华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因PcoPMK克隆与表达分析.pdf

Vol.44 No.3Mar.2024第 44 卷 第 3 期2024 年 3 月中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Journal of Central South University of Forestry&Technologyhttp:/收稿日期：2023-08-04基金项目：湖南省自然科学基金项目（2023JJ30358）；湖南省林业科技创新杰出青年培养科研项目（XLK202108-6）。第一作者：舒东膂（），副研究员。通信作者：严佳文（），副研究员，博士。引文格式：舒东膂,李建挥,禹霖,等.华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因 PcoPMK 克隆与表达分析 J.中南林业科技大学学报,2024,44(3):117-125.SHU D L,LI J H,YU L,et al.Cloning and expression analysis of phosphomevalonate kinase gene PcoPMK in Prunus conradinaeJ.Journal of Central South University of Forestry&Technology,2024,44(3):117-125.华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因 PcoPMK 克隆 与表达分析舒东膂，李建挥，禹 霖，柏文富，杨 扬，胡景堃，严佳文（湖南省植物园，湖南 长沙 410116）摘 要：【目的】克隆华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因 PcoPMK 的 cDNA 序列，分析该基因在华中樱YS01不同发育阶段花瓣中的表达情况及其编码蛋白质的结构特征和理化性质，为进一步研究 PcoPMK 基因在华中樱萜烯类物质合成途径中的功能提供参考。【方法】参照近缘物种的 PMK 同源基因 cDNA 保守序列设计特异性引物，应用 RT-PCR 技术扩增 PcoPMK 基因的 cDNA 序列，并进行克隆测序，同时应用定量 RT-PCR 技术分析该基因在YS01不同发育阶段花瓣中的表达情况。应用 ORF Finder 在线工具预测基因的开放阅读框及编码的蛋白质序列；分别应用 ExPASy、SOPMA、Swiss model 和 CDD 在线工具分析蛋白质的理化性质、二级、三级结构和功能结构域；分别应用 DeepTMHMM、SINALP 4.0 Server 和 PredictProtein 在线程序预测蛋白质的跨膜结构、信号肽和亚细胞定位；应用 MEGA7.0 软件构建基因的系统进化树。【结果】华中樱 PcoPMK 基因开放阅读框序列大小为 1 530 bp，编码 509 个氨基酸，GenBank 登录号为 OR373074。编码蛋白质的相对分子量为 55.199 kD，理论等电点为 5.68，属于亲水性的稳定蛋白，定位于细胞质。PcoPMK 蛋白与扁桃、烟草和拟南芥等代表性物种 PMK 同源蛋白的序列相似度较高，含有 3 个典型且保守的蛋白结构功能域和 1 个 ATP 结合位点，无跨膜螺旋和信号肽，属于非分泌蛋白。PcoPMK 基因在华中樱YS01盛开期花瓣中的相对表达量显著高于花蕾期和半开期（P 0.05），与同时期花瓣中萜烯类香气物质的含量变化规律一致。【结论】本研究成功克隆了华中樱 PcoPMK 基因，初步推测其可能在花瓣萜烯类物质合成途径中发挥重要作用，为进一步研究该基因的生物学功能提供了参考。关键词：华中樱；磷酸甲羟戊酸激酶基因；RT-PCR；基因克隆中图分类号：S792.99 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2024)03-0117-09Cloning and expression analysis of phosphomevalonate kinase gene PcoPMK in Prunus conradinaeSHU Donglyu,LI Jianhui,YU Lin,BAI Wenfu,YANG Yang,HU Jingkun,YAN Jiawen(Hunan Botanical Garden,Changsha 410116,Hunan,China)Abstract:【Objective】The objective of this study was to clone the cDNA sequence of the phosphomevalonate kinase gene of Prunus conradinae,and analyze the expression level of this gene in the petals of the YS01 at different developmental stages,as well as the structural characteristics and physicochemical properties of the encoded protein,so as to provide a reference for further research on the function of PcoPMK gene in the synthesis pathway of terpenoids in P.conradinae.【Method】The specific primers had been designed with reference to the conserved cDNA sequence of homologous PMK gene of related species.The cDNA sequence of the PcoPMK gene was amplified using RT-PCR technology,and cloned for sequencing.In addition,quantitative RT-PCR technology was used to analyze the expression level of the gene in the petals of YS01 at different developmental stages.ORF Finder online tool was used to predict gene open reading frame and encoded protein sequence.The physicochemical properties,secondary structures,tertiary structures,and functional domains of the PcoPMK protein were analyzed using ExPASy,SOPMA,Swiss model,and CDD online tools,respectively.The transmembrane structure,signal peptide and subcellular localization of the PcoPMK protein were predicted by DeepTMHMM,Doi:10.14067/ki.1673-923x.2024.03.012舒东膂，等：华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因 PcoPMK 克隆与表达分析118第 3 期华中樱 Prunus conradinae 又叫华中樱桃，是中国特有的野生樱花，生长于海拔 500 2600 m的沟边林中1。华中樱分布广泛，适应性强，自然条件下与其他樱属植物发生天然杂交的现象较为常见2，因此具有较高的遗传变异和形态多样性3-5，主要表现为花色、花型、花期等表型差异6。近期研究表明，华中樱的香气性状也存在明显差异：如新品种婉梅7、楚锦8和大多数野生资源没有香气或香气不明显；而野生资源YS019则花朵芳香，其盛花期花瓣中共有49种香气物质，其中萜烯类化合物有 4 种，相对含量为 6.13%，是YS01盛花期花瓣中的主要香气成分9。植物组织中的萜烯类化合物通过甲羟戊酸途 径（mevalonate pathway，MVA）和 甲 基 赤 藓醇 磷 酸 途 径（methylerythritol phosphate pathway,MEP）合成，其底物是异戊二烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate,IPP）和 二 甲 烯 丙 基 焦 磷 酸（dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP）10。MVA途径合成 IPP 和 DMAPP 涉及 6 个关键酶，其中磷酸甲羟戊酸激酶（phosphomevalonate kinase，PMK）是该途径中重要的限速酶，其功能是转移腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）上的 磷酸基团到甲羟戊酸-5-磷酸（mevalonate-5-phosphate,MVAP），生 成 甲 羟 戊 酸-5-二 磷酸（mevalonate-5-pyrophosphate,MVAPP）11。PMK 酶是萜烯类物质合成途径中的关键酶之一，是重要的调控位点12。Sando 等13克隆了橡胶树（Hevea brasiliensis）HbPMK 基因并应用酵母功能互补实验分析了其功能。Woo 等 14在大肠杆菌中过量表达黄花蒿（Artemisia annua）AaPMK 基因，成功地将转化菌株中的萜烯类化合物含量提高了 3 倍。Yuan 等15分析了与芍药苷及其衍生物生物合成相关的 24 个候选基因的表达情况，结果表明芍药（Paeonia lactiflora）PlPMK 基因的表达量与芍药苷和苯甲酰芍药苷等单萜苷类物质的含量显著正相关。Pathak 等16将杧果（Mangifera indica）MiPMK 基因沉默后，发现果实中的香叶基香叶醇、反式法尼醇和-石竹烯等萜烯类物质及其衍生物的含量显著降低。以上研究结果进一步证实了 PMK 基因在植物萜烯类物质合成途径中发挥重要作用，此外，丹参 Salvia miltiorrhiza17、拟 南 芥 Arabidopsis thaliana18、阳 春 砂 Amomum villosum19、独 行 菜 Lepidium apetalum20、茉莉 花 Jasminum sambac21、香 樟 Cinnamomum camphora22、小 麦 Triticum aestivum23、白 檀Santalum album24、紫苏 Perilla frutescens25、菊叶薯蓣 Dioscorea composita26和茅苍术 Atractlodes lancea27等植物的 PMK 同源基因也已被成功克隆。华中樱 PMK 同源基因尚未见研究报道，其在花瓣萜烯类物质合成途径中的生物学功能还不清楚。本研究以花朵香气明显的华中野生樱资源YS01为材料，参考甜樱桃 Prunus avium、梅花 P.mume 和扁桃 P.dulcis 等近缘物种的 PMK 同源基因 cDNA 序列设计特异性引物，采用 RT-PCR技术从 YS01 盛花期花瓣中克隆了PcoPMK基因，并分析了其编码蛋白质的结构特征以及在 YS01不同发育阶段花瓣中的表达情况，以期为进一步研究 PcoPMK 基因的功能，阐明华中樱萜烯类物质的生物合成途径奠定基础。1 材料与方法1.1 试验材料采集华中樱野生资源YS01花蕾期（开放前5 d）、半开期和盛开期3个发育阶段花瓣各5 g，液氮速冻10 min，置于-80 超低温冰箱保存备用。1.2 试验方法1.2.1 RNA 提取和 cDNA 合成华中樱野生种质YS01不同发育阶段花SINALP 4.0 Server and PredictProtein online programs,respectively.The phylogenetic tree of the PcoPMK gene was constructed using MEGA7.0 software.【Result】The open reading frame sequence of PcoPMK gene in P.conradinae was 1 530 bp in length,encoding 509 amino acids.PcoPMK protein belonged to hydrophilic stable protein without transmembrane helix and signal peptide,which was located in the cytoplasm.Its relative molecular weight was 55.199 kD,and theoretical isoelectric point was 5.68.The PcoPMK protein had high sequence similarity with PMK homologous proteins of representative species,such as almond,tobacco,and arabidopsis.It contained three typical and conservative domains,and one ATP binding site.The relative expression level of the PcoPMK gene in the petals of the full opening stage was significantly higher than that in bud and half opening stage in P.conradinae YS01(P 0.05),which was consistent with the trend of changes in the content of aromatic terpenes in the petals.【Conclusion】In this study,the PcoPMK gene is successfully cloned,and it is speculated that it may play an important role in the synthesis pathway of terpenes in the petals of P.conradinae YS01.These results will provide a reference for further research on the biological function of PcoPMK gene in P.conradinae.Keywords:Prunus conradinae;phosphomevalonate kinase gene;RT-PCR;gene cloning119中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷瓣总 RNA 提取方法参照植物总 RNA 提取试剂盒（Vazyme，#R701）说 明 书。应 用 NanoDrop 2000c 微量分光光度计（Thermo scientific）和 1%琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 浓度和纯度，具体参照张美玲等28的方法。质量合格的样品用于cDNA第一链合成，具体方法参考试剂盒（Vazyme，#R212）说明书。制备的cDNA置于-30 冰箱备用。1.2.2 基因克隆和测序在 NCBI 数 据 库（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载华中樱近缘物种的 PMK 同源基因的cDNA 序列，物种和基因登录号分别为甜樱桃（XM_021952904.1）、梅花（XM_016795883.1）、扁 桃（XM_034360282.1）和 桃（P.persica）（XM_020564058.1）。应用 DNAMAN9.0 软件对4 个近缘物种的 PMK 同源基因 cDNA 序列进行多重比对，应用 Primer premier 6.0 软件在 5 端和 3端的高度保守区设计 PCR 特异性引物（表 1），RT-PCR扩增华中樱PMK同源基因的cDNA序列，PCR 反应体系及程序参照试剂（Vazyme，#P505）说明书，退火温度设置为 54。PCR 产物纯化后连接到 pCE2TA/Blunt-Zero 载体，然后热激转化至DH5 大肠杆菌感受态细胞（Vazyme，#C502），在含 100 g/mL 氨苄青霉素（Coolaber，#CA2031-5 g）的 LB 固体培养基培养 16 h，PCR 产物纯化和热激转化方法参照试剂盒（Vazyme，#DC301；#C601-01）说明书。随机挑选 10 个单菌落，以M13 通用引物进行 PCR 鉴定，反应体系及程序参照 TA 克隆试剂盒（Vazyme，#C601-01）说明书。阳性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。表 1 基因克隆与定量 RT-PCR 引物Table 1 The primers for gene cloning and quantitative RT-PCR analysis引物用途 Primer application引物编号 Primer No.引物序列（5-3）Primer sequences基因克隆PcoPMKFCCAACTACTGAGAGTCCGAGAG Gene cloningPcoPMKRCACACTCTAATACAATTCCTCTTGC定量 RT-PCRqPcoPMKFAGCAAGCCGCTAAACCAAACQuantitative RT-PCRqPcoPMKRATCAAACCCACCTGCTCCAActinFGATGCTGAGGACATTCAACCCActinRCCAGCAAGGTCCAGACGAAG1.2.3 基因序列分析和进化树构建应用 ORF Finder(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测基因的开放阅读框及其编码的氨基酸序列；应用 ExPASy 在线工具（https:/web.expasy.org/protparam/）分析蛋白质的分子量、理论等电点、稳定性和亲水性等理化性质；分别应用SOPMA 在线工具(https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和 Swiss model 在 线 工 具(http:/swissmodel.expasy.org/)预测蛋白质的二级和三级结构；应用 CDD 在线工具(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析蛋白质结构和功能域；蛋白质的跨膜结构和信号肽预测分别通过 DeepTMHMM(https:/ SINALP 4.0 Server(http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在 线程序进行分析。蛋白亚细胞定位应用 PredictProtein在线程序（https:/predictprotein.org/）进行预测。在 NCBI 数据库检索并下载不同植物的 PMK 同源蛋白序列，应用 MEGA7.0 软件进行序列比对和系统进化树的构建，具体参照赵雅欣等29的方法。1.2.4 基因表达分析参照华中樱 PMK 同源基因序列及其近缘物种看家基因 ACTIN 的保守序列，以 Primer premier 6.0 软件设计定量 RT-PCR 引物。应用 BIO-RAD CFX96 Touch荧光定量PCR检测系统分析目的基因在不同发育阶段花瓣中的表达水平。两步法荧光定量PCR程序为：95 5 min，95 10 s，60 30 s，40 次循环，72 单点检测信号；溶解曲线：95 15 s，60 60 s，95 15 s，连续检测信号。荧光定量 PCR 反应体系参照试剂盒（Vazyme，#Q311-02）说明书。试验设置 3 次生物学重复，采用 2CT法计算不同样品中 PcoPMK 基因的相对表达量，数据应用 SPSS 22.0 软件进行统计分析。2 结果与分析2.1 PcoPMK 基因克隆和序列分析以盛开期花瓣总 RNA 合成的 cDNA 为模板，PCR 扩增 PcoPMK 基因的 cDNA 序列，电泳检测结果（图 1）显示，特异性PCR产物大小约1 700 bp，与预期产物大小接近。通过克隆测序进一步确定PCR 产物大小为 1 711 bp，其中开放阅读框序列大小为 1 530 bp（图 2），编码 509 个氨基酸。PcoPMK 基因 cDNA 序列已提交到 GenBank 数据舒东膂，等：华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因 PcoPMK 克隆与表达分析120第 3 期库，登录号为 OR373074。M.DNA marker DL5 000；1.PcoPMK 基因 cDNA 序列 PCR 扩增产物。M.DNA marker DL5 000;1.PCR product of cDNA fragment of PcoPMK.图 1 PcoPMK 基因 cDNA 序列 PCR 产物凝胶电泳结果Fig.1 PCR amplification result on agarose gel of cDNA fragment of PcoPMK2.2 PcoPMK 蛋白的理化性质和亚细胞定位经 ExPASy 在线软件预测，PcoPMK 基因编码蛋白分子式为 C2 462H3 912N656O755S13，相对分子量为55.199 kD，理论等电点为 5.68。该蛋白带负电荷的残基总数（天门冬氨酸和谷氨酸）为 56，带正电荷的残基总数（精氨酸和赖氨酸）为 47，不稳定性指数（Instability index）为32.64，属于稳定蛋白；脂肪系数（Aliphatic index）为 94.11，总平均亲水性指数（Grand average of hydropathicity）为-0.095，为亲水性蛋白。亚细胞定位预测结果显示，该蛋白定位于细胞质。下划线序列为基因的开放阅读框。The underlined sequences represent open reading frame of the gene图 2 PcoPMK 基因的 cDNA 序列Fig.2 The cDNA sequence of PcoPMK gene2.3 PcoPMK 蛋白的结构分析PcoPMK蛋白与扁桃、烟草Nicotiana tabacum、拟南芥和玉米 Zea mays 等代表性物种 PMK 同源蛋白的序列相似度分别为 98.23%、74.51%、72.89%和66.34%。蛋白功能结构域分析结果显示，PcoPMK 蛋白具有 3 个典型且保守的蛋白结构功能域，分别是 10 至 18 位氨基酸基序 GKVLLTGGY，第 181 至 188 位氨基酸基序 KTGLGSSA 和 442 至450 位氨基酸基序 LAGVPGAGG，其中第 2 个保守结构功能域还含有 ATP 结合位点 GLGSSA（图 3）。PcoPMK蛋白二级结构中的螺旋占42.24%，延伸链占 13.16%，折叠占 3.73%，无规则卷曲占40.86%（图 4a）。用于三级结构建模的氨基酸残基范围为 2 489，蛋白三维结构模型见图 4b。PcoPMK 蛋白信号肽预测结果显示，第 1 位的甲硫氨酸残基的最高信号肽分值为0.291（图5），第 12 位的缬氨酸残基的最高综合剪切位点分值为0.155，1 11 位氨基酸残基的加权平均信号肽分值为 0.155，远小于 0.5，推测 PcoPMK 蛋白无信号肽，属于非分泌蛋白。PcoPMK 蛋白的跨膜结构域预测结果显示，存在跨膜螺旋可能性的分值仅为 0.103，说明该蛋白无跨膜螺旋（图 6）。结合蛋白信号肽和跨膜结构预测结果，推测 PcoPMK 蛋白在细胞质合成后不能转运到细胞核或其他细胞器，可能主要在细胞质基质中的特定位置发挥其催化功能。2.4 PcoPMK 蛋白系统进化分析PcoPMK 蛋白与另外 23 种植物的 PMK 同源121中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷蛋白的系统进化分析结果显示，PcoPMK 与扁桃PdPMK 蛋白的亲缘关系最近，与拟南芥、烟草和甜橙等双子叶植物聚为一支；水稻、玉米和高粱等单子叶植物的 PMK 同源蛋白则聚为另一支（图7）。根据 PMK 蛋白序列构建的进化树可以很好地区分单子叶植物与双子叶植物。红色方框位置为 3 个保守氨基酸基序；红色下划线位置为 ATP 结合位点。Red frames indicate conserved motifs;text underline position indicate ATP binding site.图 3 华中樱与其他植物 PMK 蛋白序列多重比对Fig.3 Multi-alignment of amino acid sequences of PcoPMK protein and other PMK homologous proteins（a）二级结构，蓝色代表 螺旋；红色代表延伸链；绿色代表 折叠；紫色代表无规则卷曲。（b）三级结构。(a)Two-dimensional structure;Blue,helix;Red,extended strand;Green,turn;Purple,random coil.(b)Three-dimensional structure图 4 PcoPMK 蛋白二级结构和三级结构Fig.4 Two-dimensional and three-dimensional structure of PcoPMK protein2.5 PcoPMK 基因表达量分析应用定量 RT-PCR 分析了 PcoPMK 基因在华中樱资源YS01不同发育时期花瓣中的表达水平。PcoPMK 基因在盛开期花瓣中的相对表达量为 3.420.19，显著高于花蕾期（1.080.09）和半开期（1.010.07）花瓣中的表达量（P 0.05）（图 8）。舒东膂，等：华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因 PcoPMK 克隆与表达分析122第 3 期图 5 PcoPMK 蛋白信号肽预测Fig.5 Prediction of signal peptide in PcoPMK protein图 6 PcoPMK 蛋白跨膜螺旋预测结果Fig.6 Prediction of transmembrane helices in PcoPMK protein3 结论与讨论3.1 讨 论樱花花瓣香气物质研究主要涉及物质鉴定和活性分析9,30-31，其合成途径解析、关键酶基因鉴定和分子调控机制研究尚未见报道。本研究以花朵香气浓郁的华中樱野生资源YS01为研究对象，克隆了甲羟戊酸途径中的磷酸甲羟戊酸激酶基因 PcoPMK。PcoPMK 蛋白与扁桃、烟草和拟南芥等物种PMK同源蛋白同源性较高，且与香樟22、小麦23、白檀24和茅苍术27等植物的 PMK 同源蛋白的功能结构域较为一致，都包含 3 个典型的GHMP 激酶结构域和 1 个酶活性位点。此外，蛋白序列的系统进化分析结果显示，PcoPMK 与拟南芥 AtPMK、烟草 NtPMK 等功能已经明确的 PMK同源蛋白聚为一支，进化较为保守。基于蛋白序列结构分析，可确定本研究克隆的 PcoPMK 基因是磷酸甲羟戊酸激酶同源基因，属于 GHMP 激酶超级家族成员。植物 PMK 蛋白的亚细胞定位情况因物种而异，拟南芥 AtPMK 和长春花 CrPMK 蛋白定位于过氧化物酶体32，而独行菜 LaPMK20、茉莉花JsPMK21和白檀 SaPMK24等则定位于细胞质。PcoPMK 亚细胞定位预测结果显示其定位于细胞图 7 华中樱与其他物种 PMK 蛋白的系统进化树Fig.7 Phylogenetic tree of PMK proteins from P.conradinae and other species123中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷质，与 LaPMK、JsPMK 和 SaPMK 等的亚细胞定位较为一致；信号肽和跨膜结构预测结果表明，PcoPMK 没有信号肽和跨膜结构，暗示着其不能转运至细胞核或其他细胞器，只能在细胞质中行使功能，符合 MVA 途径是在细胞质中合成萜烯类物质的理论10。植物花朵合成香气物质的酶类主要分布于花瓣的表皮细胞，且香气物质的合成和释放受花发育调节33-34。为了探讨华中樱 PcoPMK 基因的表达水平与萜烯类香气物质含量之间的关系，本研究分析了该基因在花蕾期、半开期和盛开期花瓣中的表达情况。结果表明，PcoPMK 基因在盛开期花瓣中的表达水平显著高于半开期和花蕾期，与花瓣中萜烯类香气物质的含量变化趋势基本一致9。近年来，植物 PMK 同源基因在不同发育时期花瓣中的表达分析也有相关研究报道。花香成分以萜烯类物质为主的小依兰（Cananga odorata var.fruticosa）PMK 同源基因表达量随着花朵的盛开而逐渐上升35，在盛花期达到峰值；茉莉花香气成分以萜烯类和苯环型化合物为主，JsPMK 基因的表达量在盛开期花瓣中最高，与香气物质的含量正相关36。华中樱 PcoPMK 基因与依兰、茉莉花 PMK 同源基因在不同发育时期花瓣中的表达模式较为一致，且都与花瓣中萜烯类香气物质的含量正相关，暗示着 PcoPMK 基因可能在华中樱花瓣萜烯类物质合成过程中发挥重要作用。后续将通过原核表达获得 PcoPMK 蛋白，进行酶活性分析，并应用 GFP 融合蛋白表达法进一步确定蛋白的亚细胞定位；通过酵母功能互补试验或模式植物异源过表达验证 PcoPMK 的功能，为解析华中樱萜烯类香气物质的合成代谢机理奠定基础。3.2 结 论本研究成功克隆了华中樱磷酸甲羟戊酸激酶同源基因 PcoPMK，其在华中樱YS01盛花期花瓣中的表达量显著高于花芽和半开期花瓣，且编码蛋白含有典型的 PMK 同源蛋白功能结构域，推测其可能在花瓣萜烯类物质合成途径中发挥重要作用。参考文献：1 WU Z Y,RAVEN P H,HONG D Y.Flora of China:Pittosporaceae through ConnaraceaeM.Beijing:Science Press/St.Louis:Missouri Botanical Garden Press,2003:417.2 柏文富,张文昕,禹霖,等.不同樱属植物叶形态与解剖结构的比较 J.中南林业科技大学学报,2022,42(8):15-26.BAI W F,ZHANG W X,YU L,et al.Comparison of leaf morphology and anatomical structures of different Cerasus speciesJ.Journal of Central South University of Forestry&Technology,2022,42(8):15-26.3 SHI S,LI J L,SUN J H,et al.Phylogeny and classification of Prunus sensulato(Rosaceae)J.Journal of Integrative Plant Biology,2013,55(11):1069-1079.4 董京京,陈洁,杨宏,等.华中樱桃适生区模拟和生态特征分析 J.南京林业大学学报(自然科学版),2022,46(3):213-221.DONG J J,CHEN J,YANG H,et al.Simulation and analyses of ecological characteristics of Cerasus conradinae adaptability areaJ.Journal of Nanjing Forestry University(Natural Sciences Edition),2022,46(3):213-221.5 严佳文,柏文富,李建挥,等.湖南省华中樱群体遗传结构和多样性分析 J.植物遗传资源学报,2022,23(2):376-384.YAN J W,BAI W F,LI J H,et al.Genetic structure and diversity of Cerasus conradinae in Hunan provinceJ.Journal of Plant Genetic Resources,2022,23(2):376-384.6 叶小玲,胡晓敏,朱军.华中樱桃种子生物学特性研究初 探 J.广东园林,2022,44(3):77-80.YE X L,HU X M,ZHU J.Preliminary study on biological characteristics of Cerasus conradinae seedsJ.Guangdong Landscape Architecture,2022,44(3):77-80.7 蒋冬月,沈鑫,柳新红,等.华中樱新品种 宛梅 J.园艺学报,2022,49(S2):253-254.JIANG D Y,SHEN X,LIU X H,et al.A new Prunus conradinae cultivar WanmeiJ.Acta Horticulturae Sinica,2022,49(S2):253-254.8 章晓琴,孙宏兵,赵乐康,等.樱花新品种 楚锦 J.园艺学报,2022,49(S2):249-250.ZHANG X Q,SUN H B,ZHAO L K,et al.A new Cerasus conradinae cultivar ChujinJ.Acta Horticulturae Sinica,2002,49(S2):249-250.9 严佳文,李建挥,马涛,等.野生华中樱 YS01 花瓣挥发性成分与香气特征分析 J.中国野生植物资源,2023,42(7):16-25,38.YAN J W,LI J H,MA T,et al.Analysis of floral volatile components and aroma characteristics during flower development of wild Prunus conradinae YS01J.Chinese Wild Plant Resources,2023,42(7):16-25,38.10 VRANOV E,COMAN D,GRUISSEM W.Network analysis of the MVA and MEP pathways for isoprenoid synthesisJ.Annual Review of Plant Biology,2013,64:665-700.11 LIAO Z H,CHEN M,GONG Y F,et al.Isoprenoid biosynthesis in plants:pathways,genes,regulation and metabolic 舒东膂，等：华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因 PcoPMK 克隆与表达分析124第 3 期engineeringJ.Journal of Biological Sciences,2006,6(1):209-219.12 陈瑶,谢琴鼎,唐亚琴,等.植物萜类合成代谢途径及限速酶的研究进展 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