列引物5-CDS Primer反转录总RNA，与TDT法不同的是，SMART反转录酶自身有个特性，即当反转录到末端的时候，也就是RNA/DNA双链结构末端的时候，它会自动在DNA链末端加上3个G。然后通过与接头引物SMART II-oligo结合继续延伸。以SMART II接头部分的引物的Long UP扩增第二条cDNA链，随后再以序列特异性引物GPS1和与Long UP接头部分互补的引物Short UP进行PCR的扩增阶段。 三种方法比较而言，除了RACE的共通优势和缺陷外，各有各自的好处和不足。环化法5RACE技术的优点在于得到的非特异性PCR产物会比较少，因为它采用的引物都是序列特异性的。但是它有个最大的缺点就在于环化反应，如果扩增基因的5端结构复杂或者二级结构比较多，会导致环化反应的失败，无法扩增目的条带。末端脱氧核糖核酸转移酶法5RACE技术不存在环化的问题，整个方法经济便宜，但是也有不足。因为它使用的是TDT来进行poly dA加尾技术，一来poly dA与oligo dT的结合温度不高，PCR过程中容易出现错误扩增；二来TDT的连接效率很差，不容易加上poly dA尾。SMART反转录酶法5RACE技术克服了上述缺点，它用G/C配对替代了A/T配对，利用反转录酶自身加上末端多聚体，但是它的缺点就在于价格过于昂贵，试验成本增加，而且对RNA质量要求很高。我们在具体试验中可以通过模板不同的性质和要求，选用不同的方法并对其进行适当的改进。 5RACE技术的优化改进 尽管5RACE的方法很有实用价值，但是许多研究中都观察到，要成功地应用这项技术还是很困难的。RACE技术的整个操作过程虽然非常简单，但是每个步骤都可能使其受到影响导致扩增失败。一般说来，失败的主要原因有两个。第一是反转录、加尾和PCR这三个连续的酶反应过程；第二是即使酶反应步骤能顺利进行，但常常会产生大量的非特异性或截短的产物背景。因此，自RACE技术出现及发展，一直都伴随着对RACE的各个步骤的改良。 反转录失败原因是因为在5RACE过程中，有时候会产生截短的cDNA，它具有与全长分子同样的末端，如一条引物在它们的3末端，而同聚物尾在它们的5末端。由于截短的cDNA在后继的PCR中会优先扩增，因此反转录应尽量避免产生不完整的cDNA。解决方法有二：第一，尽量保证获得高质量RNA，提高RNA的质量，为反转录提高良好的模板。第二，如果模板有较高的GC/AU比值，那么它比较容易在反转录过程中形成二级结构产生截短的cDNA。最好的解决方法是利用能在高温下进行有效反转录的嗜热DNA多聚酶进行反应。后期PCR结果失败的主要原因则是因为反转录的模板是总RNA，理论上它包括了试验材料所有的基因信息，导致扩增引物错误配对，导致扩增出不相干条带信息。因此我们常常在注意设计高退火温度扩增引物同时，还在第一次PCR后采用巢式PCR以减少非特异性产物的产生。 以上是RACE技术所需要的共同的常用改良方法，针对此三种RACE技术，针对它们不同的特点进行了不同的改进。 环化法5RACE技术中最关键的一步就在于通过连接酶使单链cDNA环化。由于T4 RNA连接酶连接效率很低。因此，在试验中延长了连接酶的连图4 SMART反转录酶法5RACE技术原理 Detailed mechanism of SMART 5RACE reactions接时间，从16 h增加到24 h，希望能通过这样来提高环化的效率，结果如图1，其中的B道是技术改进前的结果，A道是改进后的结果。但可以看到无论改进前还是改进后都没有出现明显的扩增条带，可能由于二级结构太多或者连接酶优先连接了截短的cDNA，导致PCR产物凝胶电泳中无法分辨出目的大小片段。因此在找到更合适的改进方法前，此技术可能不适合于播娘蒿CBF基因的5末端扩增。 末端脱氧核糖核酸转移酶法5RACE技术中，能否在首链cDNA末端加上poly dA显得非常重要。由于TDT的连接能力很差，因此进行了几点改进：首先，将dATP的浓度从标准的 mmol/L增加到了2 mmol/L；其次，在加入TDT前进行94变性3 min，使DNA的双链结构尽量变成单链；最后延长了TDT的作用时间，将它从标准的30 min延长到12 h。其结果如图2，技术改进前的B道与技术改进后的A道形成明显对比。可以清楚地看出技术改进几乎没有出现扩增产物，改进后虽然扩增产物较为弥散，但还是可以隐约分辨出目的大小的扩增条带。因此可以说明，以上三项改进成功得提高了TDT的连接效率，使的cDNA末端连上了poly dA。 SMART反转录酶法5RACE技术比较而言是三种技术中最为成熟的。但是对于不同的试验对象仍然需要一定的改进。DTT是一种蛋白质保护剂，此外还有解开mRNA链5端高级结构的作用。由于根据试验手册首次预试验结果不好，故对其DTT浓度进行改进，将它的浓度由2 mmol/L提高到4 mmol/L，结果如图3，改进前的B道与改进后的A道变化不大，但改进后目的条带的亮度显着增加了。说明提高DTT的浓度有效地减少了mRNA链的高级结构，使 1迪芬巴赫C W，德瑞克斯勒G 技术实验指南M.北京：科学出版社，1998，268-286. 2刑桂春，张成岗，魏汉东，等.采用RACE技术获得全长人新基因MAGE-D1J.中国生物化学与分子生物学报，2001，17(2)：203-208.3王春丽，张成岗.人脑红蛋白(NGB)全长cDNA序列的克隆J.生物化学与生物物理进展，2002，99(6)：946-950.4J.萨姆布鲁克，拉塞尔.分子克隆实验指南M.北京：科学出版社,2002：659.