非洲猪瘟病毒C84L蛋白通过激活NLRP3炎症小体上调炎症因子的表达.pdf

SD0I:10.16656/j.issn.1673-4696.2024.0008文章编号：16 7 3-46 9 6(2 0 2 4)0 1-0 0 0 1-11文献标志码：A中图分类号：S852.659.1ChineseVeterinaryScience网络首发时间：2 0 2 3-10-2 72024,54(01):1-11中国兽医科学非洲猪瘟病毒C84L蛋白通过激活NLRP3炎症小体上调炎症因子的表达唐静1,2,马旭升,石正旺,代军飞,叶得河,王萌，马永华1*，郑海学2*（1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州7 30 0 7 0;2.中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院完动物疫病防控全国重点实验室，甘肃兰州730000)摘要：探索非洲猪瘟病毒（African swine fevervirus,ASFV)调控细胞因子产生和细胞死亡的机制。利用NLRP3炎症小体表达系统，筛选发现ASFV-C84L蛋白诱导NLRP3炎症小体介导的IL-1的分泌上调。首先，利用生物信息学分析C84L的结构信息，通过实时荧光定量PCR(qPCR)和间接免疫荧光试验（IFA)确定C84L蛋白在ASFV感染后的表达时序，细胞内定位；同时，用荧光素酶活性检测和蛋白免疫印迹（West-ern-blot)确定C84L蛋白参与调控p65的磷酸化以及IL-1的成熟和细胞焦亡；然后，用碘化丙啶(PI)染色观察C84L蛋白诱导细胞的死亡情况；最后，使用qPCR和酶联免疫吸附试验检测C84L蛋白对IL-1、IL-6、TNF-等细胞因子转录和分泌的影响。结果显示：C84L为亲水性蛋白，与沙门菌效应蛋白SifA具有同源性；ASFV感染原代猪肺泡巨噬细胞4h后，C84LmRNA表达水平逐渐上调，后续持续表达，第8 小时达到顶峰；而且IFA结果显示，C84L蛋白在细胞质和细胞核中均有定位。荧光素酶和Western-blot结果显示，C84L促进p65的磷酸化并激活NF-kB启动子的活化。PI染色结果显示，C84L真核质粒转染细胞后诱导细胞死亡，Western-blot结果也显示C84L诱导Caspase-1成熟以及膜孔蛋白N-GSDMD（G SD M D 剪切后的N端片段)剪切。将C84L真核质粒转染细胞后,IL-1B、IL-6、T NF-等细胞因子转录水平呈剂量依赖性升高；与转录水平相似，C84L表达诱导IL-1、IL-6、T NF-分泌水平上调。结论：ASFVC84L蛋白通过激活NF-kB以及NLRP3炎症小体诱导IL-1、IL-6、T NF-等促炎细胞因子表达水平上调以及细胞焦亡的发生。关键词：非洲猪病毒；细胞因子；C84L；NF-k B;NLR P3C84L protein of African swine fever virus up-regulates the expressionof inflammatory factors by activating NLRP3 inflammasomeTANG Jingl?2,MA Xusheng,SHI Zhengwang,DAI Junfei?,YE Dehe,WANG Meng,MA Yonghua*,ZHENG Haixue*(1.College of Veterinary Medicine,Gansu A gricultural University,Lanzhou 730070,China;2.State Key Laboratory forAnimal Disease Control and Prevention/College of Veterinary Medicine of Lanzhou University/Lanzhou Veterinary ResearchInstitute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou730000,China)Abstract:This study explored the mechanism by which African swine fever virus(ASFV)up-regulate收稿日期：2 0 2 3-0 7-19：修回日期：2 0 2 3-0 8-2 8基金项目：国家重点研发计划项目（2 0 2 1YFD1801300)；兰州市科技计划项目（2 0 2 2-2-112,2 0 17-4-10 3）；甘肃农业大学基金项目（GAU-ZDKC-202216，G A U-XK JS-2 0 18-0 7 3，G A U-K YQ D-2 0 17 R CZX-11，G A U-Q D FC-2 0 2 0-11）；甘肃省科技厅国际合作项目（144WCGA169）：甘肃省自然科学基金项目（18 JR3RA167）；国家生猪技术创新中心项目（CARS-35,NCTIP-XD/CO3）；“十四五”广东省“揭榜挂帅 项目（2 0 2 2 SDZG02）；中国农业科学院科技创新工程项目（CAAS-ASTIP-2022-LVRI)作者简介：唐静（1998-），女，甘肃氓县人，硕士生，专业为兽医学，E-mai1:。*通讯作者：马永华（198 2-），男，副教授，博士，硕士生导师，主要从事兽医寄生虫及其分子生物学研究,E-mail:；郑海学（197 9-)，男，研究员，博士，主要从事动物传染病学与流行病学研究，E-mail:。2第54卷中国兽医科学the production of pro-inflammatory cytokines and cell death.Using NLRP3 inflammasome expression sys-tem,we found that ASFV-C84L protein could induce the NLRP3 inflammasomes-mediated pro-inflammatorycytokines upregulation.Firstly,the structure of c84L was analyzed by bioinformatics,and the expres-sion stage and intracellular localization of C84L protein after ASFV infection were determined byreal-time fluorescent quantitative PCR(qPCR)and indirect immunofluorescence assay(IFA).Meanwhile,luciferase activity assay and Western-blot confirmed that C84L protein was involved in p65 phosphory-lation,IL-i maturation,and pyroptosis.Then the cell death was observed by propidium iodide(PI)staining during C84L expression.Finally,qPCR and enzyme-linked immunosorbent assay were used to de-tect the effect of C84L protein on the transcription and secretion of IL-1,IL-6 and TNF-etc.The re-sults showed that C84L was a hydrophilic protein with homology to Salmonella effector protein SifA,andthe expression of C84L mRNA in primary porcine alveolar macrophages was gradually increased at 4 h afterASFv infection,followed by continuous expression and reached the peak at 8 h.In addition,IFA resultsshowed that C84L protein was localized in both cytoplasm and nucleus.The results of luciferase andWestern-blot showed that C84L activated p65 phosphorylation and the NF-kB promoter.PI staining showedthat C84L expression induced cell death,and Western-blot results also showed that C84L induced thematuration of Caspase-1 and N-GSDMD(the N-terminal cleaved fragment of GSDMD).After C84L eukaryoticplasmid transfected cells,the transcription levels of IL-1p,IL-6,TNF-and other cytokines increasedin a dose-dependent manner.Similarly,C84L eukaryotic plasmid transfected cells could increase IL-1p,IL-6 and TNF-secretion levels.In conclusion,ASFV C84L protein induces the upregulation of IL-1,IL-6,TNF-and other cytokines as well as pyroptosis by activating NF-kB and NLRP3 inflammasome.Key words:African swine fever virus;cytokines;C84L;NF-kB;NLRP3*Corresponding authors:MA Yonghua,E-mail:;ZHENG Haixue,E-mail:zhenghaixue*Corresponding authors:MA Yonghua,E-mail:;ZHENG Haixue,E-mail:非洲猪瘟（Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒（Africanswinefevervirus,ASFV)感染引起的一种严重的猪传染病，临床表现为高烧、反应迟钝、全身皮肤红斑、明显的脾肿大和充血，以及淋巴结、心、脾和肾的广泛出血，强毒株感染猪死亡率接近100%，给全球养猪业造成重大经济损失。截至目前，仍无商品化疫苗和有效药物用于ASFV的防控和治疗。ASFV颗粒具有多层结构，总体呈二十面体形态，直径2 6 0 30 0 nm，基因组长17 0 193kb,编码150 16 7 种蛋白 2,大多数蛋白的功能未知。ASFV感染机体后能够引起机体免疫反应加剧，体内细胞因子水平急剧升高，组织损伤或坏死。过度的免疫激活伴随着过度的细胞因子释放，被称之为“细胞因子风暴”，引起机体全身性炎症，造成多种组织和器官损伤 3。ASFV感染机体可以诱导细胞因子如IL-1、IL-6、T NF-、IL-18、IL-12、IFN-和抗炎因子IL-10大量分泌，其中IL-1是一种关键的促炎细胞因子参与多种自身免疫性炎症反应和多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和调亡 4,也能诱导诸如IL-6、T NF-等其他细胞因子的产生，进而发挥促进炎症、调亡和凝血等作用。炎症应答是宿主抵御和清除病毒感染的重要防线。一旦宿主细胞的模式识别受体(PRRs)感知病原体相关分子模式（PAMPs)如病毒结构成分等，使炎症应答启动 5。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3（nucleotide-binding oligomerization domain-likereceptorprotein3,NLRP3）炎症小体参与炎症因子的成熟和细胞炎性死亡的发生，是抗病毒先天免疫系统的重要组成部分。NLRP3炎症小体的激活由启动步骤和激活步骤介导。1)启动阶段：外来病原激活核因子KappaB（n u c l e a r f a c t o r k a p p a B,NF-k B)通路，从而上调促炎细胞因子以及炎症小体相关基因的转录。外来病原通过PRRs激活IkB激酶（IKK），由2 个激酶亚基IKK和IKKB以及1个调节亚基如IKK组成 6。IKKs通过IkB磷酸化来调节NF-kB通路的激活。IkB的磷酸化导致其被蛋白酶体降解,随后释放NF-kB用于核转位和基因转录激活。2)激活阶段：外来病毒使NLRP3炎症小体传感蛋白和调亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-likeprotein,ASC)聚集并招募前体（pro-Caspase-1)进而促使其自我剪切为成熟体Caspase-17,激活的Caspase-1将pro-IL-1剪切为成熟的IL-1。同时，激活的 Caspase-1也将gasdermin D(GSDMD)进行切割，得到的活性N端结构域GSDMD（N-G SD M D）唐第1期静等：非洲猪瘟病毒C84L蛋白通过激活NLRP3炎症小体上调炎症因子的表达募集至细胞膜形成膜孔导致细胞破裂促使细胞焦亡的发生 8。细胞焦亡(Pyroptosis)又称细胞炎性坏死，是一种由促炎信号触发并与炎症相关的细胞死亡形式，是由炎症小体引发的，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应 9。这种类型的细胞死亡主要见于巨噬细胞等炎症细胞，由细菌或病原体感染引发。ASFV感染机体或者宿主细胞（单核巨噬细胞）,能够诱导细胞发生死亡。目前,ASFV调控天然免疫与炎症应答的研究主要集中于ASFV抑制天然免疫和炎症应答。如有研究表明，ASFV-pA528R通过靶向p65活化和核转位抑制TLR8介导的NF-kB活性【10;pMGF505-7R(pA528R)不仅与IKK相互作用以抑制IkB磷酸化和NF-kB核转位，还与NLRP3相互作用以抑制成熟IL-1的产生。ASFV-pA238L是一种IkB同源蛋白，可抑制宿主转录因子（包括NFAT、NF-k B和CBP/p300)的激活,从而抑制病毒性促炎细胞因子的产生 12。ASFV-pL83L为一种推定的IL-1结合蛋白 13。ASFV-pF317L与IKK相互作用并抑制IKK磷酸化,从而抑制NF-kB的激活 14。ASFV-pS273R在G107-A108处切割GSDMD以产生较短的GSD-MD-N末端片段（GSDMD-N1-107），该片段无法诱导细胞焦亡 15。尽管ASFV抑制炎症应答的研究逐渐增多，然而在体内或体外水平,其感染能够激活NF-kB信号通路，诱导各种炎症介质分泌和炎症应答，但ASFV诱发炎症应答和细胞炎性死亡的机制仍不清楚。为深人研究ASFV诱导细胞炎性因子产生和细胞炎性死亡的机制，前期通过对ASFV全基因筛选发现,C84L能够促进NLRP3炎症小体诱导的炎症应答，进一步促进细胞焦亡的发生。结果显示，AS-FV-C84L能够诱导p65的磷酸化并激活NF-kB启动子的活化。同时，C84L激活Caspase-1和IL-1的成熟。成熟的Caspase-1将GSDMD切割成为有活性的N-GSDMD,使细胞发生炎性死亡。进一步证实，C84L诱导细胞因子的转录和分泌。本研究通过探索ASFV-C84L对炎症应答的作用，从而为ASFV诱导机体“细胞因子风暴”发生的机制提供线索。1材料与方法1.1病毒和细胞非洲猪瘟病毒基因II型野生毒株ASFVCN/GS/2018由中国农业科学院兰州兽医研究所P3实验室人员分离并保存，在原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)上传代并保种。猪源肺泡巨噬细胞（3D4/21）、H EK-2 93T细胞、pCMV-Flag4-ASFV-C84L真核过表达质粒、pCMV-Flag4空载体质粒、NF-kB-Luc报告质粒和pRL-TK报告质粒均保存于中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学创新团队。1.2试剂DMEM细胞培养基、RPMI1640细胞培养基、胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)和胰酶（含0.2 5%EDTA-Trypsin)均购自Gibco公司。脂质体2 0 0 0、Plasmocintreatment均购自兰州博瑞生物科技有限公司。PBS、W e s t e r n 一抗稀释液、蛋白预染Marker、PVDF膜、RIPA裂解液、DAPI染色液和ECL显色液均购自上海碧云天生物技术有限公司。反转录试剂、TBGreen和ROX均购自宝生物工程（大连）有限公司。猪IL-1、T NF-、I L-6、I L-12 和IFN-等ELISA检测试剂盒均购自兰州博瑞生物科技有限公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG以及抗家兔IgG均购于甘肃中海生物科技有限公司。抗Flag和抗-actin单抗均购自Sigma公司。抗NF-kB（p 6 5）和抗p-NF-kB（p 6 5）单抗、抗IL-1和抗Cleaved-IL-1单抗、抗Caspase-1和抗 Cleaved-Ca-spase-1单抗以及抗GasderminD和抗Cleaved-Gas-derminD单抗均购自Cell SignalingTechnology公司。双荧光素酶分析试剂盒购自Promega公司。1.3C84L蛋白的生物学分析将测序正确的C84L蛋白核苷酸序列通过软件翻译为氨基酸序列进行生物学信息分析，利用npsa-prabi(https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl）预测蛋白二级结构；利用swissmodel(https:/swissmodel.expasy.org/interactive)预测蛋白质三级结构；利用ProtScale(https：/w e b.e x p a s y.org/protscale/)预测蛋白质亲疏水性；利用TMHMM(https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php TMH-MM-2.0)预测蛋白质跨膜区1.4间接免疫荧光试验（IFA）将HEK-293T细胞接种于共聚焦小皿中，当细胞密度为50%左右时，转染C84L真核表达质粒，24h后弃掉细胞培养基上清，加人40 g/L多聚甲醛固定30 min弃去，PBS洗涤1次；加入0.5%Tri-tox-100通透15min弃去，PBS洗涤1次；加入50 g/LBSA室温封闭1h,PBST洗涤5次，每次5min；加入抗目的蛋白抗体后4孵育过夜，PBST洗涤5次，每次5min；加入荧光二抗室温避光孵育1h，PBST洗涤5次，每次5min；加DAPI染色液避光孵第54卷中国兽医科学育15min，PBST 洗涤5次，每次5min；随后用激光共聚焦显微镜检测1.5目的蛋白的Western-blot分析将细胞接种于细胞培养板中，当细胞密度为80%90%时，转染C84L真核表达质粒，2 4h后弃掉细胞培养基上清，并用1XPBS洗涤后收样。向细胞样品中加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，裂解2 h后进一步超声破碎细胞，随后将样品于4、12000r/min离心10 min，收集上清，加人5上样缓冲液(LoadingBuffer)混匀后沸水中煮10 min。将蛋白样品用SDS-PAGE进行蛋白质分离并转印至PVDF膜上，转印后的PVDF膜用50 g/L脱脂奶粉溶液室温封闭2 h,TBST洗涤3次；用抗目的蛋白抗体4孵育过夜，TBST洗涤5次，5min/次；二抗室温孵育1h，T BST 洗涤5次，5min/次；随后用ECL显影检测。选择-actin作为内参对照1.6ELISA 检测将C84L真核表达质粒转染PAM细胞，2 4h后收集细胞上清，用酶联免疫吸附分析试剂盒分别检测猪IL-1、IL-6、T NF-、IL-12 和IFN-等细胞因子的蛋白含量1.7双荧光素酶报告试验将HEK-293T细胞在2 4孔板中培养，当细胞密度为50%7 0%时，用2 0 0 ng/孔的NF-kB-Luc和20ng/孔的pRL-TK海肾荧光素酶报告质粒分别与不同剂量（0、50、10 0 和2 0 0 ng）的过表达质粒pCMV-Flag4-ASFV-C84L共转染细胞。使用空载体质粒确保转染质粒总量一致。细胞转染2 4h后，加人裂解液室温裂解30 min，使用双荧光素酶分析试剂盒测定荧光素酶的活性1.8RT-qPCR 试验C84L质粒转染3D4/21细胞，收集3D4/21细胞样品，用TRIzol法提取细胞内总RNA并测定浓度，通过反转录试剂获得cDNA,采用特异性引物（引物序列见表1)进行RT-qPCR。反应体系为2 0 L：T BGreen10L、上游引物0.8 L、下游引物0.8 L、Rox0.4L、d d H,O(灭菌蒸馏水）6 L和cDNA2L。反应程序：9 530 s；9 55s 6 0 34s 40 个循环;9515s,6010 s,9515s。以GADPHmRNA水平作为细胞内总RNA含量的内参标准。用循环数C值及2 Ct方法计算目的基因的相对含量。1.9PI染色将3D4/21细胞铺于6 孔板中，使用不同剂量的C84L质粒转染细胞，2 4h后，加人适量的PI染料，温箱孵育30 min，于荧光显微镜下观察并拍照表1引物名称和序列Table 1Primers name and sequence引物名称引物序列(5 3)PrimersnamesPrimerssequencesC84L-FTCCGGAGTGGGAAAAAGATCCC84L-RATGCAGAGGAAGAACGGTGGp-IL-6-FTGGCTACTGCCTTCCCTACCp-IL-6-RCAGAGATTTTGCCGAGGATGTp-IL-1-FGACGGGCTTTTGTTCTGCTTp-IL-1-RGGACATGGAGAAGCGATTTGTp-IL-12-FATGTGTCCGCTGCGCAACp-IL-12-RTTAGGAAGAATTCAGATAGCTCp-TNF-FCCCTCTGGCCCAAGGACTCAGATCAp-TNF-RCGGGCTTATCTGAGGTTTGAGAp-IFN-FGCACTGGCTGGAATGAAACp-IFN-RAGGCACAGCTTCTGTACTCp-GADPH-FACATGGCCTCCAAGGAGTAAGAp-GADPH-RGATCGAGTTGGGGCTGTGACTp30-FGCAGGGCAAGGGTATACTGAp30-RCTGTCTCCTCTTCAAACAGCACp72-FCCGGGTACAATGGGTCTTCCp72-RCGCAACGGATATGACTGGGAp-:porcine(猪源)1.10统计学方法使用GraphPadPrism8软件对数据进行相关统计学分析，统计学差异用P值表示（*：P0.05时表示差异显著；*：P0.01和*：P0.001时表示差异极显著）。2结果2.1ASFV-C84L的生物信息学分析C84L蛋白的结构分析结果（图1A）显示，C84L蛋白二级结构中-螺旋占13.92%，扩展链占41.7 7%，-转角占7.59%，无规卷曲占36.7 1%。其三级结构如图1B所示，有-螺旋结构富集域，以-转角和无规卷曲连接形成其特定结构，与二级结构预测结果一致。同时，经过SwissModel三级结构比对，发现C84L与沙门菌效应蛋白SifA具有同源性。利用ProtScale软件对C84L基因做亲水性分析，纵坐标负值表示亲水区，可见组成C84L蛋白的氨基酸多集中在负值（图1C），整体表现为亲水性，为后期蛋白纯化提供了参考TMHMMServerv.2.0软件预测表明，C84L蛋白不存在跨膜区（图1D）。通过核定位信号分析，发现C84L无核定位信号（结果未显示）。5唐第1期静等：非洲猪瘟病毒C84L蛋白通过激活NLRP3炎症小体上调炎症因子的表达AB10203040506070HslixSheetTumCoil10203040506070C用户序列的ProtScale输出ProtScale outputforuser,sequence2Hydropath./Kyte&DoolittleDTMHMM后验概率TMHMMposteriorprobabilitiesforWEBSEQUENCE1.201.00.8-10.6-20.40.230102030405060704跨膜transmembrane内部inside外部outside10203040506070位点Position图1C84L的生物信息学分析Figure 1Bioinformatics analysis of C84LA：二级结构预测；B：三级结构预测；C：蛋白亲疏水性分析；D：跨膜区预测。A:Secondary structure prediction;B:Tertiary structure prediction;C:Hydrophilic analysis;D:Prediction of transmembrane region.2.2ASFV-C84L蛋白在感染中晚期细胞质和细胞核内表达的分布将C84L与Flag标签融合的表达载体转染HEK-293T细胞，结果如图2 A所示，C84L蛋白能够正常表达。对C84L蛋白定位分析，发现C84L主要分布在细胞核并在细胞质呈散在分布（图2 B）。R T-qPCR检测感染ASFV的原代猪肺泡巨噬细胞中C84L蛋白基因mRNA的表达时序，以ASFV的p30和p72蛋白基因作为阳性对照,结果显示,PAM细胞感染ASFV后第8 小时，C84L在PAM细胞中转录表达达到峰值（图2 C）,推测其为中晚期表达蛋白2.3ASFV-C84L诱导NF-kB的活化为了确认C84L蛋白是否调控NF-kB信号通路的活化,用LPS和ASFV处理细胞作为对照,C84L蛋白过表达，Western-blot结果（图3）证实，C84L蛋白能促进p65的磷酸化，进而激活NF-kB信号通路。为证实C84L诱导NF-kB活化结果的准确性，C84L过表达后，检测NF-kB荧光素酶活性，结果（图4）显示：NF-kB荧光素酶活性随着C84L表达量的增高而升高2.4ASFV-C84L激活NLRP3炎症小体介导的IL-1B产生和细胞焦亡发生将NLRP3炎性小体激活组分（NLRP3、A SC、pro-Caspase-1和pro-IL-1质粒）分别与ASFV基因组编码的不同蛋白在3D4/21细胞上共同表达，用ELISA检测培养上清中IL-1的分泌，对ASFV基因组编码的蛋白进行筛选，发现C84L具有诱导炎症发生的功能（图5)。为确认其准确性,将C84L质粒与NLRP3炎症小体激活组分(NLRP3、A SC、p r o-Ca s-pase-1和pro-IL-1质粒）共转染，Western-blot结果（图6 A）显示，成熟体IL-1(p17）和Caspase-1(p20)的表达量呈C84L剂量依赖性增高。为证实C84L具有诱导IL-1产生和诱导细胞焦亡的功能，用脂多糖(LPS)和尼日利亚菌素（Nig)作阳性对照C84L单独过表达后,Western-blot结果(图6 B和C)显示，活性形式的Caspase-1表达量升高，同时，C84L蛋白促进pro-IL-1和全长形式的GSDMD被剪切为成熟的IL-1(p17)以及活性形式的N-GSDMD。激活的N-GSDMD募集至细胞膜形成膜孔，促进IL-1等细胞因子的释放和炎性细胞死亡。使用PI染色观察细胞死亡，结果（图7)显示，C84L过表达后，随着C84L表达水平上调，PI染色的红色荧光水平上调，说明细胞死亡随着C84L表达呈剂量依赖性增加2.5ASFV-C84L蛋白诱导促炎细胞因子的转录和分泌用不同剂量的C84L质粒转染PAM细胞，提取6第54卷中国兽医科学ABDAPIFlagMergeC84L-Flag17 kuMock42ku-actin3D4/21MockC84LC84L-FlagC20(Z)15p72C84L10p305004812243648 72非洲猪瘟病毒感染后时间/hHours post ASFVinfection in PAMs图2 C84L表达产物的鉴定及其亚细胞定位和ASFV感染PAMs细胞后C84L的转录时序Figure22 Identification and subcellular localization of C84L expression product and timing of C84L transcription after ASFVinfectionofPAMs cellsA：C8 4L蛋白的过表达；B：C8 4L蛋白的亚细胞定位；C:C84L蛋白的转录时序。A:Overexpression of C84L protein;B:Subcellular localization of the C84L protein;C:Transcription timing of the C84L protein.Mockp-p6565 kup6565kuC84L-Flag17ku-actin42ku图3C84L蛋白诱导NF-kB(p65)的磷酸化Figure 3 C84L protein induced the phosphorylation of NF-kB(p65)细胞内总RNA,用RT-qPCR检测细胞内促炎细胞因子mRNA水平的变化。结果（图8)显示,与对照细胞相比，随着C84L表达水平的增加，细胞中IL-1、IL-6、T NF-、IL-12 和IFN-的转录水平显著上调。同时，使用ELISA试剂盒检测细胞培养上清中促炎细胞因子的分泌水平。结果如图9所示，与对照相比，随着C84L表达量的上调,IL-1、IL-6、T NF-、IL-12和IFN-蛋白分泌水平逐渐升高。3讨论ASFV编码蛋白复杂且大多数蛋白功能尚不清NF-KB8*642-0050100200C84L-Flag-actin图4C84L诱导NF-kB荧光素酶报告基因的活化Figure 4C84L expression induced NF-kB-luc re-portergeneactivation楚，而ASFV蛋白功能以及感染背后的免疫致病机制的深人揭示，将为疫苗研发和药物设计提供指导和思路。细胞因子在抗病毒（包括ASFV)免疫反应的许多方面发挥着至关重要的作用 16。ASFV强毒株感染机体导致“细胞因子风暴”的发生，血清促炎白细胞介素（IL-1、IL-1、IL-6）、T NF和趋化因子(CCL2、CCL5、CXCL10)水平升高。在急性ASFV感唐静等：非洲猪瘟病毒C84L蛋白通过激活NLRP3炎症小体上调炎症因子的表达第1期1.500iPAM-ASFV Genes(-Tur.d)/x鲁8 I-TI*1000500022345222345680968ASC+NLRP3+pro-Casp-1+pro-IL-1图5用炎症小体表达系统筛选蛋白Figure 5Screening of proteins by inflammasome expression systemEV：空载体质粒；Mock：空白对照；1 2 7 ASFV编码的部分蛋白。EV:Empty plasmid;Mock:Blank control;1-27:Part of ASFV-encoded proteins.3IN+ABCSpro-IL-131kuPIL-117kuIL-117ku48kupro-IL-131ku3IN+pro-Caspase-1Caspase-120 ku32ku20 kupro-Caspase-148 kuGSDMD-NCaspase-1GSDMD55kuASC23kuC84L-Flag17 ku17 kuC84L-FlagC84L-Flag17ku-actin42ku42ku42ku-actin-actin3D4/213D4/21NLRP3+十ASC十十pro-IL-1pro-Caspase-1十十十C84L0246HEK293T图6HEK-293T和3D4/21细胞表达的C84L蛋白诱导Caspase-1、I L-1和GSDMD的成熟Figure 6 C84L protein expressed in HEK-293T and 3D4/21 cells induced Caspase-1,IL-1 and GSDMD activationA:C84L质粒与NLRP3、A SC、p r o-IL-1和pro-Caspase-1质粒共转染HEK-293T细胞;B和C:C84L质粒转染3D4/21细胞。A:C84L plasmid was co-transfected into HEK-293T cells with NLRP3,ASC,pro-IL-1 and pro-Caspase-1 plasmids;B and C:The C84L plasmid wastransfected into 3D4/21 cells.染过程中，多种组织中也经常检测到IL-1、I L-6 和TNF水平升高,并与淋巴系统耗竭、出血和水肿相关17。细胞焦亡和IL-1成熟体的释放是启动和放大“细胞因子风暴”的关键因素和介质 18。细胞焦亡是程序性细胞死亡的一种促炎症形式，其特点是质膜快速破裂和促炎细胞内容物的释放。炎症细胞内容物的释放和级联反应导致组织损伤，有时甚至导致8第54卷中国兽医科学MockEV(5 g)LPS+NigC84L(2 g)C84L(3 g)C84L(4 g)C84L(5 g)TRANS100um100100m100.m100.m100.j4m100mRFP100um100m100um100um100um100m100umMerge)100um100100um图7C84L过表达，用PI染色观察诱导细胞死亡增加Figure 7 C84L protein overexpression induced cell death with PI stainingPAMIL-1PAMIL-6PAMTNF-20050-3*40-*150-230-100-ns20-*50-10-000026026026剂量梯度/ug剂量梯度/ug剂量梯度/ugGradient of doseGradient of doseGradient of dosePAMIL-12PAMIFN-6071507*40-100-2050-*00026026剂量梯度/ug剂量梯度/ugGradient of doseGradient of dose图8C84L蛋白诱导促炎细胞因子mRNA的表达Figure8C84L protein induced proinflammatory cytokine mRNA expression*：P0.0 5;*：P0.0 1；*：P0.0 0 1.器官衰竭和宿主死亡119。细胞焦亡直接产生的2 种促炎细胞因子是IL-1和IL-18。因IL-1缺乏分泌信号，其成熟和释放机制归因于活化的Caspase-1切割pro-Caspase-1和全长GSDMD,产生有活性的N-GSDMD并募集至质膜中形成膜孔使得被剪切成熟的IL-1B分泌释放至胞外 2 0。IL-1通过诱导其他促炎细胞因子（如IL-6和 TNF-)促进免疫细胞的产生和释放。同时,IL-1促进中性粒细胞和T细胞9唐静等：非洲猪瘟病毒C84L蛋白通过激活NLRP3炎症小体上调炎症因子的表达第1期PAMI