植物组织培养试题及答案总结.doc

绪论复习题及参考答案一、填空：1、根据培养的材料，植物组织培养分：愈伤组织培养、器官培养、细胞培养、原生质体培养、悬浮培养等类型。2、植物组织培养的发展分为三个阶段：萌芽阶段 、 奠基阶段 和 快速发展和应用阶段 。3、1902年，Haberlandt提出了植物细胞“全能性”学说，1934年，White出版了植物组织培养手册从而使植物组织培养为一门新兴学科。 二、名词解释：1、植物组织培养(plant tissue culture)：是指通过无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。由于培养材料已脱离了母体，又称为植物离体培养（ Plant culture in vitro）。2、脱分化（dedifferentiation）：由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。3、再分化（redifferentiation）：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官，这一过程称为植物细胞的再分化。4、外植体(explant)：由活体（in vivo)植物体上切取下来的，用于组织培养的各种接种材料。包括各种器官、组织、细胞或原生质体等5、愈伤组织(callus)：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则的薄壁细胞，多在植物体切面上产生。三、问答题：1、简述植物组织培养的理论依据？植物组织培养的理论依据是细胞全能性学说，即植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。 2、植物组织培养有哪些特点？（1）培养条件可以人为控制（2）生长周期短，繁殖率高：（3）管理方便，利于工厂化生产和自动化控制：3、植物组织培养的分类？（1） 根据培养对象不同：组织培养、器官培养、胚胎培养、细胞培养、原生质体培养等；（2） 根据培养物培养过程：初代培养、继代培养；（3） 根据培养基的物理状态：固体培养、液体培养。4、植物组织培养主要应用于哪些方面？（1）快速繁殖 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株；（2）种苗脱毒 针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗；（3）培育和创制新品种 利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种；（4）大量生产次生代谢物质 通过植物细胞培养获得的生物碱、维生素、色素、抗生素以及抗肿瘤药物不下50多个大类，其中已有30多种次生物质的含量在人工培养时已达到或超过亲本植物的水平。植物细胞次生物质的研制与生产硕果累累，后来居上。（5）植物种质资源的离体保存 植物组织培养结合超低温保存技术，可以给植物种质保存带来一次大的飞跃。因为保存一个细胞就相当于保存一粒种子，但所占的空间仅为原来的几万分之一，而且在-193度的液氮中可以长时间保存，不像种子那样需要年年更新或经常更新。 （6）人工种子 人工种子便于贮藏和运输，适合机械化播种；繁殖速度快，不受季节和环境限制，利于工厂化生产； 体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以固定杂种优势。 第1章 实验室及基本操作复习题及参考答案一、填空：1、组织培养实验室必要的设备有超净工作台、高压灭菌器 、空调机、天平 、显微镜 、 蒸馏水发生器 、酸度计等 。2、培养基成分主要包括无机营养成分、有机营养成分）、植物生长调节物质、碳水化合物、其它物质。 3、培养基最常用的碳源是 蔗糖，使用浓度在1%-5% 常用 3 %。4、糖在植物组织培养中是不可缺少的，它不但作为离体组织赖以生长的碳源 ，而且还能维持培养基渗透压 。 5、在固体培养时琼脂是使用最方便、最好的凝固剂和支持物 ，一般用量为 6-10gL 之间。6、驯化的目的：在于提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用的能力，促使试健壮，提高苗的移裁成活率 。7、生长素/细胞分裂素的高低决定着外植体的发育方向，其比值 高：有利于 根的形成和愈伤组织 的形成； 低：有利于 芽 的形成。8、培养基灭菌一般在 108 kPa的压力下，锅内温度达 121 ，维持 20-30 min。9、选择外植体时应选择 选择优良的种质、选健壮的植株 、选最适的时期 和选取适宜的大小 。10、诱导胚状体比诱导芽的优点： (1)数量多 、 (2)速度快 、 (3)结构完整 。11、试管苗的生态环境： 高温且恒温 、 高湿 、 弱光 、 无菌 。12、培养基中加入活性炭的目的： 利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响 。13、筛选培养基的方法：单因子试验法、多因子试验法、光谱实验法14、植物培养技术：灭菌、接种、培养、驯化四个环节15、试管苗的驯化注意：基质、温、光、水、肥、气的综合管理二、名词解释：1、MS培养基（ MS culture medium）：它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培养基。特点是无机盐离子浓度较高，有高含量的N、K，硝酸盐量大，营养丰富。2、母液：是欲配制液的浓缩液。配成比所需浓度高10-100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。好处: 保证各物质成分的准确性 配制时的快速移取便于低温保藏。3、褐变：是指外植体在培养中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，有时使整个培养基变褐，从而抑制其他酶的活性，影响材料的培养。4、玻璃化现象（vitrification phenomenon）：在长期的离体培养繁殖时，有些试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状，这种现象称为玻璃化。5、消毒：指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。6、灭菌：是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。7、接种：在无菌条件下，用灼烧过的镊子将外植体放到培养基上的操作过程。三、问答题1、一般组织培养的操作工序：（1）、培养器皿的清洗；（2）、培养基的配制、分装和高压灭菌；（3）、无菌操作材料的表面灭菌和接种；（4）、将培养物放到培养室培养；（5）、试管苗的驯化、移栽和初期管理。2、论述植物生长调节物质在组织培养中的作用？ 并列举常见的种类(1) 生长素类：主要被用于诱导愈伤组织形成，促进细胞脱分化；促进细胞伸长；诱导根的分化，促进生根。如：IAA（吲哚乙酸） ；NAA(萘乙酸)；IBA(吲哚丁酸)； 2,4D(2,4二氯苯氧乙酸)(2）细胞分裂素类： 诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。抑制衰老，减少叶绿素分解，有保鲜效果。如：包括6BA(6苄基腺嘌呤)、Kt ( 激动素)、Zt (玉米素)等。3、常用的培养基有哪些？说明其特点 (1）MS培养基：1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培养基。特点是无机盐离子浓度较高(2) white培养基：无机盐浓度较低，适于生根培养。(3)N6培养基： KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含钼。广泛应用于禾谷类植物的花粉和花药培养。(4）B5培养基：主要特点是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。适宜双子叶植物特别是木本植物的培养4、如何配制MS培养基？(1）配制母液：一般母液配成比所需浓度高10-100倍的浓缩液，配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。(2) 配制方法：将母液按顺序摆放取适量的蒸馏水加入配制容器中按需要量依次取母液及生长调节物质加入蔗糖（30g/L）溶解定容调pH值加琼脂(6-10g/L)，完全融化后，分装至培养瓶中，封口高压灭菌5、如何对外植体进行表面消毒？(1) 将需要的材料用水洗干净。(2) 表面灭菌：用70%酒精浸30-60s左右。(3) 灭菌剂处理：0.1%升汞10分钟、或在2%次氯酸钠液中浸泡20-25分钟。(4) 用无菌水冲洗3-5次左右6、接种后离体培养物对光、温、湿等环境条件的要求？ (1) 光照：愈伤组织的诱导不需光照或弱光，器官分化需要光照，一般1216h/d，光照度10005000lx。(2) 温度：一般252(3) 湿度：培养室内的湿度要求保持7080的相对湿度。7、论述离体培养污染产生的原因及防治措施。污染：污染原因从病源分面主要有细菌和真菌和两大类。原因：（1）外植体材料消毒不彻底（2）培养基灭菌不彻底（3）操作环境不洁净（4）操作人员操作不规范、不熟练。预防措施：(1)减少或防止材料带菌(2)外植体灭菌要彻底(3) 培养基灭菌要彻底 (4) 玻璃器皿和金属器皿的灭菌要彻底(5)无菌室的消毒(6)操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进行接种。8、固体培养基与液体培养基相比有何特点？优点:操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究.缺点:培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。9、在培养基中加入活性炭有什么作用？（1）主要是利用其吸附作用，减少一些有害物质的影响（2）活性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根（3）对形态发生和器官形成有良好的效应10、植物组织培养技术主要包括哪些环节？各环节的主要工作内容？ （1）培养基的配制及灭菌（2）外植体的选择及灭菌（3）外植体的接种及培养（4）试管苗的驯化与移栽11、组织培养中常用的灭菌方法？n分为物理的和化学的两类，（1）物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤和大量无菌水冲洗等措施；（2）化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。12、怎样进行培养基的高压湿热灭菌?方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到49kPa时，打开放气阀，放出空气（注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底），待压力表指针归零后，再关闭放气阀。当压力表上升达到108kPa时，锅内温度达121（在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢），维持20-30min。13、无菌操作时应注意哪些事项？(1) 在接种4h前用甲醛熏蒸接种室；(2) 在接种前15-20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯；(3) 接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；(4) 上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后70%酒精喷雾降尘，并擦拭工作台面；(5) 接种工具蘸95%酒精，灼烧；(6) 接种时将试管斜着，使试管口在酒精灯火焰上转动，灼烧数秒钟。接完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。(7) 接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；(8) 接种完毕后要清理干净并用酒精擦工作台。14、在植物组织培养中，通过哪些途径可以得到完整的植株？(1) 外植体愈伤组织根、芽试管苗同时长芽和根先长芽，再长根先长根，再长芽(2) 外植体胚状体试管苗(3) 外植体根、芽试管苗。15、与常规苗相比，试管苗具有哪些特点？(1)生长细弱；(2)光合作用差(3)叶片气孔数目少，活性差(4)根的吸收功能弱(5)对逆境的适应和抵抗能力差16、如何提高试管苗移栽的成活率？（1）试管苗的生理状况 应选择壮苗，以提高移栽后的成活率 （2）加入植物生长调节物质 如生长素 （3）降低无机盐的浓度 （4）加入少量活性炭，尤其是用酸、碱和有机溶剂洗过的活性炭 （5）环境因子 适当的环境条件能提高移栽的成活率（6）移栽过程中让试管苗从无菌向有菌逐渐过渡17、接种程序：（1）植物材料表面的消毒（2）切割外植体（3）将外植体移入培养基 第2章 基本原理复习题及参考答案一、填空：1、绝大多数培养植物再生植株时都先经过 愈伤组织 阶段。2、愈伤组织形成大致经历 诱导期 、分裂期 和 分化期 三个时期。3、使用植物生长调节物质时要注意： 种类和浓度生长素和细胞分裂素的比值 。4、愈伤组织的形态发生方式主要有 不定芽方式 和胚状体 方式。5、组织培养细胞再分化包括四个水平：细胞水平的再分化、组织水平的再分化、器官水平的再分化（器官发生）和植株水平的分化二、名词解释：1、愈伤组织培养(callus culture):是指将母体植株上的外植体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。2、继代培养 (subculture)：愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程叫做继代培养3、体细胞胚（somatic embryo）又称胚状体（embryoid）：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经过胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成的具有双极性的胚状结构。4、体细胞胚胎发生：植物组织培养细胞产生胚状体的过程，称为体细胞胚胎发生。5、细胞全能性（cell totipotency）：每一个植物细胞具有该植物的全部遗传信息，在适当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同类型细胞，形成不同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株6、形态建成：外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。三、问答题1、愈伤组织细胞的分化一般分几个时期？各有何特点？（1）诱导期（起动期）：是细胞准备分裂的时期。细胞大小几不变，内部发生生理生化变化，迅速合成蛋白质和核酸。（2）分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成小芯。细胞分裂快，结构疏松，缺少结构，浅而透明。在原培养基上，细胞必分化，及时转移，其可无限制地进行细胞分裂，维持不分化状态。（3）分化期：细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。2、优良的愈伤组织必须具备哪4个特性？（1）高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植物（2）容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体（3）旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。（4）经过长期继代保存而不丧失胚性，便有可能对它们进行各种遗传操作。 3、愈伤组织的形态发生有哪些情况？（1）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根；（2）先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部长出根而形成小植株，多数植物属这种情况；（3）先产生根，再从根基部分化出芽而形成小植株。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；（4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株。少见。单子叶植物：与双子叶植物诱导发生过程类似，只是在形态上无鱼雷形胚等阶段，成熟体胚上有盾片、胚芽鞘和胚根等结构。4、简述细胞脱分化过程。细胞的脱分化过程可分为3个阶段： 第一阶段为启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现； 第二阶段为演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体； 5、影响植物离体形态发生的因素有哪些？（不是重点）（1）植物种类和基因型（2）培养材料的生理状态发育年龄：一般幼态比老态组织形态发生能力高；培养器官或组织类型：细胞分裂旺盛的器官较好；培养时间和细胞倍性：一般取处于旺盛生长期的愈伤来诱导器官形成。（3）培养基a营养成分： 一般认为，培养基中的铵态氮和K+有利于胚状体形成，提高无机磷的含量可促进器官发生; 茎尖培养和芽诱导培养基主要是MS及其修改的培养和B5培养基; 碳水化合物种类及浓度对胚状体发育有重要作用,缺糖或低糖无法形成胚状体。b 植物激素及生长调节剂（起主导作用，通过影响内源激素的平衡起作用c培养基的性质：愈伤组织诱导：在固体培养基上；细胞和胚状体的诱导在液体培养基上（4）培养条件：光照；温度；气体；湿度等6、分裂期愈伤组织的共同特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。7、胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别:v 胚状体具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端；而不定芽和不定根都为单向极性。v 胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系。而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。v 胚状体维管组织的分布是独立的“Y”字形。而不定芽的维管组织无此现象。 8、器官发生形成小苗的方式 v （1）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根；v （2）先长芽，后长根，多数情况；v （3）先长根，再从根的基部长芽。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；v （4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植株。第3章 器官和组织培养复习题及参考答案一、填空：1、植物器官培养主要是指植物的根、茎、叶、花器和幼小果实的无菌培养。2、茎尖培养根据培养目的和取材大小分为茎尖分生组织培养 和 普通茎尖培养 两种类型。前者主要是对 茎尖长度不超过0.1mm，最小只有几十微米的 茎尖进行培养，目的是 获得无病毒植株；后者是对 几毫米乃至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的 培养，目的是离体快繁 。3、不定芽产生的途径： 一是从外植体上直接产生 二是从由外植体诱导产生的愈伤组织上产生。4、离体叶培养是指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶等叶组织的无菌培养。5、在离体叶培养中，6-BA和KT利于芽的形成；2,4-D利于愈伤组织的形成二、名词解释：1、植物器官培养（Organ Culture）：是指对植物某一器官的全部或部分或器官原基进行离体培养的技术。分为营养器官（根、茎、叶）和繁殖器官（果实、种子、花器官）培养。2、花器官培养：是指对植物的整朵花或花的组成部分（包括花托、花瓣、花丝、花药、子房、胚珠）进行离体培养的技术。3、植物分生组织(meristem culture)培养：是指对植物的分生组织进行离体培养的技术，包括植物根尖、茎尖等顶端分生组织和形成层组织的培养。其中茎尖培养广泛应用于植物再生和脱病毒研究。三：问答题：1、离体叶组织中再生植株发生途径有哪些？在离体叶组织脱分化和再分化培养中，茎和芽分化的4个途径：（1）直接产生不定芽（2）离体叶-愈伤组织-不定芽（3）离体叶-愈伤组织-胚状体 -不定芽（4）离体叶 小鳞茎或球状体 愈伤组织 2、根培养的取材部位：答：一端切取长1.2厘米的根尖，接种于培养基中。这些根的培养物生长甚快，几天后发育出侧根。待侧根生长约1周后，即切取侧根的根尖进行扩大培养，它们又迅速生长并长出侧根，又可切下进行培养，如此反复，就可得到从单个根尖衍生而来的离体根的无性系。这种根可用来进行根系生理生化和代谢方面的实验研究。培养条件为暗光和2527。 3、离体根培养的一般方法：（1）100ml三角瓶，装4050ml培养液；（2）液体培养，（3）反复继代培养，（4）流动式4、根培养的培养基的选择：l 无机离子较低l White培养基或者其他培养基l MS、B5也可用，但其浓度要稀释2/3或1/25、影响离体根生长的因素l 1、基因型：品种差异大。l 2、培养基：生根培养基盐浓度为MS的一半或四分之一。l 3、生长物质：适当的生长素，常用NAA和IBA，浓度为0.1-10.0毫克每升。但水仙，草莓等无需激素。l 4、PH：中性偏酸。l 5、光照和温度：暗培养和2527 6、茎尖培养的含义：是切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行无菌培养。 7、茎尖培养的类型： 茎尖分生组织培养：对长度0.1mm左右，含1-2个叶原基的茎尖进行培养，即微茎尖培养；目的是获得无病毒植株 普通茎尖培养：对几毫米至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养，目的是快速繁殖和用于植物开花生理的研究。8、茎段的培养材料的选择、处理和培养基的调整选择：取生长健壮无病虫的幼嫩枝条或鳞茎盘，若是木本，取当年生嫩枝或一年生枝条，剪去叶片，剪成34cm的小段。处理：在自来水中冲洗13h，在无菌条件下用75酒精灭菌3060s，再用浓度为0.1升汞浸泡38min，或用饱和漂白粉浸泡1020min，因材料老嫩和蜡质多少而定时间。最后用无菌水冲洗数次，以备接种。 培养基的调整：最常用的基本培养基为MS培养基，加入3蔗糖，用0.7的琼脂固化。9茎尖微繁过程有哪几个阶段茎尖微繁殖过程一般包括五个阶段: 1 无菌培养的建立。 2 芽的增殖。 3 中间繁殖体的增殖。 4 诱导生根。 5 试管苗的移栽第4章 胚胎培养及离体授粉复习题及参考答案一、填空：1、胚胎培养包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养。2、离体胚的培养分为二种类型： 成熟胚 培养和 幼胚 培养。3、胚珠培养分二类： 受精胚珠 的培养和 未受精胚珠 的培养。受精胚珠培养目的一是打破种子的休眠； 二是挽救胚的发育，以获得杂交种。未受精胚珠培养的目的是获得 单倍体植株 。4、子房培养分 授粉子房 培养和 未授粉子房 的培养。前者培养的目的是挽救杂种胚，后者培养的目的是获得单倍体植株。5、离体授粉的类型有离体柱头授粉、离体子房授粉、离体胚珠授粉。6、离体胚培养方法：成熟胚和幼胚培养7、胚珠培养的培养基：Nitsch或N5,B5,MS，子房培养的培养基：N6,MS二、名词解释：1、胚胎培养（embryo culture）： 指对植物的胚、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植物的技术。包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养。2、胚培养（embryo culture）：采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌的条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。3、胚乳培养（endosperm culture）：是指将胚乳从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。4、胚珠培养（ovule culture）：是指将胚珠从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。 5、子房培养（ovary culture）：是指将子房从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。6、植物离体授粉：指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术。 三、问答题：1、胚培养的作用有哪些？1)在远缘杂交育种中的应用:克服杂种胚不能正常发育2)克服珠心胚的干扰,提高育种效率3)缩短育种周期4)测定休眠种子的萌发率5)理论研究中的应用2、简述离体授粉的程序。（课件上没有）（1）确定开花、花药开裂及授粉时间（2）去雄后将花蕾套袋隔离（3）制备无菌子房或胚珠（4）制备无菌花粉（5）胚珠或子房的试管内授粉3、胚胎培养的操作步骤。l 取子房l 常规表面消毒l 解剖镜下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚。l 固体培养4、幼胚的发育方式： 1）胚性发育：继续进行正常的胚胎发育 2）早熟发育：迅速萌发成幼苗 3）产生愈伤组织：再分化形成多个胚状体或芽原基 。5、胚胎培养的意义、克服远缘杂种的不育性、使胚胎发育不完全的植株获得后代、缩短育种年限，提高育种效率6、胚乳培养过程n 胚乳外植体制备:种子消毒-取出胚乳n 培养:White或MS诱导培养基-加入2，4-D或NAA0.52.0mg/L，BA 0.11.0mgL 25-27-暗或弱光n 发育:约6lOd胚乳开始膨大，再诱导形成愈伤组织-转到分化培养基上培养，分化培养基可加入0.53.0mgL的BA及少量的NAA。待愈伤组织长出芽后，切下不定芽，插入生根培养基中，光下培养1015d，切口处可长出白色的不定根。7、检查胚乳植株的染色体数目的方法l 取根尖、幼叶或愈伤组织l 0.2%-0.5%秋水仙素碱溶液在25浸泡4-8hrl 流水冲洗5-10minl 卡诺氏液或FAA液固定l 1mol盐酸，60 水浴8-10minl 染色、压片、镜检、计数8、胚珠培养的基本过程1）、首先从花中取出子房进行表面消毒，2）、然后在无菌的条件下进行解剖，取出胚珠，放在培养基上进行培养，将胚珠培养成植株的关键是选择胚的发育时期，实验证明发育到球形胚期的胚珠较易培养成功，另外为了培养成功，可取用带胎座甚至带部分子房的胚珠进行培养。 9、子房培养的培养过程l 1、制备外植体：在开花前后适宜时期取子房或幼花，消毒l 2、子房培养：固体或液体培养均可10、子房的发育的发育途径。p 性细胞（卵细胞、助细胞、极核、反足细胞）-胚状体或愈伤组织-单倍体植株；p 体细胞（珠被、子房壁）-胚状体或愈伤组织-二倍体植株；11、胚珠的发育途径。1）、 受精胚珠：一是形成种子；二是形成愈伤组织2）、 未受精胚珠：形成单倍体植株。第5章 花药和花粉培养复习题及参考答案一、填空：1、花药和花粉培养的共同特点是利用花粉 (小孢子)染色体数目的单倍性，培育出单倍体植株。2、花药和花粉培养时，花粉发育的最适宜时期是单核中、晚期（单核靠边期）。3、MS和H培养基适合双子叶植物花药培养； B5培养基适合豆科和十字花科花药培养； N6培养基适合禾谷类作物的花药培养。4、花药培养前的预处理:低温冷藏是最常用的方法。5、压片染色法是检测花粉发育时期的简便有效方法，常用染色剂为醋酸洋红。6、花药培养包括：选择材料-消毒-接种培养-愈合组织生成-分化出单倍体植株。7、花粉的四大发育途径包括：营养细胞发育、生殖细胞发育、营养和生殖细胞同时发育及花粉均等分裂发育8、花粉培养大致过程包括：花粉的分离-预处理-培养过程9、花药培养一般选择花粉的单核期进行接种10、花药培养是器官培养，花粉培养属细胞培养11、较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织；较低 浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗二、名词解释：1、花药培养(anther culture)：是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。2、花粉培养(pollen culture)：是将花粉从花药中分离出来进行离体培养的过程。三、问答题： 1、如何确定水稻单核靠边期的花粉？（1）在水稻中，在外部形态上可根据叶枕距为5-15cm，颖片淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2这些条件鉴定。（2）利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花粉发育的准确时期。（3）压片染色法是检测划分发育时期的简便有效方法，常用染色剂为醋酸洋红。2、比较花粉培养与花药培养相同点：（1）利用小孢子染色体数目的单倍性，培育出单倍体植株。（2）成苗途径相同，即有 胚状体成苗 和 愈伤组织再分化成苗两条途径。不同点：（1）花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。（2）花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。但技术更复杂。3、简述花粉分离方法（1）自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法) 将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。（2）挤压法 在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。(3)机械游离 A磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；B超速旋切法 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来4、花药培养的大致过程1）预处理:低温冷藏是最常用的方法,另有离心、低剂量辐射、化学试剂处理 2）表面消毒：因为未开放的花蕾中的花药为花被包裹，本身处于无菌状态，可仅用70酒精棉球将花的表面擦洗即可。也可按对其他器官消毒处理方法进行，先用70的酒精浸一下后，在饱和漂白粉溶液中浸1020min，或用0.1升汞液消毒7lOmin，然后用无菌水洗35次。将花蕾剪下放入水中，在冰箱45下保持34d。3）接种：接种时把花蕾用解剖刀、镊子小心剥开花蕾，取出花药，注意去掉花丝，然后散落接种到培养基上，一个l0ml的试管可接种20个花药。培养温度在2328左右，每天1116h的光照，光照强度20004000Lx。脱分化培养时，可用MS + 2,4-D的培养基，或N6+2,4-D的培养基，经1030d，可诱导生成愈伤组织，或少数生成胚状体。4）培养：一种植物的花药可以在一种培养基上长幼苗，而在另一种培养基上则形成愈伤组织。如水稻通常在含有生长素的培养基上诱导出愈伤组织，而在不含任何激素的N6培养基上长出胚状体。但在辣椒的花药培养中，只要培养基合适，甚至可以在同一花药上一部分花粉形成胚状体，而另一部分只形成愈伤组织。 5）植株的诱导诱导愈伤组织分化芽或根，需将其转入分化培养基和生根培养基 花粉-愈伤组织-苗 花粉-胚状体-苗第6章 细胞培养复习题及参考答案一、填空：1、一般平板培养要求细胞密度每毫升为1x103100x103 个。2、条件培养基是悬浮培养过一段时间组织或细胞的液体培养基。3、细胞悬浮培养主要应用于 植物有用物质的生产、诱发和筛选突变体、原生质体培养和细胞器分离、食品生产等。4、由植物叶片分离单细胞的方法有机械法和酶解法。5、细胞悬浮培养方法：成批培养；连续培养6、连续培养的种类：(1)半连续培养；(2)连续培养7、连续培养的方法:（1）浊度恒定法;（2）化学恒定法二、名词：1、看护培养法(nurse culture)：是指用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。2、平板培养法(plante culture)：是把单细胞悬浮液与融化的琼脂培养基均匀混合，平铺一薄层在培养基底上的培养方法。3、细胞悬浮培养（suspension culture）： 是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。4、初始植板密度（inital planting density）：单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度。5、临界密度(critical density)：单细胞培养时，初始植板密度低于某值培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度。（课件没有）6、植物细胞培养（plant cell culture）：是指对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞（或小细胞团）进行离体培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。7、条件培养基：曾悬浮培养过一段时间组织或细胞的液体培养基。8、植板率：是指已形成细胞团的单细胞与接种总细胞数的百分数三、问答题：1、如何得到单细胞无性系？ 在细胞培养中，常由分散性较好的愈伤组织或悬浮培养物来制备单细胞，也可以用机械法和酶解法从植物器官直接制备单细胞。 由分离的单细胞经看护培养法、微室培养法或平板培养法，即可得到单细胞无性系2、单细胞培养有哪些方法？各有何含义及特点单细胞培养：看护培养；微室培养；平板培养（1） 看护培养法：指用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。特点：优点：简便易行。效果好，易于成功。 缺点：不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。用途：诱导形成单细胞系。（2）微室培养：即将细胞培养在很少量的培养基中。特点：优点： 在培养过程中，可以连续进行显微观察一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程 缺点：培养时间较短用途:主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。（3）平板培养法：把单细胞悬浮液与融化的琼脂培养基均匀混合，平铺一薄层在培养基底上的培养方法。特点：优点：可以定点观察；分离单细胞系容易； 缺点：培养细胞气体交换不畅。用途:分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。3、什么是植板率？小细胞团的计数方法有哪几种？植板率是指已形成细胞团的单细胞与接种总细胞数的百分数。小细胞团计数方法：低倍显微镜直接计算； 细胞团显影法4、什么是细胞悬浮培养？简述成批培养和连续培养的的特点？ 细胞悬浮培养：是使离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。（1）成批培养的特点：细胞生长在固定体积的培养基上，直至养分耗尽用搅拌的方法使细胞团和细胞均匀分布细胞数目呈现慢快慢停止生长的变化，但必须更换新鲜培养基才能进行下一批培养（2）连续培养的特点：由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象可在培养期间使细胞保持在对数生长期中。细胞增殖速度快适于大规模工业化生产5、影响单细胞培养的因子 1、条件培养基：条件培养基可有利于单细胞的生长与分裂 2、细胞密度(临界密度)：临界密度：单细胞培养时，初始植板密度低于某值培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度。初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越低，反之则相反。一般要求每毫升在1000个细胞以上。 3、生长激素：生长激素加1种细胞分裂素和几种氨基酸(如：丙氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺)。临界密度只需25-30细胞/毫升。 4、pH：偏酸。 5、C