GSTpullown实验技术.ppt

GSTpull-down实验技术实验技术主讲：段志强主讲：段志强qqGSTpull-down原理原理qqGSTpull-down实验流程实验流程GSTpull-down原理原理：pGSTpulldown是一种在体外研究蛋白质相互作用的是一种在体外研究蛋白质相互作用的方法。方法。p原理：原理：利用DNA重组技术将已知蛋白与GST(GlutathioneStransferase)融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。GSTpull-down原理原理：p基本原理：基本原理：p假定A蛋白和B蛋白可能有相互作用，将纯化的融合GST标签的A蛋白和纯化的B蛋白以及能特异结合GST的Sephrose4Bbeads孵育一定时间，充分洗涤未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳，通过Westernblotting检测，可以看见GST-A和B分别对应的条带,表明A和B因相互作用而被GST-Apull-down；而GST对照组始终仅有一个条带。GSTpull-down示意图示意图GSTpull-down应用应用p用于验证两个已知蛋白的相互作用用于验证两个已知蛋白的相互作用p筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白GSTpull-down流程流程lGST-A融合蛋白的制备融合蛋白的制备B蛋白的制备蛋白的制备体外蛋白的结合体外蛋白的结合Westernblot检测检测1.1 GST-A融合蛋白的表达融合蛋白的表达1.2 GST-A融合蛋白的纯化融合蛋白的纯化1.GST-A融合蛋白的制备融合蛋白的制备1.1GST-A融合蛋白的表达融合蛋白的表达1、活化冻存菌种活化冻存菌种GST和和GST-A：按：按1:50比例将表达蛋白的冻存比例将表达蛋白的冻存菌液加入菌液加入5mlLB(Amp)，37，200rpm培养过夜；培养过夜；2、将过夜培养物按、将过夜培养物按1:100比例接入比例接入200mlLB(Amp)，220rpm，30培养至培养至OD600=0.4-0.6;3、以预实验确定的最佳、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白（IPTG0.5mM，20，200rpm培养培养1016小时）小时）;4、诱导适当时间后，、诱导适当时间后，4，5000rpm/min离心离心10min后弃上清后弃上清（如需要该步沉淀能保存在（如需要该步沉淀能保存在-80）；）；1.1GST-A融合蛋白的表达融合蛋白的表达5、重悬沉淀：按、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用菌液沉淀用1mlPBS重悬，并加入重悬，并加入PMSF；6、冰上超声沉淀重悬液：、冰上超声沉淀重悬液：5S间隔间隔5S至悬液透明（一般可容性至悬液透明（一般可容性蛋白：蛋白：10ml菌液沉淀用菌液沉淀用1mlPBS重悬液超声重悬液超声69min可透明）可透明）;7、12000rpm/min，4离心离心10min，将上清转移至新的离心管，将上清转移至新的离心管，加加DTT至终浓度至终浓度1mmol/L。1.2GST-A融合蛋白的纯化融合蛋白的纯化1、在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的50%GlutathioneSepharose4B，4缓慢摇动，反应缓慢摇动，反应3060min；2、3000rpm/min，4离心离心3min，弃上清。该，弃上清。该Sepharose上结合上结合了了GST-A融合蛋白。融合蛋白。3、在管中加入预冷的、在管中加入预冷的200微升微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤洗涤一次，一次，3000rpm/min，4离心离心3min，弃上清，弃上清;4、重复步骤、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸净三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸净但不吸走珠子），即获得结合有但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的融合蛋白的Sepharose；1.2GST-A融合蛋白的纯化融合蛋白的纯化5、如果用于检测，在、如果用于检测，在Sepharose加入加入1520微升微升1蛋白电泳上样蛋白电泳上样缓冲液，于沸水中煮缓冲液，于沸水中煮510min。6、12000rpm/min离心离心5min，取上清做，取上清做SDS-PAGE和和WB检测。检测。B蛋白的来源：蛋白的来源：1.1(His)-B融合蛋白的原核表达与融合蛋白的原核表达与纯纯化化1.2(HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达融合蛋白的真核表达2.B蛋白的制备蛋白的制备1、活化冻存菌种活化冻存菌种His和和His-B：按：按1:50比例将表达蛋白的冻存菌比例将表达蛋白的冻存菌液加入液加入5mlLB(Amp)，37，200rpm培养过夜；培养过夜；2、将过夜培养物按、将过夜培养物按1:100比例接入比例接入200mlLB(Amp)，220rpm，30培养至培养至OD600=0.4-0.6;3、以预实验确定的最佳、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白（IPTG0.5mM，28，200rpm培养培养1016小时）小时）;4、诱导适当时间后，、诱导适当时间后，4，5000rpm/min离心离心10min后弃上清后弃上清（如需要该步沉淀能保存在（如需要该步沉淀能保存在-80）；）；1.1.1(His)-B融合蛋白的原核表达融合蛋白的原核表达5、重悬沉淀：按、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用菌液沉淀用1mlPBS重悬，并加入重悬，并加入PMSF；6、冰上超声沉淀重悬液：、冰上超声沉淀重悬液：5S间隔间隔5S至悬液透明（一般可溶性至悬液透明（一般可溶性蛋白：蛋白：10ml菌液沉淀用菌液沉淀用1mlPBS重悬液超声重悬液超声69min可透明）可透明）;7、12000rpm/min，4离心离心10min，将上清转移至新的离心管，将上清转移至新的离心管，加加DTT至终浓度至终浓度1mmol/L。1.1.1(His)-B融合蛋白的原核表达融合蛋白的原核表达1.1.2(His)-B融合蛋白的纯化融合蛋白的纯化1、在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的Ni-NTA珠子，珠子，4缓慢摇动，反应缓慢摇动，反应3060min；2、3000rpm/min，4离心离心5min，弃上清。该，弃上清。该Ni-NTA珠子上结珠子上结合了合了His-B融合蛋白。融合蛋白。3、在管中加入预冷的、在管中加入预冷的200微升微升WashBuffer（沿壁加入，小心勿（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将珠子洗剧烈，以免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将珠子洗涤一次，涤一次，3000rpm/min，4离心离心3min，弃上清，弃上清;4、重复步骤、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸净三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸净但不吸走珠子），即获得结合有但不吸走珠子），即获得结合有His融合蛋白的融合蛋白的Ni-NTA；1.1.2(His)-B融合蛋白的纯化融合蛋白的纯化5、加入适量体积、加入适量体积ElutionBuffer，不必吹打，晃动洗脱蛋白。，不必吹打，晃动洗脱蛋白。3000rpm/min，4离心离心5min，吸净上清，吸净上清，His-B融合蛋白即在融合蛋白即在上清中；上清中；6、如果用于检测，取、如果用于检测，取10微升样品，加入微升样品，加入10微升微升1蛋白电泳上样蛋白电泳上样缓冲液，于沸水中煮缓冲液，于沸水中煮510min；7、12000rpm/min离心离心5min，取上清做，取上清做SDSPAGE和和WB检测。检测。1、将编码、将编码B蛋白的蛋白的ORF克隆到编码标签蛋白（如克隆到编码标签蛋白（如HA/Myc/Flag）的真核表达载体上，进行细胞转染；）的真核表达载体上，进行细胞转染；2、转染后、转染后3648h，取出细胞，用预冷，取出细胞，用预冷PBS洗洗2遍遍;3、加入适量体积、加入适量体积1RIPA（含（含PMSF），于冰上或），于冰上或4裂解细胞裂解细胞1030min;4、12000rpm/min，4离心离心5min，取上清保存在，取上清保存在-80或进行或进行下一步实验。下一步实验。1.2(HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达融合蛋白的真核表达3.体外蛋白的结合体外蛋白的结合1、将结合有将结合有GST-A融合蛋白的融合蛋白的Sepharose4B悬浮在适量体积缓悬浮在适量体积缓冲液中，加入冲液中，加入2030微升含有微升含有B蛋白的溶液（原核表达或真核表蛋白的溶液（原核表达或真核表达产物），同时采用结合有达产物），同时采用结合有GST蛋白的蛋白的Sepharose作为阴性对照作为阴性对照；2、在水平摇床上在水平摇床上4晃动晃动48h；3、3000rpm/min，4离心离心3min，弃上清（注意不要扰动底层，弃上清（注意不要扰动底层的的Sepharose）；）；4、加入预冷的、加入预冷的200微升缓冲液对微升缓冲液对Sepharose进行洗涤（沿壁加入，进行洗涤（沿壁加入，不要直接冲击不要直接冲击Sepharose，随后轻柔晃动，使，随后轻柔晃动，使Sepharose重悬即可重悬即可;3.体外蛋白的结合体外蛋白的结合5、3000rpm/min，4离心离心3min，弃上清（注意不要扰动底层，弃上清（注意不要扰动底层的的Sepharose）；）；6、重复步骤、重复步骤5三次三次;7、吸干、吸干Sepharose上面的液体后，加入上面的液体后，加入2030微升微升1蛋白电泳上蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴样缓冲液，沸水浴4min，冻存于，冻存于-20备用；备用；8、做、做SDS-PAGE和和Westernblot检测另一个蛋白。检测另一个蛋白。4.Westernblot检测检测谢谢大家！谢谢大家！