基于盖他病毒nsP3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第9期2023年9月Vol.45，No.9Sep.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202212032基于盖他病毒nsP3基因的Man荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用魏新宇1,2，王铭2，杜炳辰2，史智宾2，杨德成2，王靖飞1,2*(1.东北农业大学 动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 动物疫病防控全国重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069)摘要：为建立一种灵敏、特异且高效的检测盖他病毒(GETV)的Man荧光定量RT-PCR方法，本研究根据GETV的nsP3基因设计特异性引物及探针，以GETV(SC483株)cDNA作为模板，扩增目的基因并克隆至pET-29a载体中，构建重组质粒标准品pET29a-nsP3并经PCR和测序鉴定。基于该质粒标准品，采用方阵法优化引物、探针浓度以及退火温度，初步建立了一种基于GETV nsP3基因的Man荧光定量RT-PCR检测方法，并绘制标准曲线。以GETV(SC483株、SC266株)、辛德毕斯病毒(SINV)、猪流感病毒(H3N2、SIV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)等病毒的基因组RNA反转录为cDNA作为模板，利用本实验建立的Man荧光定量RT-PCR方法检测，结果显示，仅GETV为阳性，SINV、SIV、TGEV、PEDV、PRRSV均为阴性，表明该方法特异性较强；分别以10倍倍比稀释(3.07伊10-1拷贝/滋L3.07伊108拷贝/滋L)的重组质粒标准品pET29a-nsP3作为模板，利用本研究建立的方法和普通RT-PCR方法分别检测，结果显示，本研究建立的方法对重组质粒标准品的检测限为30.7拷贝/滋L，敏感性是普通RT-PCR的100倍，敏感性较高；分别以同一时间及不同时间提取的不同浓度的质粒标准品作为模板，利用本研究建立的荧光定量RT-PCR进行组内与组间的重复性试验检测，结果显示，该方法的组内组间变异系数均小于2%，重复性较好。利用本实验建立的Man荧光定量RT-PCR方法与普通RT-PCR方法分别对来源于GETV感染小鼠的84份组织样品中的病毒核酸进行检测，结果显示，该Man荧光定量RT-PCR方法对GETV检出率为95.24%(80/84)，而普通RT-PCR对GETV的检出率为67.86%(57/84)。二者的阳性符合率达100%。本研究首次基于GETV nsP3基因建立了Man荧光定量RT-PCR检测方法，该方法特异性强、敏感性高、重复性好，为GETV的检测提供了有效工具。关键词：盖他病毒；荧光定量RT-PCR；nsP3；检测方法中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)09-0910-06Establishment and preliminary application of a fluorescencequantitativeMan RT-PCR detection method basedon the nsP3 gene of Getah virusWEI Xin-yu1,2,WANG Ming2,DU Bing-chen2,SHI Zhi-bin2,YANG De-cheng2,WANG Jing-fei1,2*(1.College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.State Key Laboratory for Animal DiseaseControl and Prevention,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China)收稿日期：2022-12-31基金项目：国家自然这基金(32272980)；黑龙江省自然科学基金(YQ2021C038)；中国博士后基金面上项目(2019M650925)作者简介：魏新宇(1998-)，女，辽宁朝阳人，硕士研究生，主要从事动物病原入侵及发生机制的研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding authorAbstract:To develop a sensitive,specific,and efficient real-time PCR method for the detection of Getah virus(GETV),specific probes and primers were designed targeting a conserved region in the gene of nsP3 of GETV.The nsP3 gene wasamplified with the cDNA of GETV SC483 strain as the template and then cloned into the pET29a vector to prepare construct therecombinant plasmid,and identification by PCR and sequencing standard.After a series of optimization of the reaction conditionssuch as the probe concentration and annealing temperature,a fluorescence quantitative RT-PCR for detecting the nsP3 gene ofGETV was established and then used to draw the standard curve.This method showed no cross-reactivity with other swine RNAviruses,including sindbis virus(SINV),swine influenza virus(SIV)(H3N2),transmissible gastroenteritis virus(TGEV),porcineepidemic diarrhea virus(PEDV),and porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV),which only react with GETVshowing good specificity.The serially diluted recombinant plasmicl standard(3.07伊10-1copies/滋L-3.07伊108copies/滋L)of GETVwas used as a template,and detected by the method established in this study and the ordinary RT-PCR method.The results showedthat the minimum detection concentration by this method was 30.7 copies/滋L,and the sensitivity was about 100 times higher thanthat of the common RT-PCR,which was highly sensitive.The coefficients of variation(CV)of the intra-and inter-batch repetitivetests were less than 2%,which showed this method had good repeatability.The method and a common RT-PCR weresimultaneously employed to detect GETV in the tissues samples collected from the experimentally infected mice.The resultsshowed that the positive rate determined by the this method was 95.24%(80/84),which was higher than that obtained with thecommon RT-PCR(67.86%)(57/84).The positive conformity rate was 100%.Together,we established aMan fluorescenceprobe RT-PCR assay based on the nsP3 gene,which has good specificity,high sensitivity,and good repeatability,and provids aneffective tool for the detection of GETV.Key words:Getah virus;fluorescence quantitative RT-PCR;nsP3;detection method盖他病毒(Getah virus，GETV)是一种单股正链RNA病毒，属于披膜病毒科甲病毒属，主要通过虫媒传播1。该病毒在全球很多地区均有报道，自21世纪初以来，GETV E2中的关键氨基酸发生变异2-3，导致其的流行范围呈现从低纬度热带地区向高纬度地区扩散4，且已经发展成4个基因群5。我国于1964年从海南省库蚊中分离到第一株GETV，迄今为止，受到GETV影响的省份(直辖市、自治区)已经增加到17个6-7。马和猪是GETV的主要易感动物，马感染后通常引起发热、皮疹和腿部水肿等8；感染仔猪表现为精神沉郁、震颤、腹泻及后肢瘫痪，母猪则主要表现为流产和死胎率增加9。在部分地区人血清中已经检测到针对GETV的中和抗体，其中发烧人群的特异性抗体滴度明显高于亚临床症状者，表明GETV感染与人类疾病相关6。目前，我国还没有针对该病毒的商品化疫苗及抗病毒药物，因此加强对病原的检测和临床感染的快速诊断是防控该病毒传播的主要手段。已经报道的GETV的检测方法有随机扩增多态性DNA(cDNA-RAPD)技术10、荧光定量PCR11、反转录环介导的等温扩增12、重组酶介导的等温扩增13等。其中荧光定量PCR具有对病毒浓度要求低、灵敏度高、特异性强等特点，已成为常用的病原学检测方法之一14。荧光定量PCR分为染料法(SYBRGreen I)和探针法(Man)，染料法由于其经济成本低而检测中更受青睐，但其检测敏感性却不如Man法15。GETV的基因组大小为11 kb，分为两个开放阅读框，其中靠近5端的开放阅读框负责编码非结构蛋白(nsP1nsP4)，这些蛋白参与病毒RNA的转录、复制、多聚蛋白切割等16。作为基因组释放后开始复制的第一步，nsP从基因组RNA翻译成多蛋白P123和P1234，而nsP3通过招募依赖于宿主细胞的宿主编码因子，支持甲病毒的复制17，作为多蛋白P123和P23的一部分以及作为一个单独的蛋白质发挥作用。本研究基于GETV的nsP3基因的保守区域设计引物和探针，建立GETVMan荧光定量RT-PCR的检测方法，为GETV的检测、流行病学监测及相关疫病的诊断等方面提供了有效的检测手段。1材料与方法1.1主要实验材料GETV(SC483，SC266株)、辛德 毕 斯 病 毒(Sindbis virus，SINV)、猪 流 感 病 毒(H3N2)(Swine influenza virus，SIV)、猪传染性胃肠炎 病 毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、魏新宇，等.基于盖他病毒nsP3基因的Man荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用第9期911猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(Porcine re-productive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的cDNA及pOK12-GETV(包含GETV全长基因组的cD-NA)，均由本实验室分离并保存。2伊Man PCRMasterMix购自北京索莱宝科技有限公司；2伊PCR starMix with loading Dye购自北京康润诚业生物科技有限公司；DH5琢感受态细胞、琼脂糖胶回收试剂盒以及质粒小提试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司；Exnase II同源重组连接酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；d III和H I限制性内快切酶购自赛默飞世尔科技公司；总RNA提取 试 剂 盒 购 自 北 京 博 迈 斯 科 技 发 展 有 限 公 司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser购自宝日医生物技术有限公司。AG129小鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。1.2引物和探针的设计及合成根据GETV SC483(MN478486.1)的全病毒基因组序列，利用Snapgene软 件 分 析nsP3基 因，设 计 该 靶 基 因 的 扩 增 引 物NSP3-F/R，根据nsP3基因保守区设计Man荧光定量RT-PCR引物NP-F/R及探针，并根据波长范围选择添加FAM荧光基团和TAMRA淬灭基团(表1)，预计扩增的靶基因片段为250 bp，引物和探针均由吉林省库美生物公司合成。1.3重组质粒标准品的构建与鉴定以pOK12-GETV为模板，采用引物NSP3-F/R，经PCR扩增目的基因片段，PCR的反应条件为：945 min；9815 s、5830 s、681 min，30个循环；687 min。PCR产物经胶回收纯化后，利用同源重组酶Exnase II将目的基因克隆至线性化的pET-29a中，构建重组质粒pET29a-nsP3，经PCR和测序鉴定正确后利用分光光度计测量浓度，根据如下公式计算质粒的拷贝数：6.02伊1014伊质粒浓度(ng/滋L)/MW(平均分子量)=拷贝/滋L，对 于dsDNA，MW=碱 基 数 伊650(Dolton/碱基数)，于-20保存，作为质粒标准品备用。1.4Man荧光定量RT-PCR条件优化及标准曲线的建立荧光定量RT-PCR总反应体系为25滋L，采用方阵法对10滋mol/L的探针添加量(0.5滋L、0.75滋L、1滋L、1.5滋L、2滋L)、10滋mol/L的NP-F/R引物添加量(0.5滋L、0.75滋L、1滋L、1.5滋L、2滋L)，以及退火温度(55、56、57、58、59、60)进行优化。将重组质粒标准品pET29a-nsP3 10倍倍比稀释为8个稀释度(101108)后，分别取1滋L作为模板，无菌水作为阴性对照，按照优化后的反应条件检测，每个稀释度做3个重复。将所得结果以基因拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。1.5特异性试验分别以GETV(SC483株和SC266株)、SINV、H3N2、SIV、TGEV、PEDV、PRRSV的cDNA为模板，利用本实验建立的Man荧光定量RT-PCR检测，以无菌水作为阴性对照，评估该方法的特异性。1.6敏感性试验将质粒标准品10倍倍比稀释(1011010)后作为模板，采用引物NP-F/R，分别利用本研究建立的Man荧光定量RT-PCR方法以及普通RT-PCR方法18检测，以无菌水作为阴性对照。对比二者结果，评估本研究建立该方法的敏感性。1.7重复性试验将同一时间提取的质粒标准品10倍倍比稀释(103106)后作为模板，利用本研究建立的Man荧光定量RT-PCR方法进行组内重复试验，每个浓度重复3次；与不同时间提取质粒标准品10倍倍比稀释(103106)后作为模板，利用该方法进行组间的重复性试验。根据Ct值以及标准差()计算变异系数，评价该方法的重复性。1.8感染小鼠组织样品的检测将含有100 TCID50的GETV通过腹腔注射感染12只AG129小鼠，待小鼠全部死亡后取其心、肝、脾、肺、肾、睾丸、脑等组织样品，研磨、离心后利用总RNA提取试剂盒提取RNA，反转录为cDNA后作为模板，利用本研究中建立的Man荧光定量RT-PCR以及普通RT-PCR18检测，比较二者的检测结果，并计算二者的符合率。2结果2.1重组质粒标准品的构建与鉴定结果以包含表1引物及探针的序列引物名称Primer nameNP-FNP-RprobeNSP3-FNSP3-R引物序列Primer sequenceTTGCTTAGTCGGCAGAAACCGACATAGACACGGTACFAM-TTCCACCAGACGGCGGTCGAC-TAMRACTGTTTCAGGGGCCCGGATCCGCACCGTCATACAGGGTCCGCCGCCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTACGCGCCAGCCCTGCCTAGTC中 国 预 防 兽 医 学 报2023年912GETV全长基因组cDNA的重组质粒pOK12-GETV为模 板，经PCR扩 增nsP3基 因 片 段，将 其 克 隆 至pET-29a载体后进行菌落PCR鉴定。结果显示，nsP3基因的PCR和重组菌菌落PCR均扩增出约1 600 bp的目的片段(图1)；进一步测序结果显示，该重组质粒插入序列与参考序列完全一致，将重组质粒命名为pET29a-nsP3。利用分光光度计测定质粒浓度约为256 ng/滋L，经计算其为3.07伊1010拷贝/滋L。2.2引物及探针浓度及退火温度的优化结果采用方阵法优化该Man荧光定量RT-PCR方法扩增条件，结果显示，最优反应体系为12.5滋L的2伊-Man PCR mix buffer、探 针 各1滋L(0.25滋mol/L)、NP-F/R各0.75滋L(0.3滋mol/L)、0.5滋L的Dye I、4滋L的无菌水，模板1滋L。反应条件为9515 min，9515 s、5830 s、7230 s，40个循环。2.3标准曲线的建立选取8个稀释度(101108)，即以3.07伊102拷贝/滋L3.07伊109拷贝/滋L的质粒标准品作为模板，基于上述优化的条件进行荧光定量PCR扩增，并绘制标准曲线，结果显示，重组质粒的各拷贝数与其Ct值之间呈良好线性关系(图2)，标准曲线的回归方程为：y=-1.423ln(x)+47.351，R2：0.993，Efficient：101.914%。2.4特异性试验结果以本实验室分离的两株GETV(SC483和SC266株)以及SINV、SIV、TGEV、PEDV、PRRSV的cDNA作为模板，经本研究建立的Man荧 光 定 量PCR扩 增，结 果 显 示，除 了GETVSC483株SC266株扩增结果为阳性外，其余病毒及阴性对照的检测结果均为阴性(图3)，表明本研究建立的Man荧光定量PCR方法的特异性较强。2.5敏感性试验结果以10倍倍比稀释的pET29a-nsP3(1011010即3.07伊10-1拷贝/滋L3.07伊108拷贝/滋L)为模板，分别进行Man荧光定量RT-PCR及普通RT-PCR扩增，结果显示，本研究建立的Man荧光定量RT-PCR检测限达30.7拷贝/滋L(图4A)，普通RT-PCR的检测限为3.07伊103拷贝/滋L(图4B)。表明本研究建立的Man荧光定量RT-PCR方法的敏感性更高。魏新宇，等.基于盖他病毒nsP3基因的Man荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用第9期913M:DL5000 DNA Marker;1:nsP3 gene;2:PCR identification of pET29a-nsP3图 1nsP3基因片段扩增及重组质粒pET29a-nsP3的PCR鉴定结果5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bpM121-10:3.07伊10-1copies/滋L-3.07伊108copies/滋L of pET29a-nsP3,respectively;11:Negative control图4Man荧光定量RT-PCR(A)及普通RT-PCR(B)敏感性试验结果图 2Man荧光定量RT-PCR的标准曲线Quantity100000000000010000000000010000000000100000000010000000010000000100000010000010000100032.530.027.525.022.520.017.515.012.510.0y=-1.423ln(x)+47.351,R2:0.993图 3特异性试验结果SINV,SIV,TGEV,PEDV,PRRSV andnegative control2500002250002000001750001500001250001000007500050000250000403836343230282624222018161412108642CycleGETVSC266GETVSC48312345678910111000bp750bp500bp250bp100bpB1.751.501.251.000.750.500.25403836343230282624222018161412108642CycleA9-1187654321表2Man荧光定量RT-PCR方法的重复性试验结果浓度(拷贝/滋L)Concentration(copies/滋L)3.07伊1083.07伊1073.07伊1063.07伊105Ct 值Ct value17.234依0.20620.758依0.11724.168依0.08227.912依0.238标准差Standard deviation0.1930.1050.0790.240变异系数(%)Variability(CV%)1.1200.5060.3280.860Ct 值Ct value17.028依0.17720.725依0.03324.250依0.07627.67依0.242标准差Standard deviation0.1870.2130.0930.294变异系数(%)Variability(CV%)1.0981.0280.3841.063组内重复性试验Intra-repetitive assay组间重复性试验Inter-repetitive assay2.6重复性试验结果以10倍倍比稀释的质粒标准品pET29a-nsP3(3.07伊105拷贝/滋L3.07伊108拷贝/滋L)作为模板，分别进行Man荧光定量RT-PCR组内及组间重复性试验，根据Ct值和 计算变异系数(CV)，结果显示，组内和组间的变异系数均小于2%(表2)，表明该方法的重复性较好。2.7感染小鼠组织样品的检测结果利用本研究建立的Man荧光定量RT-PCR及普通RT-PCR方法对12只人工感染GETV小鼠的7种组织脏器(心、肝、脾、肺、肾、睾丸和脑)检测，3次重复检测结果均无异常扩增曲线，Ct值臆35时判为阳性。结果显示，Man荧光定量RT-PCR方法的阳性检出率为95.24%(80/84)，而普通RT-PCR的阳性检出率仅为67.86%(57/84)。Man荧光定量RT-PCR检测到的阳性样品数量分别为心12份、肝12份、脾9份、肺12份、肾12份、睾丸12份、脑11份；普通RT-PCR检测到的阳性组织样品数量分别为心8份、肝6份、脾6份、肺10份、肾8份、睾丸12份、脑7份(图5)。经计算，二者对7种组织脏器检测结果的阳性符合率均为100%，总阳性符合率也为100%(57/57)。同时本研究结果显示，GETV在不同组织中的检出率存在差异，其中心、肝、肺、肾及脑的检出率最高，可以作为检测更为准确的取样点。以上结果表明，本研究建立的Man荧光定量RT-PCR方法相较于传统的RT-PCR方法敏感性更高，可以用于GETV感染组织样品的检测。3讨论近年来，GETV的宿主范围和地理分布迅速扩大，在鸡、鸭和鸟类的血清标本中也检测到GETV抗体5,19，表明GETV的宿主范围已经扩大到禽类，其结构蛋白中关键氨基酸的突变使其对宿主的适应性增强，鸟类，特别是候鸟的感染可能导致病毒通过其长途迁徙而大范围扩散20。可见，GETV对动物健康以及公共卫生安全的威胁日益严重。而目前尚无疫苗及特异性药物可用，因此，建立快速灵敏的检测方法对GETV流行病学调查和新发疫情预警具有重要意义。病毒中和试验和ELISA等也是检测GETV的常规血清学检测方法。但是血清学检测存在一些不足，例如抗体检测的结果可能会受到其他病毒抗体影响，另外该方法在病毒感染的早期很难检测出来，并且样品在保存过程中很有可能因为抗原降解而降低结果的准确性。而核酸检测方法由于其敏感性和特异性优于传统检测技术，已成为实验室和临床诊断的常用方法21。目前已经有报道针对GETV的检测方法，如cDNA-RAPD10、反转录环介导的等温扩增12、重组酶介导的温扩增13、PCR和荧光定量PCR11等。基于SYBR Green I建立的方法已被广泛用于检测和定量临床样本中的GETV22。因此，本研究选择建立针对GETV核酸的检测方法。目前，GETV的主要检测靶标为E1、E2、E3等结构蛋白基因8，而GETV的非结构蛋白早于结构蛋白开始翻译22。非结构多蛋白按顺序调节病毒负链RNA、基因组RNA和亚基因组RNA的合成，其中非结构蛋白nsP3是病毒复制复合物的组成成员之一，其是病毒复制的关键非结构蛋白，该蛋白既存在于图5Man荧光定量RT-PCR及普通RT-PCR对GETV感染小鼠组织样品的检测结果Fluorescence quantitativeMan PCRRT-PCRHeartLiverSpleenLungBrainKidneyTestis14121086420中 国 预 防 兽 医 学 报2023年914膜结合复合物中，也存在于较大的细胞质复合物中23。因此，本研究选择nsP3作为靶基因，这对于感染早期的病毒也能准确检测，且敏感性更高。已经有报道的针对GETV的检测方法中有cDNA-RAPD10、反转录环介导的等温扩增12、重组酶介导等温核酸扩增13、PCR和荧光定量PCR11等。基于SYBR Green I建立的方法已被广泛用于检测和定量临床样本中的GETV24。然而，由于其能够结合任何双链DNA，非特异性结合可能导致结果的低特异性。相反，基于Man的荧光定量PCR方法具有更强的特异性和更高的敏感性。本实验建立的GETVMan荧光定量PCR检测方法其最低检测限可达30.7拷贝/滋L，且该方法在对多种病毒检测时对于其他病毒无阳性扩增反应，可以特异性的检出GETV，具有灵敏高且特异强的优点。另外，组内以及组间重复性试验结果显示组内组间变异系数均小于2%，表明该方法的重复性较好，可以稳定且特异的检测GETV。本研究建立的Man荧光定量PCR方法检测人工感染GETV小鼠的不同组织脏器，发现在小鼠的各个组织脏器中均有GETV存在，但各组织的病毒载量有所不同，表明GETV在小鼠体内具有广泛的组织噬性。另外发现在小鼠的脾、肺脏及睾丸内病毒载量很高，可见GETV主要攻击小鼠的免疫器官，且可能会对雄性小鼠的生殖功能造成影响。综上所述，本实验首次建立的基于盖他病毒nsP3基因的Man荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性和灵敏度，且快捷低廉，为GETV的监测及诊断等提供了有力的技术支持。参考文献：FONG S W,KINI R M,NG L F P.Mosquito saliva reshapesalphavirus infection and immunopathogenesis J.J Virol,2018,92(12):1004-1017.ZHAI YOU-GANG,WANG HUAN-YU,SUN XIAO-HONG,etal.Complete sequence characterization of isolates of Getah virus(genus Alphavirus,family Togaviridae)from China J.J GenVirol,2008,89(Pt 6):1446-1456.赵伟.基于猪盖他病毒E2蛋白的间接ELISA方法的建立初步应用D.长春：吉林农业大学，2022：12-14.SOUZA-SOUZA K F C,GONCALVES-DE-ALBUQUERQUE CF,CIRNE-SANTOS C,et al.Alphavirus replication:the role ofcardiacglycosides 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