华中樱叶绿体基因组特征与分子标记.pdf

Vol.44 No.1Jan.2024第 44 卷 第 1 期2024 年 1 月中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Journal of Central South University of Forestry&Technologyhttp:/收稿日期：2023-03-01基金项目：湖南省林业科技创新杰出青年培养科研项目（XLK202108-6）；湖南省自然科学基金项目（2023JJ30358）；湖南林业科技创新项目（XLKY202212）；湖南林业科技创新项目（XLKY202317）。第一作者：阳秀玫（），硕士研究生。通信作者：严佳文（），副研究员，博士。引文格式：阳秀玫,陈亮明,禹霖,等.华中樱叶绿体基因组特征与分子标记 J.中南林业科技大学学报,2024,44(1):175-184.YANG X M,CHEN L M,YU L,et al.Chloroplast genomic characteristics and molecular markers of Prunus conradinaeJ.Journal of Central South University of Forestry&Technology,2024,44(1):175-184.华中樱叶绿体基因组特征与分子标记阳秀玫1，陈亮明1，禹 霖2，柏文富2，李建挥2，吴思政2，李柏海2，熊 颖2，聂东伶2，严佳文2（1.中南林业科技大学 林学院，湖南 长沙 410004；2.湖南省植物园，湖南 长沙 410116）摘 要：【目的】组装华中樱叶绿体基因组并进行序列特征分析和分子标记初步鉴定。【方法】分别应用SPAdes、prodigal v2.6.3、hmmer v3.1b2 及 aragorn v1.2.38 软件进行华中樱叶绿体基因组组装、基因编码区注释、rRNA 和 tRNA 预测。应用 OGDRAW 软件进行叶绿体基因组图谱绘制。运用 DNAMAN 软件对 26 个樱亚属物种和华中樱的叶绿体基因组序列进行多重比对，人工检索华中樱特有的 SNP 和 InDel 位点。应用 Codon W1.4.2和 EMBOSS 的 cusp 软件分析叶绿体基因组中基因的相对同义密码子使用度。【结果】华中樱叶绿体基因组大小为 158 019 bp，其中小单拷贝区（Small single copy，SSC）、大单拷贝区（Large single copy，LSC）和反向重复区（Inverted repeat，IR）大小分别为 19 247、85 910 和 52 862 bp，总 GC 含量为 36.7%。华中樱叶绿体基因组共编码 130 个基因，包括 8 个核糖体 RNA 基因、37 个转运 RNA 基因以及 85 个蛋白编码基因。序列中有 SSR位点 240 个，其中单核苷酸重复位点 153 个，二核苷酸重复位点 12 个，三核苷酸重复位点 63 个，四核苷酸重复位点 11 个，六核苷酸重复位点 1 个。通过与另外 26 种樱亚属植物叶绿体基因组序列进行多重比对，鉴定了华中樱潜在的种特异性 SNP 位点 29 个，InDel 标记 8 个。对密码子进行统计可知，该物种的 66 种密码子编码了 21 种氨基酸，其中 RSCU 1 的密码子共有 32 个，有 29 个以 A/U 结尾，这些密码子结尾具有 A/U 偏好性。【结论】华中樱叶绿体基因组是典型的环状四分体结构，其与其他蔷薇科植物叶绿体基因组大小相近。挖掘了一批 SSR、SNP 和 InDel 标记，可为华中樱谱系地理学、群体遗传学和种间杂种鉴定等研究提供参考。关键词：华中樱；叶绿体基因组；SSR；InDel中图分类号：S718.43 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2024)01-0175-10Chloroplast genomic characteristics and molecular markers of Prunus conradinaeYANG Xiumei1,CHEN Liangming1,YU lin2,BAI Wenfu2,LI Jianhui2,WU Sizheng2,LI Baihai2,XIONG ying2,NIE Dongling2,YAN Jiawen2(1.School of Forestry,Central South University of Forestry&Technology,Changsha 410004,Hunan,China;2.Hunan Botanical Garden,Changsha 410116,Hunan,China)Abstract:【Objective】To assemble the chloroplast genome of Prunus conradinae and carry out sequence analysis and preliminary identification of molecular markers.【Method】SPAdes,prodigal v2.6.3,hmmer v3.1b2 and aragorn v1.2.38 software were used to assemble the chloroplast genome,annotate the gene coding region,and predict rRNA and tRNA.The genome map of chloroplast was drawn by OGDRAW.Multiple alignment of chloroplast genome sequences of P.conradinae and 26 subgenus Cerasus species was carried out using DNAMAN software,and the SNP and InDel sites unique to P.conradinae were manually retrieved.Codon W1.4.2 and EMBOSS cusp software were used to analyze the relative synonymous codon usage of genes in chloroplast genome.【Result】The chloroplast genome size of P.conradinae was 158 019 bp,including small single copy(SSC),large single copy(LSC)and inverted repeat(IR),which were 19 247 bp,85 910 bp and 52 862 bp,respectively,and the total GC content was 36.7%.The chloroplast genome of P.conradinae encodes 130 genes,including 8 ribosomal RNA genes,37 transport RNA genes and 85 protein-coding genes.There were 240 SSR sites in the sequence,including 153 single nucleotide repeat sites,12 dinucleotide repeat sites,63 trinucleotide repeat sites,11 tetranucleotide repeat sites,and 1 six-nucleotide repeat site.Through multiple alignment with the chloroplast genome sequences Doi:10.14067/ki.1673-923x.2024.01.017阳秀玫，等：华中樱叶绿体基因组特征与分子标记176第 1 期华中樱Prunus conradinae属于蔷薇科Rosaceae 李属Prunus樱亚属Subg.Cerasus，是原产于我国中部和南部的野生樱花，生长于海拔 500 2 600 m 的沟边林中1。华中樱为高大乔木，树形宽卵状，树皮灰褐色，花先叶开放，花色粉红或白色，伞形花序，萼筒形状似钟形，花期通常是3月上中旬，花量巨大，具有很高的园林观赏价值2，华中樱野生资源丰富，遗传多样性较高，具有较大的开发利用潜力3-4。叶绿体作为绿色植物生命活动的代谢中心，是光合作用和生物合成的关键场所，主要存在于绿色植物的各种器官中，在植物细胞内遗传物质独立且具有半自主性5。叶绿体基因组具有保守的四分体结构，由大单拷贝区（Large single copy，LSC）、2 个反向重复区（Inverted repeat，IR）和小单拷贝区（Small single copy，SSC）组成6。叶绿体基因组具有规模小、拷贝数多、结构稳定、序列高度保守、遗传重组率低和普遍母系遗传等特点7，已被广泛地应用于 DNA 条形码开发、物种鉴定、物种演化和系统发育等方面的研究8。目前，华中樱相关研究主要涉及无性繁殖技术、引种驯化及群落构成等方面9-10，分子生物学等方面鲜有研究，且华中樱叶绿体基因组序列特征尚未见报道，一定程度上制约了华中樱叶绿体分子标记的开发与应用。本研究以华中樱总 DNA为材料，在高通量测序的基础上，分离、组装叶绿体基因组，并对其序列结构、基因组成、简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）、单核苷 酸 多 态 性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）和 插 入/缺 失 变 异（Insertion/deletion，InDel）及密码子偏好性进行分析，挖掘、开发叶绿体基因组分子标记，为开展谱系地理学、群体遗传学和种间杂种鉴定等研究提供参考。1 材料和方法1.1 试验材料采集健康的华中樱嫩片，液氮速冻后置于-80 冰箱保存备用。1.2 试验方法1.2.1 总 DNA 提取应用植物DNA提取试剂盒（TIANGEN，北京）提取总 DNA，具体方法参照说明书，采用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的质量，满足高通量测序要求的 DNA 送南京集思慧远生物科技有限公司进行测序。其余稀释到 50 ng/L，分装冻存待用。1.2.2 文库构建及测序检测基因组 DNA 合格后，用超声波将 DNA片段化，然后进行片段纯化、末端修复、3 端加 A、连接测序接头，再利用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小的选择，进行 PCR 扩增，形成测序文库，建好的文库需进行文库质检11。质检合格的文库用Illumina NovaSeq 平台进行测序，测序读长为 PE 150。1.2.3 叶绿体基因组组装及注释原始序列采用 fastp 软件过滤，去除 reads 中的测序接头以及引物序列，过滤掉平均质量值小于 Q5 和 N 个数大于 5 的 reads，对获得的clean reads 进行组装12。应用 SPAdes 3.10.1 软件组装叶绿体基因组13，K-mer 分别设置为 55、87、121，以 樱 桃 Prunus pseudocerasus 叶 绿 体基因组序列（GenBank 登录号为 KX255667.1）作为参考序列进行组装序列的对比和校正。应用 prodigal v2.6.3 软件（https:/ sequence，CDS），分 别 应 用 hmmer v3.1b2（http:/www.hmmer.org/）和 aragorn v1.2.38 软 件（http:/130.235.244.92/ARAGORN/）预 测 rRNA和 tRNA。参照 NCBI 上已经公布的近缘物种序列，提取其叶绿体基因序列，应用blast v2.6软件（https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对组装的序列，得到初步的注释结果，然后检查有差别的基因，去除错误的注释及冗余的注释，确定多外显子边界，获得最终的注释结果。叶绿体基因组图谱应用 OGDRAW（http:/chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）软件进行绘制。of 26 other subgenus Cerasus species,29 potential species-specific SNP sites and 8 InDel markers were identified.According to the statistics of codons,66 codons of this species encode 21 amino acids,of which 32 codons with RSCU 1,29 codons end with A/U,and these codons end with A/U preference.【Conclusion】The chloroplast genome of P.conradinae is a typical ring tetrad structure,which is similar in size to the chloroplast genome of other Rosaceae plants.A number of SSR,SNP and InDel markers have been excavated to provide references for the study of lineage geography,population genetics and interspecific hybrid identification of P.conradinae.Keywords:Prunus conradinae;chloroplast genome;SSR;InDel177中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷1.2.4 SSR 位点挖掘应用 MISA v1.0（http:/pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）在线工具鉴定简单重复序列，参数设置为单核苷酸重复 8 次及以上，二核苷酸重复 5 次及以上，其他类型重复 3 次及以上。1.2.5 SNP 与 InDel 位点鉴定从 NCBI 数据库下载 26 个樱亚属物种的叶绿体基因组序列，应用 DNAMAN 软件与华中樱叶绿体基因组进行多重比对，检索华中樱特有的SNP 和 InDel 位点（表 1）。表 1 26 个樱亚属物种的相关信息Table 1 Basic information of 26 subgenus Cerasus species编号Number物种Species拉丁名Latin name原产地OriginNCBI 登录号NCBI accession number1欧洲甜樱桃Prunus avium欧洲NC044701.12沼生樱桃Prunus jingningensis中国MN175194.13凤阳山樱花Prunus fengyangshanica中国MW160272.14钟花樱Prunus campanulata中国NC044123.15大山樱Prunus sargentii日本MW392082.16灰毛叶樱桃Prunus canescens中国MK816299.17盘腺樱桃Prunus discadenia中国MK905683.18高盆樱桃Prunus cerasoides中国MF621234.19微毛樱桃Prunus clarofolia中国MT74718510红山樱Prunus jamasakura日本MN652612.111丁字樱Prunus apetala日本MN242945.112霞樱Prunus verecunda日本MN242946.113尾叶樱桃Prunus dielsiana中国MN537436.114草原樱桃Prunus fruticosa中国MT916286.115迎春樱桃Prunus discoidea中国MN158647.116苦樱桃Prunus emarginata中国MN389436.117Prunus kumanoensis韩国MN245147.118太平山樱桃Prunus matuurae中国MK239267.119黑樱桃Prunus maximowiczii中国NC02698120美国酸樱桃Prunus pensylvanica美国MN427872.121中国樱桃Prunus pseudocerasus中国KX255667.122红毛樱桃Prunus rufa中国MN648456.123山樱花Prunus serrulata中国KP760073.124大叶早樱Prunus subhirtella中国KP760075.1 25野勇樱Prunus takesimensis韩国MG754959.126染井吉野樱Prunus yedoensis日本KP732472.11.2.6 密码子偏好性分析应用Codon W1.4.2（http：/ EMBOSS（http：/emboss.toulouse.inra.fr/）的 cusp 软件分析华中樱叶绿体基因组中基因的相对同义密码子使用度（Relative synonymous codon usage，RSCU）。RSCU 为密码子的实际使用频率与该密码子的理论使用频率的比值，RSCU 1 表示该密码子使用率较高，RSCU=1 表示该密码子无偏好性，RSCU1表示该密码子使用率较低14。2 结果与分析2.1 华中樱叶绿体基因组的基本特征华中樱叶绿体基因组为典型的环状双链四分体结构，全长 158 019 bp，包括 1 个小单拷贝片段（SSC，19 247 bp）、1 个大单拷贝片段（LSC，85 910 bp）和 1 对反向重复序列（IRa 和 IRb，52 862 bp）（图 1）。华中樱叶绿体基因组的总GC 含量为 36.70%，IR 区的 GC 含量为 42.53%，高于 LSC 区（34.60%）及 SSC 区（30.06%）（表2）。华中樱叶绿体基因组一共注释到130个基因，包括 85 个蛋白编码基因、37 个 tRNA 基因和 8 个rRNA 基因（表 3）。按照功能可将这 130 个叶绿体基因分为 4 类：psaA、psaB、psaC、psaI 和 psaJ等 45 个与光合作用相关的基因；rpl14、rpl16、rpl2、rpl20和rpl22等75个与自我复制相关的基因；matK、clpP 和 cemA 等 5 个其他基因以及 ycf1、ycf2、ycf3 和 ycf4 等 5 个功能尚未探明的基因。阳秀玫，等：华中樱叶绿体基因组特征与分子标记178第 1 期2.2 叶绿体基因组简单重复序列分析华中樱基因组SSR重复序列共240个（表4），主要由 A 或 T 碱基组成，其中单核苷酸重复序列153 个，二核苷酸重复序列 12 个，三核苷酸重复序列 63 个，四核苷酸重复序列 11 个，六核苷酸重复序列 1 个。在不同类型的重复基序中，A/T、ATA/TAT 出现的频率最高，分别占重复基序总数的 80.94%和 2.42%，其余重复基序发生频率均较低，不超过 2.04%，最低为 0.16%。2.3 SNP 与 InDel 位点分析通过华中樱与其他 26 种樱亚属植物叶绿体基因组的多重比对，鉴定了 37 个华中樱特有的核酸多态性位点，其中 SNP 位点 29 个，InDel 位点 8 个（表 5）。InDel 位点的插入与缺失片段大小范围为 4 21 bp，其中碱基插入位点占 62.5%，碱基缺失位点占 37.5%。29 个 SNP 位点的碱基异变以A/T 为主，占总数的 62.07%。图 1 华中樱叶绿体基因组图谱Fig.1 Chloroplast genome map of P.conradinae表 2 华中樱叶绿体基因组碱基组成Table 2 Base composition of chloroplast genome in P.conradinae区域 RegionA/%T/%C/%G/%长度 Length/bpGC/%大单拷贝区 LSC31.8133.5917.8116.8085 91034.60小单拷贝区 SSC35.0434.9015.7514.3119 24730.06反向重复区 IRa28.7028.7722.0120.5226 43142.53反向重复区 IRb28.7728.7020.5222.0126 43142.53全序列 Complete sequence31.1832.1218.7117.99158 01936.70179中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷表 3 叶绿体基因功能分类统计Table 3 Statistical table of chloroplast gene function classification类别 Gategory基因群 Gene group基因名 Gene name光合作用Photosynthesis光系统的亚单位PsaA，psaB，psaC，psaI，psaJ光系统亚单位psbA，psbB，psbC，psbD，psbE，psbF，psbH，psbI，psbJ，psbK，psbL，psbM，psbN，psbT，psbZNADH 脱氢酶亚单位ndhA*，ndhB*(2)，ndhC，ndhD，ndhE，ndhF，ndhG，ndhH，ndhI，ndhJ，ndhK细胞色素 b/f 复合物的亚单位petA，petB*，petD*，petG，petL，petNATP 合酶亚单位atpA，atpB，atpE，atpF*，atpH，atpI核糖体大亚基rbcL光氯仿还原酶亚基自我复制Self-replication大核糖体亚单位蛋白rpl14，rpl16*，rpl2*(2)，rpl20，rpl22，rpl23(2)，rpl32，rpl33，rpl36小核糖体亚单位蛋白#rps19，rps11，rps12*(2)，rps14，rps15，rps16*，rps18，rps19，rps2，rps3，rps4，rps7(2)，rps8RNA 聚合酶亚单位rpoA，rpoB，rpoC1*，rpoC2核糖体 RNArrn16(2)，rrn23(2)，rrn4.5(2)，rrn5(2)转运 RNAtrnA-UGC*(2)，trnC-GCA，trnD-GUC，trnE-UUC，trnF-GAA，trnG-GC，trnG-GCC*，trnH-GUG，trnI-CAU(2)，trnI-GAU*(2)，trnK-UUU*，trnL-CAA(2)，trnL-UAA*，trnL-UAG，trnM-CAU，trnN-GUU(2)，trnP-UGG，trnQ-UUG，trnR-ACG(2)，trnR-UCU，trnS-GCU，trnS-GGA，trnS-UGA，trnT-GGU，trnT-UGU，trnV-GAC(2)，trnV-UAC*，trnW-CCA，trnY-GUA，trnfM-CAU其他基因Other genes成熟酶基因matK蛋白酶基因clpP*包膜蛋白基因cemA乙酰 CoA 羧化酶accDc 型细胞色素合成基因ccsA翻译起始因子功能未知的基因Genes of unknown function保守假设叶绿体 ORFycf1(2)，ycf2(2)，ycf3*，ycf4*：含有一个内含子；*：含有两个内含子；#：假基因；(2)：拷贝数大于 1 的基因，括号中为其拷贝数。*:contains one intron;*:contains two introns;#:pseudogene;(2):genes with copy number greater than 1,and the number of copies in parentheses.表 4 华中樱叶绿体基因组 SSR 重复基序类型及发生频率Table 4 SSR repeat motif types and their frequency in chloroplast genome of P.conradinaeSSR 重复单元SSR repeat unit重复基序类型数目Number of repeat motif types重复基序类型Repeat motif types重复基序数量Number of repeat motifs发生频率Frequency/%单核苷酸Mononucleotide2A/T1 50780.94C/G371.99二核苷酸Dinucleotide3AT382.04TA382.04TC50.27三核苷酸Trinucleotide17AAC/GTT90.48AAG/CTT180.98AAT/ATT120.64ACC/GGT60.32AGA/TCT180.98AGC/GCT60.32ATA/TAT452.42ATC/GAT60.32CAA/TTG90.48GAA/TTC241.29GCA/TGC60.32TAA/TTA271.45ACT30.16ATG30.16CAG30.16GGA30.16TAG30.16阳秀玫，等：华中樱叶绿体基因组特征与分子标记180第 1 期续表 4Continuation of table 4SSR 重复单元SSR repeat unit重复基序类型数目Number of repeat motif types重复基序类型Repeat motif types重复基序数量Number of repeat motifs发生频率Frequency/%四核苷酸Tetranucleotid7AAAT/ATTT60.32TAAA/TTTA90.48AATA30.16ATAA30.16TTAA60.32TTGA30.16TTTC30.16六核苷酸Hexanucleotide1TTTATA30.16表 5 SNP 和 InDel 位点基本信息Table 5 Basic information of SNP and InDel locus序号 Number标记类型 Marker types碱基位置 Nucleobase positions碱基 Nucleobase1Deletion1 808 1 812AATTT2Insertion 5 513 5 516ATTT3SNP7 133T4SNP9 304T5SNP11 810A6SNP13 102A7SNP16 918A8SNP20 597A9SNP28 918G10SNP33 451C11Insertion35 182 35 202GAATTATAGTATGGTTATAAA12Deletion38 922 38 924TGT13SNP38 941A14SNP43 492T15SNP47 477T16SNP47 652C17SNP53 454A18SNP53 853C19SNP54 289C20Insertion61 718 61 725GTATAGAT21SNP62 270A22SNP63 238C23SNP66 089A24SNP67 466G25Insertion68 428 68 432TGAAT26Deletion70 476T27SNP70 916T28SNP85 544C29SNP104 464T30SNP109 577A31SNP119 860G32SNP130 358T33SNP132 892C34SNP134 198G35Insertion139 357 139 361ATATA36SNP144 517T37SNP149 632A181中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷2.4 密码子偏好性分析华中樱叶绿体基因组含有 66 种密码子（包含终止密码子），编码 21 种氨基酸，编码氨基酸的总密码子数为 26 490 个。在所有被编码的氨基酸中，精氨酸 Arg、丝氨酸 Ser 和亮氨酸 Leu 出现频率最高。相对同义密码子使用度（RSCU）分析表明，在所有被编码的密码子中，RSCU 1 的密码子共有 32 个（UGG、GCA、CCA 等），其中 29 个密码子以 A/U 碱基结尾，以 A 结尾的占44.83%，以 U 结尾的占 55.17%，具有 A/U 偏好性。RSCU 1 的密码子共有 34 个（GUG、UUG、CUC 等），以 G/C 结尾的共有 31 个，以 G 结尾的占 48.39%，以 C 结尾的占 51.61%（表 6）。表 6 华中樱叶绿体基因组相对同义密码子使用情况分析Table 6 RSCU analysis of codons of chloroplast genome of P.conradinae氨基酸或终止密码子Aminoacids/termination codon密码子Codons数量（RSCU）Number(RSCU)氨基酸或终止密码子Amino acids/termination codon密码子Codons数量（RSCU）Number(RSCU)丙氨酸AlanineGCA386(1.103 6)*半胱氨酸CysteineUGC79(0.508 0)GCC226(0.646 0)UGU232(1.492 0)*GCG152(0.434 4)谷氨酸GlutamicacidGAA1 027(1.474 6)*GCU635(1.815 6)*GAG366(0.525 4)天冬氨酸AsparticacidGAC211(0.393 2)甘氨酸GlycineGGA718(1.606 4)*GAU862(1.606 8)*GGC176(0.393 6)苯丙氨酸PhenylalanineUUC524(0.693 6)GGG301(0.673 2)UUU987(1.306 4)*GGU593(1.326 8)*组氨酸HistidineCAC153(0.477 4)赖氨酸LysineAAA1 058(1.492 2)*CAU488(1.522 6)*AAG360(0.507 8)异亮氨酸IsoleucineAUA732(0.959 7)亮氨酸LeucineCUA363(0.787 2)AUC440(0.576 9)CUC179(0.388 2)AUU1 116(1.463 4)*CUG184(0.399 0)甲硫氨酸MethionineAUG620(2.990 4)*CUU579(1.255 8)*GUG1(0.004 8)UUA901(1.953 6)*UUG1(0.004 8)UUG561(1.216 2)*脯氨酸ProlineCCA307(1.126 8)*天冬氨酸AsparagineAAC300(0.461 8)CCC206(0.756 0)AAU999(1.538 2)*CCG153(0.561 6)谷氨酰胺GlutamineCAA718(1.539 2)*CCU424(1.556 0)*CAG215(0.460 8)精氨酸ArginineAGA504(1.897 2)*丝氨酸SerineAGC138(0.411 0)AGG174(0.655 2)AGU393(1.170 6)*CGA354(1.332 6)*UCA409(1.218 6)*CGC110(0.414 0)UCC332(0.988 8)CGG115(0.432 6)UCG185(0.551 4)CGU337(1.268 4)*UCU557(1.659 6)*苏氨酸ThreonineACA421(1.242 8)*缬氨酸ValineGUA565(1.559 6)*ACC254(0.750 0)GUC160(0.441 6)ACG150(0.442 8)GUG202(0.557 6)ACU530(1.564 4)*GUU522(1.440 8)*色氨酸 TryptophanUGG450(1.000 0)*酪氨酸TyrosineUAC202(0.400 0)终止密码子Termination codonUAA50(1.764 6)*UAU808(1.600 0)*UAG20(0.705 9)UGA15(0.529 5)带的数据表示 RSCU 1。means RSCU 1.3 讨论与结论3.1 讨 论华中樱为中国特有的李属樱亚属植物，分布范围跨度广，是一种观赏价值较高、遗传多样性丰富的野生樱花，具有较大的开发利用潜力3-4。近年来，研究者们已从华中樱野生资源中选育了一系列优良单株或新品种15-16。目前，应用分子阳秀玫，等：华中樱叶绿体基因组特征与分子标记182第 1 期标记技术研究华中樱遗传多样性的报道较少，仅见严佳文等4基于核糖体基因转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）序列分析了湖南省华中樱的群体遗传结构和多样性，叶绿体基因序列在华中樱遗传多样性研究方面的应用还未见报道。叶绿体基因组序列和基因结构较为保守，大量叶绿体基因组数据被应用在植物系统发育等研究领域17。本研究结果表明，华中樱与其他樱亚属植物的叶绿体基因组相似，是典型的环状四分体结构，由 1 个 SSC 区、1 个 LSC 区和一对反向重复序列IR 区（IRa 和 IRb）组成，这与大多数被子植物的叶绿体基因组结构相似18。通过比较华中樱与其他 26 个不同樱亚属植物叶绿体基因组序列发现，其大小在 156 159 kb 之间，介于被子植物叶绿体120 180 kb 的范围内19，其基因组大小与七里香蔷薇 Rosa banksias var.noroalis（156 544 bp）、长柄扁桃 Amygdalus pedunculata（157 851 bp）和中国草莓 Fragaria chinensis（155 627 bp）等蔷薇科植物的叶绿体基因组大小相近，说明属间基因组大小具有一定的稳定性20-22。华中樱叶绿体基因组共注释了 130 个基因，所编码的基因类别、数量及排列顺序等与其他被子植物差异不大，同时具有高度相似的 GC 含量23。SSR 标记具有共显性、多态性高、稳定性好、操作简便等优点，已被广泛应用于遗传多样性、亲缘关系分析等研究领域24，可用于推断物种间的遗传距离、种群结构和进化关系等25。华中樱叶绿体基因组序列的 SSR 位点共有 240 个，出现频率最高的为单核苷酸重复，占总 SSR 总数的82.92%，以 A/T 重复基序数量最多，SSR 位点数量看似与其他高等植物差别较大，远多于藿香叶绿绒蒿（34 个）26、多齿红山茶（52 个）27和黄金宝树（62 个）28等物种，实则是因为不同物种鉴定 SSR 位点时，软件设置参数不完全一致，如藿香叶绿绒蒿 SSR 鉴定设置的单核苷酸到六核苷酸的重复次数分别为 10、5、4、3、3 和 3，多齿红山茶设置的是 10、6、5、5、5、5，黄金宝树设置的是 10、5、4、4、4，而本研究设置的参数是 8、5、3、3、3、3。叶绿体 InDel 和 SNP 标记已成功应用于物种鉴定、遗传多样性分析和品种真实性溯源等方面。王蕊等29利用 InDel 标记对中国主要玉米品种的正反交子代进行鉴定，仅需要一个标记就可以分别鉴定其正反交后代，可作为核基因组检测的补充，进一步完善品种真实性及品系溯源信息。兰青阔等30对贝母属 15 种植物 28 条叶绿体基因组序列进行分析，发现贝母属叶绿体基因组 DNA同源性可达 97.22%，通过分析共发掘 SNP 位点5 879 个，这些 SNP 位点可应用于精准鉴定、精确定量，为川贝母中药资源鉴定提供技术支撑。Fang 等31通过比较黄麻 Corchorus capsularis 和长果黄麻 C.olitorius 的叶绿体基因组序列，鉴定了 1个黄麻种特异性 InDel 标记，可用于黄麻属物种之间的系统