多年生黑麦草LpPIL15-like基因转录模式及耐逆功能分析.pdf

第 46 卷 第 2 期Vol.46 No.2 2024 年 2 月Feb.2024中 国 草 地 学 报Chinese Journal of Grassland多年生黑麦草 LpPIL15-like基因转录模式及耐逆功能分析关昊，姚佳明，张欣栎，王硕，宋欣瑶，刘信宝，张敬*，徐彬（南京农业大学草业学院，江苏 南京 210095）摘要：光敏色素互作因子（Phytochrome-interacting factors，PIFs）属于 bHLH 家族成员，在植物光信号传导、光形态建成和抗逆性等方面发挥重要作用。本研究基于已发表的多年生黑麦草转录组数据，克隆了逆境响应差异表达 PIF基因 LpPIL15-like，并初步分析其基因特征、转录模式及耐逆功能。LpPIL15-like基因具有 5个外显子，编码区全长为1671 bp，编码 556 个氨基酸，与硬直黑麦草 LrPIL15-like 基因亲缘关系最近。LpPIL15-like 蛋白具有典型的 bHLH结构域及 APB 和 APA 功能域，定位于细胞核。LpPIL15-like启动子中含有 ABRE、CGTCA-motif和 G-box 等激素、逆境和光响应顺式作用元件。定量分析表明，LpPIL15-like在伸展叶中表达量最高，在茎、根和叶鞘中表达量较低。此外，LpPIL15-like基因的表达受昼夜节律调控，在光照条件下的表达量显著高于黑暗条件。PEG、NaCl、CdCl2、高温胁迫以及 6-BA、ABA 等激素处理 0.5、2、6、12、24 h显著增强了叶片中 LpPIL15-like基因表达，而逆境胁迫和激素处理 0.5、2、6、12 h均显著抑制了 LpPIL15-like基因在根中的表达。异源过量表达 LpPIL15-like基因显著提高了酵母的耐盐、高温和干旱的能力。综上，LpPIL15-like的转录受昼夜节律、非生物逆境和植物激素调控，可作为黑麦草耐逆遗传改良的候选基因。关键词：多年生黑麦草；光敏色素互作因子；转录模式；非生物胁迫；耐逆功能中图分类号：S543.6 文献标志码：A 文章编号：1673-5021（2024）02-0024-11作为固着生物，植物必须整合各种环境信号，以维持正常的生长发育。在这些环境信号中，光不仅是光合作用的能量来源，也在调节植物气孔运动、胁迫反应和光形态建成等方面发挥重要作用1。植物光形态建成主要包括种子萌发、茎伸长、昼夜节律、避荫反应、开花时间等生长发育过程24。光敏色素（Phytochrome，PHY）是植物感知红光（R）和远红光（FR）的主要光感受器。在光照条件下，植物 PHY由非活性状态 Pr（Red-absorbing phytochrome）转换为活性状态 Pfr（Far red-absorbing phytochrome）5。非活性状态光敏色素 Pr 定位于细胞质，而活性状态 Pfr 则易位到细胞核，并与光敏色素互作因子（Phytochrome-interacting factors，PIFs）相互作用，从而调控光信号传导通路基因的表达6。PIFs 属于bHLH（Basic helix-loop-helix）家族成员转录因子，具有典型的 bHLH 结构域。bHLH 结构域通过与其靶基因启动子中的 G-box 顺式作用元件（CACGTG）特异性结合，进而调控植物光信号传导、光形态建成和抗逆性等79。PIFs 是光信号传导过程中的一类重要转录因子。Ni 等10通过筛选酵母双杂交文库首次鉴定到拟南芥（Arabidopsis thaliana）PIF3，Lee 等11从拟南芥中相继克隆出 8 个 PIF 成员，且它们的功能也不尽相同。在黑暗条件下，AtPIF1负调控原叶绿素与类胡萝卜素的生物合成和积累、子叶展开，促进植物暗形态建成；而在光照条件下，AtPIF1 迅速被蛋白酶体降解，进而启动植物叶绿素合成、子叶展开和茎生长等光形态建成1215。PIFs家族成员在调控植物耐逆境胁迫中也发挥重要作用。如：过量表达水稻（Oryza sativa）OsPIL1 基因不仅促进植株的下胚轴和茎伸长，还显著提高转基因株系的耐旱性16；在干旱胁迫下，玉米（Zea mays）ZmPIF1 和 ZmPIF3 通过降低蒸腾作用和叶片失水率，进而提高转基因植株的耐旱性1718；在黑暗条件下，拟南芥 PIF7 是促进下胚轴伸长等避荫反应的关键因子19；Jiang等20研究 发 现，拟 南 芥 PIF3 通 过 抑 制 冷 胁 迫 响 应 基 因COR 的表达，从而调控植株的耐冷性。此外，PIF3还 参 与 调 控 茉 莉 酸（Jasmonic acid，JA）和 赤 霉 素（Gibberellic acid，GA）等激素的合成和信号传导，进而影响水稻等植物的生长和生物胁迫抗性21。综上，PIFs 在调控植物光信号和激素信号传导、光形态建成和耐逆性等方面均发挥重要作用。DOI：10.16742/j.zgcdxb.20230199*通信作者，E-mail：收稿日期：2023-07-12；修回日期：2023-09-11基金项目：中央高校基本科研业务费（XUEKEN2022020）；国家自然科学基金项目（32371778）；中国博士后基金（2023M731733）作者简介：关昊（2000-），男，安徽亳州人，在读本科生，主要从事黑麦草抗逆机理研究，E-mail：.24关昊 姚佳明 张欣栎等 多年生黑麦草 LpPIL15-like基因转录模式及耐逆功能分析多年生黑麦草（Lolium perenne）为禾本科黑麦草属植物，是优质的冷季型牧草和草坪草22，但其耐高温、干旱和盐等逆境胁迫的能力弱。因此，挖掘黑麦草耐逆基因对于其遗传改良具有重要意义。但目前相关研究较少，尤其是多年生黑麦草 PIFs家族基因的克隆以及功能研究较为缺乏。鉴于 PIFs基因家族成员在植物抗逆性调控方面的重要作用，本研究从多年生黑麦草中克隆了 1 个 PIF 基因，命名为 LpPIL15-like，并初步探析其基因结构、表达模式和耐逆功能，研究结果可为黑麦草的分子育种提供优异基因资源，也可为耐逆调控机制解析提供理论基础。1材料与方法1.1试验材料与主要试剂本研究所用多年生黑麦草品种为 Buena Vista，种子购于先正达（Syngenta）公司。将种子播于底部置有湿润吸水纸的组培瓶中（6.5 cm宽，11 cm高），于人工气候室中萌发。气候室植物生长条件设置如下：25/20 （昼/夜），空气湿度 60%，光照/黑暗时间为12/12 h，光合有效辐射强度 750 mol/（m2 s）。待植株生长至约 6 cm 高时，取长势一致的黑麦草幼苗采用 Hoagland 营 养 液 培 养 两 周 后 进 行 逆 境 胁 迫（PEG、NaCl、CdCl2和高温）和植物激素（6-BA 和ABA）处理。植物 mRNA 提取试剂盒、质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购于 OMEGA BIO-TEK公司。高 保 真 DNA 聚 合 酶（Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase）和 反 转 录 试 剂 盒（HiScript Q RT SuperMix for qPCR kit）购于南京诺维赞生物科技股份有限公司。荧光定量试剂盒（MonAmpTM ChemoHS qPCR Mix）购于 Monad公司。多年生黑麦草原生质体提取所需的果胶酶（Macerozyme R-10）和纤维素酶（Cellulase R-10）均购于日本Yakult公司。1.2LpPIL15-like基因克隆及入门载体构建基于已发表的多年生黑麦草转录组数据选出 1个高温响应差异表达基因23，命名为 Phytochrome interacting factor 15-like（LpPIL15-like）。利用 BioXM软件预测 LpPIL15-like 的编码区（CDS）序列，并设计正向、反向全长引物（正向引物前加 BamH 酶切位点，反向引物前加 Hind 酶切位点，表 1）。以多年生黑麦草叶片 cDNA 为模板进行 PCR 扩增24。采用胶回收试剂盒纯化 PCR 产物，经 BamH 和Hind 双酶切后连接至入门载体 pEND-Linker。1.3LpPIL15-like基因和蛋白序列分析从 NCBI（https：www.ncbi.nlm.nih.gov/）和TAIR（https：www.arabidopsis.org/）数据库中检索水稻、拟南芥、柳枝稷（Panicum virgatum）、玉米、哈氏黍（Panicum hallii）、硬直黑麦草（Lolium rigidum）、海枣（Phoenix dactylifera）、椰子（Cocos nucifera）和油棕（Elaeis guineensis）等物种的 PIL15-like 基因序列。利用 MEGA 6.0 软件中的 ClustalW 程序对上述物种 PIL15-like 的氨基酸序列进行序列比对，并用 Neighbor-joining 程 序 构 建 系 统 进 化 树。采 用Protparam（Http：web.expasy.Org/protparam/）、MEME MEME-MEME Suite（meme-suite.org）和SOMPA（Sa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa utomat.pl？page=npsa_sopma.html）在线软件预测 LpPIL15-like蛋 白 的 分 子 式、保 守 基 序 和 二 维 结 构。采 用PlantCARE（Http：bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预 测 LpPIL15-like 上 游2000 bp启动子中的顺式作用元件。1.4LpPIL15-like 基因不同组织和昼夜节律表达模式分析取水培两周后黑麦草植株的根、茎、根茎节、叶鞘、伸展叶片、成熟叶片和衰老叶片等不同组织样品，液氮速冻，研磨充分后提取 mRNA，反转录成cDNA，利用罗氏荧光定量仪测定目的基因LpPIL15-like在各组织中的相对表达量。为测定目标基因响应昼夜节律的表达模式，将人工气候的光周期设定为白天和黑暗各 12 h，每 4 h取样，取样时长为 40 h，所取的样品用液氮速冻，研磨充分后提取 mRNA，并反转录为 cDNA，利用罗氏荧光定量仪测定目的基因 LpPIL15-like响应昼夜节律的转录模式25。表 1试验所用引物Table 1Primers used in the study引物名称Primer nameLpPIL15-like-CDSLpPIL15-like-qPCRLpeLF4A上游引物序列（5-3）Forward primer sequence（5-3）CGCGGATCCATGTCCGACGGCAACACCTCTTTGGTGCCACAGGCAACTCAACTTGAAGTGTTGGAGTG下游引物序列（5-3）Reverse primer sequence（5-3）CCCAAGCTTCTGTTTAGCTTCCTTGTTCAGAGAAGGTGGCAGAGAGCCGAAGATCTGGTCCTGGAAAGAATATG25中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 2 期1.5LpPIL15-like 基因响应逆境和激素的表达模式分析对水培两周后的黑麦草植株进行高温（38）、PEG 6000（15%）、NaCl（浓度 100 mmol/L）、CdCl2（浓度 100 mol/L）、ABA（浓度 50 mol/L）、6-BA（浓度 25 mol/L）处理，于处理 0.5、2、6、12、24 h 采集叶片和根样品，每处理 4个生物学重复，以未做任何处理的植株作为对照组。将叶片和根样品液氮速冻，研磨充分后提取 mRNA，反转录成 cDNA，用于测定目的基因 LpPIL15-like基因响应逆境和激素的表达模式。1.6LpPIL15-like亚细胞定位分析参照 Yu 等26的方法分离多年生黑麦草原生质体。采用 1.2中的方法构建 pEND-LpPIL15-like载体，用限制性内切酶 Pvu线性化，并与亚细胞定位载体 p2GWF7.0 进行 LR 重组反应，构建 LpPIL15-like融合 GFP蛋白。参照 Yu等26方法，将亚细胞定位载体 p2GWF7.0-LpPIL15-like 转化多年生黑麦草原生质体，室温避光孵育 12 h，采用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光信号。1.7酵母系统快速验证 LpPIL15-like的耐逆功能将 pEND-LpPIL15-like 载 体 用 限 制 性 内 切 酶Pvu线性化，并与 pGAD426 进行 LR 重组反应，获得 pGAD426-LpPIL15-like酵母过量表达载体。使用酵母转化试剂盒（Frozen-EZ）将酵母过量表达载体 pGAD426-LpPIL15-like 和 对 照 载 体（pGAD426-GUS）转化到酵母细胞g19 中，在酵母缺陷型固体培养基 SD-Ura 中，28 培养 3 d 后，选择单克隆SD-Ura液体培养基中培养至 OD600为 2，然后将菌液稀释 101、102、103、104、105和 106倍，分别在 300 mmol/L NaCl、0.5 mol/L 山梨醇（Sorbitol）固体培养基中培养 3 d，并采集酵母的生长表型。高温处理：将菌液稀释 101、102、103、104、105和 106倍接种于 SD-Ura固体培养基中，38 培养 3 d，采集酵母生长表型。1.8数据处理与分析采用 SPSS 23.0对基因的相对表达量进行统计并 进 行 差 异 显 著 性 分 析（P0.05），利 用 MEGA 6.0、Excel 2013和 Power point软件作图。2结果与分析2.1LpPIL15-like氨基酸序列及功能域分析LpPIL15-like（GenBank 登录号为 OR242734）具有 5 个外显子，4 个内含子，编码区全长 1671 bp，编码 556 个氨基酸（图 1-A）。LpPIL15-like 编码蛋白质的分子式为 C2557H4038N762O809S28，相对分子质量为59.30 kDa，等电点为 6.44，亲水性系数为0.456。从 TAIR和 NCBI数据库检索到 LpPIL15-like的同源蛋白，包括硬直黑麦草 LrPIL15-like、水稻 OsPIL15-like、玉米 ZmPIL15-like、哈氏黍 PhPIL15-like、柳枝稷 PvPIL15-like、海枣 PdPIL15-like、椰子 CnPIL15-like、油 棕 EgPIL15-like 和 拟 南 芥 AtPIF1-8/PIL1。进 化 分 析 结 果 表 明，LpPIL15-like 与 单 子 叶 植 物的 PIL15-like 蛋 白 聚 为 一 类，且 与 硬 直 黑 麦 草LrPIL15-like的遗传关系最近（图 1-B）。单子叶植物LpPIL15-like、LrPIL15-like、OsPIL15-like、ZmPIL15-like、PhPIL15-like 和 PvPIL15-like 中共鉴定到 6 个保守基序（图 1-C），其中，基序 4包含活性光敏色素B（APB）结构域，基序 1 和基序 3 包含 bHLH 结构域（图 1-D）。氨 基 酸 序 列 比 对 结 果 表 明，这 些PIL15-like 同源蛋白均含有 APB、APA 和 bHLH 等PIF 类转录因子典型的功能域（图 2-A）。蛋白二级结构分析结果表明（图 2-B），LpPIL15-like 含有-螺旋（Hh）、延伸链（Ee）、-转角（Tt）和无规则卷曲（Cc）。2.2LpPIL15-like亚细胞定位分析将 亚 细 胞 定 位 载 体 p2GW7.0-LpPIL15-like-GFP 转化至黑麦草原生质体中，在激光共聚焦显微镜下观测绿色荧光蛋白信号，结果发现荧光信号与DAPI（细胞核染液）信号重叠（图 3），说明 LpPIL15-like定位于细胞核。2.3LpPIL15-like 启动子中激素、逆境和光响应顺式作用元件分析从表 2 可以看出，LpPIL15-like 启动子（起始密码子上游 2000 bp）含有光、逆境和植物激素响应顺式作用元件。其中，光响应元件有 G-box、CTAG-motif 和 TCT-motif 等，逆境元件有 LTR 和 STRE等，此外，还包含脱落酸响应元件 ABRE、茉莉酸甲酯响应元件 CGTCA-motif和 TGACG-motif、水杨酸响应元件 TCA-element 和赤霉素响应元件 P-box。上述结果表明，LpPIL15-like 可能调控植物的昼夜节律、激素信号传导和抗逆性等。2.4不同组织和光照条件下 LpPIL15-like 的表达模式分析荧光定量分析结果表明（图 4-A），LpPIL15-like在叶片（伸展叶、成熟叶、老叶）中的相对表达量显著高于根、茎、叶鞘和根茎节等组织；其中，伸展叶26关昊 姚佳明 张欣栎等 多年生黑麦草 LpPIL15-like基因转录模式及耐逆功能分析中 LpPIL15-like 的相对表达量最高，而根中的相对表达量最低，说明 LpPIL15-like 可能在地上部尤其是叶片中发挥作用。如图 4-B 所示，LpPIL15-like的转录模式受昼夜节律调控，LpPIL15-like 的相对表达量在光照条件下显著高于黑暗条件。在光照开始后（012 h 和 2436 h），LpPIL15-like 的表达量逐渐增加，且维持在较高水平；而在黑暗开始后（1224 h 和 3640 h），基因的表达量显著下降，且处于较低水平；说明 LpPIL15-like 是受昼夜节律调控的 PIF类转录因子。LrPIL15-likeLpPIL15-likeOsPIL15-likeZmPIL15-likePhPIL15-likePvPIL15-likePdPIL15-likeCnPIL15-likeEgPIL15-likeAtPIF1AtPIF3AtPIF4AtPIF5AtPIF7AtPIF8AtPIF6AtPIL10.10RINEKMRALQELIPNCNKIDKASMLDEAIEYLKTLQLQVQMMSMGSGLCIMAHFPHLGMGLGYGMGVFDMNSTLRRSGSRGTKRSRTAEVHNLSERRRRDMSDGNEFAELLWENGQAVVHGRDNNGDDDTVPWIHYPIIEDDDKRKAQAECSASQDDDLDDESGMotif E-valueMotif symbolMotif consensus4.2e-2072.0e-0735.0e-0721.3e-0673.1e-0604.6e-048123456LrPIL15-likeLpPIL15-likeOsPIL15-likeZmPIL15-likePhPIL15-likePvPIL15-like1.16e-1715.73e-1785.06e-1812.85e-1788.77e-1623.43e-180Name P-valueMotif locations992879510466936695444LpPIL15-likeABCDA：LpPIL15-like的基因结构，黑色框代表外显子，白色框代表内含子；B：不同物种 PIL15-like同源蛋白的系统进化树，菱形标注为多年生黑麦草 LpPIL15-like。PIL15-like同源蛋白的 NCBI登陆号为：多年生黑麦草 LpPIL15-like（OR242734）、硬直黑麦草 LrPIL15-like（XP_047058199）、水稻 OsPIL15-like（XP_015619034）、玉米 ZmPIL15-like（NP_001347940）、哈氏黍 PhPIL15-like（XP_025817917）、柳枝稷 PvPIL15-like（XP_039808219）、海枣 PdPIL15-like（XP_026663328）、椰子 CnPIL15-like（EHA8586649）、油棕 EgPIL15-like（XP_010941466）、拟南芥 PIFs家族蛋白 登录号参见拟南芥（TAIR https：www.arabidopsis.org/）数据库；C和 D为不同单子叶植物中 PIL15-like同源蛋白进化和保守功能域。A：The gene structure of LpPIL15-like，with black boxes representing exons and gray boxes representing introns；B：Evolutionary tree showing homologous PIL15-like proteins from different species，with a diamond indicating perennial ryegrass LpPIL15-like.The NCBI accession numbers for the homologous proteins are as follows：LpPIL15-like（OR242734），LrPIL15-like（XP_047058199），OsPIL15-like（XP_015619034），ZmPIL15-like（NP_001347940），PhPIL15-like（XP_025817917），PvPIL15-like（XP_039808219），PdPIL15-like（XP_026663328），CnPIL15-like（EHA8586649），EgPIL15-like（XP_010941466），and Arabidopsis thaliana PIFs family proteins（accession numbers can be found in the Arabidopsis thaliana（TAIR https：www.arabidopsis.org/）database）.C and D present the evolutionary and conservative functional domain analysis results of PIL15-like homologous proteins across various monocotyledons.图 1LpPIL15-like基因结构及其同源蛋白的进化和保守基序分析Fig.1Gene structure，phylogenetic and conserved motif analysis of LpPIL15-like and its homologous proteins27中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 2 期Loop 45PhPIL15-like_Pa 40PvPIL15-like_Pa 92ZmPIL15-like_Ze 37LpPIF1-aa 37LrPIL15-likeLol 40OsPIL15-like_Or.M.L.H.C.T.Y.L.R.R.P.F.P.V.L.C.S.P.T.P.Y.L.M.S.K.E.P.C.C.S.H.H.L.H.Q.A.K.R.V.S.S.V.L.S.Q.L.R.A.M.P.Y.T.V.P.G.G.C.T.RMMMMMSSSSSSDDDDDDGGSGGGNNSNNNEEDEEDFFFFFFAAAAAAEEEEEELLLLLLLLLLLLWWWWWWEEEEEENNNNNNGGGGGGQHQQQQAAAAAAVVVVVVVVVVVVHHHHHHGGAGGGRRRRRRRRTRRKKKRKKKQQKHHHPPHPPPPPPQQQQQPPPPTTQAAASSQFFFLFAQQPPPAPPPPPFFFFFFPGGGNTPTTFCCFGGFGGTSSGAAF.GGAT.TSSC.G 128PhPIL15-like_Pa 123PvPIL15-like_Pa 170ZmPIL15-like_Ze 114LpPIF1-aa 123LrPIL15-likeLol 131OsPIL15-like_Or.G.G.G.G.GSSSSSSSSSGGSRRRVVSAAAQQRQQQEEAEEQKKQKKRHHEQQQHPRPPPGGQGG.GGPGG.DDGDD.SSGPP.MMIVV.LLDAA.AAALL.FFFLL.TTAKKVKKKTTPAAVGGPGGGGGLNNGVVLLLGFFKFFFGGTGGGAAGAAAGGGTTLGGGGGGLLLMMMAAFAAAPPAPPPSSDSSAFLFLLVHHSHHHDDSDDDFFAFFFSSTSSASSASSSGGG.GG.L.LLL.HFDDD.AGAAA.SASTP.HTRRR.ATDDD.HQNNN.ADGGANNNDDDGGGLLLDDDDDDDDDDDDDDDTTTTTTVVVVVVPPPPPPWWWWWWIIIIIIHHHNNHYYYYYY.PPPP.IIII.PIIIPPIEEDIIVDDDIID.EEEEDDDEEADDADDSSSATTPAAAAAAAAPEEAPPAPPPAAAAAALLLLLLTTAAAATTADGDAAASSSDDDYYFYYYSSICCGPPPSSSDDDDDDFFFFFFFFFFFFSSSSSSEEEEEELLLLLLHHHQQQAAAEEA 207PhPIL15-like_Pa 202PvPIL15-like_Pa 262ZmPIL15-like_Ze 196LpPIF1-aa 203LrPIL15-likeLol 219OsPIL15-like_OrAAAAAAAAAAAAVAAAAAAATAAAAATAAATTSAAANNLATALLGAAAGGPTNASSLA.PLLP.PPPP.TPPP.DPPP.LVVPN.AQQPLLSHHPGGLTTPSSPTNALLANTVPPSNNQPPNRRHSSHSSTNNNNNGPPG.DNNA.DAAT.NTTN.DNNN.NNNR.RRRN.S.T.P.V.PPPGAAVVNAAPAVPPPVTTTVVATTTAATSSGNSTRRRSSTEEGSSTPPPRRREEEAAEPPPPPPSSSFFSKKKKKKEEEEEEISTFFSHHHHHHRRRDDGLLALLGPPPSSLIIVAASPPPPPVGGGSSPPPPTTTAAARRTTTGPPRRWRTTAPPPSSEEEEQQPPPPPPQQQQQQP.PAAQ.QPPP.ADDQAAELLLEELAAAFFAAAAAAPAAAAAAKKKTTRQQLKKKPPPQQPRRRPPRPPSRRQGGSLLEGGGGGSNSSGGG.GGSG.GGGGAAGEEEEEEGGAGGGLLLVVVMMMMMMNNNNNNFFFFFFSSSSSSLLILLLFFFFFFSSSSSS 287PhPIL15-like_Pa 282PvPIL15-like_Pa 352ZmPIL15-like_Ze 272LpPIF1-aa 279LrPIL15-likeLol 302OsPIL15-like_OrRRRRRRPPPPPPAAAAAAAAAAAVMMMLLLAAAAAARRRRRRAAAAAASSSTTTLLLLLLQQRQQENN.SSSAA.VVAQQQQQQRRRRRRPPPPPTPPPQQQQQQGGGTTTTTTGGGDDDTTTKKNDDDVVKKKKSSAVAANNSSSS.NNNN.VVAIIVTTTTTTTTTTTASSSSSSTTTNNNRRRPPRVVVRMVEEEEEESSSSSSTTTTTTVVVVVVLLLFFVQQQQQQSSSTTTAAATTASRSSSSGGAGGG.S.G.P.R.T.PAAQQPRRARRRTAASSSAAPDDAPPAPPPVGVMMAFFFFFFTTVAAAEEDDDDQQQQQQRRRRRRTTTSSAAAAVVAWWWWWASPPQQW.SHHPQQQPPPQQQKKQPPPDDPRKKVVKEEERREVVVFFMRRRAAPFFFSSFSSPAAACCCAASTTAAATAAAPPAAAAVVAPPAGGATTP.PAAP.MGGP.ANNT.P.P.A.T.V.A.G.N.LNNNLLQLLLQQQQQHQQEQQHEERIIE 377PhPIL15-like_Pa 372PvPIL15-like_Pa 444ZmPIL15-like_Ze 362LpPIF1-aa 369LrPIL15-likeLol 392OsPIL15-like_OrMMPIIMPPSAAGRPNRRRDDNEEDRRNKKRLLMVVAGATSSGSSPNNRMMPNNTTAQTTMLLKAAPQQEVVVKKVHHHKKEKKKVVTDDTEERAAETTKAAARRATTRKKSRRKAAEAAAPPAPPPEEAEEEAAGAAAAAATTTVVTVVVAAAAAATTTTTTSSSSSSSSSSSSVVVVVVCCCCCCSSSSSSGGGVVGNNNAANGGGNNGAAAGGAGGGAAGTTTAASGGGNNDNNKDDEDDDEELEEDRRWSSEWWR.S.W.WWRRRQRRQQQQQQQPQKHHKKKRKKRRRKRRKKKCKKTAAQSSLQQAQQQAAQAAAEEAEEECCECCCSSCSSSAASAAASSASSSLLSQQQDDQDDDEEDDDDDDDDDDLLDLLPDDLEEDDDDDDDEEDEEESSESSSGGPGGGAAGGGGAAVMMMLLLRRRLLRRRRRRKSSSSSSGGCAAGSSSSSTRRRRRRGGGSSSTTAMMTKKKKKKRRRRRRSSSSSSRRRRRRTTTTTTAAAAAAEEEEEEVVVVVVHHHHHHNNNNNNLLLLLLSSSSSS 468PhPIL15-like_Pa 463PvPIL15-like_Pa 536ZmPIL15-like_Ze 453LpPIF1-aa 460LrPIL15-likeLol 483OsPIL15-like_OrEEEEEERRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRDDDDDDRRRRRRIIIIIINNNNNNEEEEEEKKKKKKMMMMMMRRRRRRAAASSALLLLLLQQQQQQEEEEEELLLLLLIIIIIIPPPPPPNNNNNNCCCCCCNNNNNNKKKKKKIIIIIIDDDDDDKKKKKKAAAAAASSSSSSMMMMMMLLLLLLDDDDDDEEEEEEAAAAAAIIIIIIEEEEEEYYYYYYLLLLLLKKKKKKTTTTTTLLLLLLQQQQQQLLLLLLQQQQQQVVVVVVQQQQQQMMMMMMMMMMMMSSSSSSMMMMMMGGGGGGSSSTTTGGGGGGLLLLLLCCCCCCIIIIIIPPPPPPPPPPPPMMMMMMLLLLLLLLLLLLPPPPPPPPPPPTTTAAAAMMMMMMQQQQQQHHHHHHLLLLLLQQQQQQIIILLIPPPSSP.P.PPAQQPIMAMMMAAAAAAHHHHHHFFFFFFPPPPPPHHHHHHLLLLLLGGGGGGMMMMMMGGGGGGLLLLLLGGGGGGYYYYYYGRGGGGMMMMMMGGGGGGVVVVVVFFLFFFDDDDDD 556PhPIL15-like_Pa 549PvPIL15-like_Pa 626ZmPIL15-like_Ze 541LpPIF1-aa 548LrPIL15-likeLol 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