实验二-萌发麦苗淀粉酶活性测定.doc

实验二 萌发麦苗淀粉酶活性的测定
生物112 周泓兆 1102040226
一、研究背景及目的
酶作为生物体内最重要的催化剂，其活性尤其受到关注。在这次实验中，我们将对一些经典经典酶活力测定实验进行分析，对比其思路与设计差异，了解测定酶活力的基本方向和实验技巧。完成小麦萌发过程中淀粉酶活力的测定并分析测定结果是否合理。
二、原理
淀粉在淀粉酶的催化作用下生成麦芽糖。本实验便是通过测定淀粉酶在一定时间内分解淀粉所产生的麦芽糖总量来测定酶的活性。根据其催化产物的特点 和现有测定方法规定酶活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数（毫克麦芽糖*克-1鲜重*分-1）。
本实验涉及α-淀粉酶与β-淀粉酶，我们可通过钝化β-淀粉酶的方法单独测定α-淀粉酶的活性。
本实验所使用的3,5－二硝基水杨酸法是一种对还原糖定量测定的方法。还原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。因此，我们可以测定样品中还原糖以及总糖的量。麦芽糖是还原性糖，可用该方法对其含量进行测定。
三、 仪器与试剂
1. 仪器：TDL-40B 离心机（上海安亭科学仪器厂），722 光栅分光光度计（上海精密科学 仪器有限公司） ，DK-S24 型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），JP-100 架盘药 物天平常熟市双杰测试仪器厂），HCTP12A1 架盘药物天平（北京医用天平厂）
2. 试剂：麦芽糖标准液，pH5.6 的柠檬酸缓冲液 ，3,5-二硝基水杨酸溶液，0.4M NaOH， Folin-酚试剂甲，Folin-酚试剂乙，标准牛血清白蛋白溶液（1mg/ml ）
3. 材料：萌发的小麦种子（芽长约1cm）
四、 实验方法/操作步骤
1、 酶液的制备：称取两克萌发的小麦种子（芽长一厘米左右），置研钵中加少量石英砂，以蒸馏水作为匀浆液，研磨成匀浆，转移到50ml容量瓶中至40ml左右，室温浸提15-20分钟，浸提充分后定容至刻度，混匀后3500r/min离心20min，取上清液备用（初始酶液）。
2、 取15支试管，分别编号α-测定管1、α-测定管2、α-对照管1、α-对照管2、α+β-测定管1、α+β-测定管2、α+β-对照管1、α+β-对照管2与1、2、3、4、5、6、7。
3、 在α-测定管1、α-测定管2、α-对照管1、α-对照管2中各加入酶液1ml在70℃恒温水浴中准确加热15min，取出后立即在冰浴中冷却至室温或更低。取出后分别在四支试管中各加入1mlpH5.6柠檬酸缓冲液，置于40℃恒温水浴中准确保温15min。之后向两支对照管中各加入4ml 0.4M NaOH，再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即于40℃水浴中准确保温5min，然后向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4M NaOH，摇匀备用。
4、 取制备的酶液5ml，放入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混合均匀后，在α+β-测定管1、α+β-测定管2、α+β-对照管1、α+β-对照管2中各加入1ml稀释后的酶液与1mlpH5.6柠檬酸缓冲液置于40℃恒温水浴中准确保温15min。之后向两支对照管中各加入4ml 0.4M NaOH，再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即于40℃水浴中准确保温5min，然后向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4M NaOH，摇匀备用。
5、 取编号1、2、3、4、5、6、7的七支试管，分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml）0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0ml，然后将各管用蒸馏水准确补充至1.0ml，摇匀。
6、 在α-测定管1、α-测定管2、α-对照管1、α-对照管2、α+β-测定管1、α+β-测定管2、α+β-对照管1、α+β-对照管2与1、2、3、4、5、6、7管内各加入1ml 3,5二硝基水杨酸试剂混匀，同时在沸水浴中准确保温5min，取出冷却，用蒸馏水稀释到15ml，混匀。
7、 依次取各试管溶液在520nm波长下进行比色，记录消光值。以1、2、3、4、5、6、7管消光值作为纵坐标，麦芽糖含量作为横坐标绘制标准曲线，根据标准曲线进行结果计算。
8、 Folin-酚测萌发麦苗水溶性蛋白含量：称取0.5g萌发的小麦种子（芽长一厘米左右），置研钵中加少量石英砂，以蒸馏水作为匀浆液，研磨成匀浆，转移到50ml容量瓶中至40ml左右，室温浸提15-20分钟，浸提充分后定容至刻度，混匀后3500r/min离心20min，取上清液备用。
9、 取9支具塞试管，分别标上待测液1、待测液2、待测液3与F1-F6。分别在F1-F6中加入标准 BSA 溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，然后将各管用蒸馏水补充到 1.0ml。再各取1ml上清液（步骤8）于标有待测液1、待测液2、待测液3的试管中。在这九支试管中各加试剂甲 5ml，混匀后室温下放置 10min，再加试剂乙 0.5ml，立即混匀，30min后测定各管的OD650。
五、 数据整理
样品
标准曲线
管号
1
2
3
4
5
6
7
OD520
0.000
0.062
0.251
0.350
0.454
0.611
0.649
均值

管号
α-测定管1
α-测定管2
α-对照管1
α-对照管2
α+β-测定管1
α+β-测定管2
α+β-对照管1
α+β-对照管2
OD520
0.296
0.300
0.159
0.163
0.342
0.336
0.191
0.175
均值
0.298
0.161
0.339
0.183
样品
标准曲线
待测液
管号
F1
F2
F3
F4
F5
F6
待测液1
待测液2
待测液3
OD650
0.000
0.126
0.269
0.356
0.461
0.552
0.556
0.554
0.551
均值

0.554
六、 结果计算与讨论分析
根据数据绘制标准曲线如下：

根据标准曲线查得：
管号
α-测定管1
α-测定管2
α-对照管1
α-对照管2
α+β-测定管1
α+β-测定管2
α+β-对照管1
α+β-对照管2
麦芽糖浓度
（mg/ml）
0.445
0.241
0.507
0.274
结果计算：
α-淀粉酶活性（毫克麦芽糖*克-1鲜重*分-1）=[(A-A')*样品稀释总体积]/[样品重（g）*5]
=[(0.445-0.241)*800]/[2*5]=16.32（毫克麦芽糖*克-1鲜重*分-1）
（α-+β-）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖*克-1鲜重*分-1）=[(B-B')*样品稀释总体积]/[样品重（g）*5]=[(0.507-0.274)*8000]/[2*5]=186.4（毫克麦芽糖*克-1鲜重*分-1）
A—α-淀粉酶测定管中的麦芽糖中的浓度
A'—α-淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度
B—α-及β-淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度
B'—α-及β-淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度
根据标准曲线查得：稀释后溶液的蛋白质浓度（μg/ml）=240.9μg/ml
结果计算：
稀释倍数为2g/0.5g=4，可得酶液的蛋白质浓度（μg/ml）=240.9μg/ml*4=963.5μg/ml
（α-+β-）淀粉酶总比活=（α-+β-）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖*克-1鲜重*分-1）/[酶液的蛋白质浓度（μg/ml）*酶液总体积（ml）]=186.4（毫克麦芽糖*克-1鲜重*分-1）/[963.5μg/ml*25ml)=7.738U/mg
我们可以看出,平行数据之间的误差在允许的范围之内,说明3,5-二硝基水杨酸法测定生成麦芽糖的浓度是可行的。而α-淀粉酶活性与（α-+β-）淀粉酶总活性差距极大很可能是因为酶的协助作用，或是一部分有协助分解淀粉作用的酶在70℃时与β-淀粉酶一同失活。
七、 结论与展望
通过以上的实验方法，我们对淀粉酶的活性进行了测定。并且我们发现α-+β-）淀粉酶总活性远高于α-淀粉酶活性，小麦淀粉酶的总比活为7.738U/mg。
八、 思考题及质疑
1． 完成这次小小的蛋白含量测定实验从设计到实施完成的自我经验总结。
答：这次蛋白实验的主要难点在于蛋白溶液的稀释倍数。在设计时我考虑使用浓度梯度的方法来使得稀释后酶液浓度落在工作曲线内，其实实际操作时通过不断稀释即可。而且设计实验时我强调“可溶性蛋白”，于是考虑了溶解度的问题，并且设计了12000r/min的离心过程，后来发现这样使得蛋白含量与酶活性之间丧失了可比性（因为离心程度不同了）。因此我的经验总结是：联系本次实验设计相关实验，尽可能减少变量的数目
2． 从酶活测定的相关实验结果判断本次实验设计的酶活测定样品稀释倍数是否合理？为什么？
答：根据我们组和其它小组的经验，本次α-淀粉酶活性测定结果均靠近甚至稍微超过工作曲线，因此我们觉得应当再稀释一倍后进行测定。
3． 众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均是采取钝化β-淀粉酶的活力而测α-淀粉酶和测总酶活力的策略，为何不采取钝化α-淀粉酶活力去测β-淀粉酶活力呢？这种设计思路说明什麽？
答：钝化β-淀粉酶可以采取高温的方法，而钝化α-淀粉酶则需要采用酸性环境。若在实验中采取钝化α-淀粉酶的方式，则在将pH调回的的过程中α-淀粉酶会有很大一部分复性。而高温处理后立即冰浴，则可以大大减少β-淀粉酶的复性。其次，在实验中，酶对pH更加敏感，若酸过量则会导致β-淀粉酶也被钝化，相对而言，温度更加易于控制。这种设计思路说明我们在实验设计时要考虑其在操作时的合理性，使实验操作尽可能简便。
4． α-淀粉酶活性测定时70℃水浴为何要严格保温15分钟？保温后为什么要立即于冰浴中骤冷？而经如此处理，为什么在随后的40℃温浴和酶促反应中就能保证β-淀粉酶不会再参与催化反应。
答，保温时间过短β-淀粉酶失活不完全，时间过长导致α-淀粉酶也有一部分被钝化，所以要严格保温15分钟。立即于冰浴中骤冷是为了减小β-淀粉酶在降温过程中的复性。经过巨大的温度变化，不耐高温的β-淀粉酶会彻底失活，所以在随后的40℃温浴和酶促反应中就能保证β-淀粉酶不会再参与催化反应。
5． 酶的最适反应温度（一般都是生理温度）和最适保存温度（一般0℃以下）为什么不一样？而这两个状态都是需要维护酶的空间结构。
答：最适反应温度时，酶的结构最适合诱导底物与之结合形成酶-底物复合物，因此体现出酶的活性最强。而在最适保存温度时，酶的稳定性最好，催化能力很低，从而很好地保存了酶的活性
6.为什么3，5-二硝基水杨酸与还原糖的反应要先沸水浴然后再稀释测定？
答：原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物。因此在沸水浴时，溶液浓度越大反应越完全。而在比色法测定时，浓度过大无法测定，因此需要稀释以后进行测定，使数据尽可能符合朗伯-比尔定律。
7. 在设计酶活测定的实验时，要求酶促反应初速度对底物浓度的小量变化不敏感，具体要求为：在底物浓度有10%的变化幅度范围内，而所测初速度的变化幅度小于1%。则[S]/Km应该大于多少才能保证这一点？（设定为米氏酶）
答：根据米氏方程：v=(Vmax[S])/(Km+[S])，根据题意：0.9[S]≤[S']≤11[S]，则0.99v≤v'≤1.01v,计算可得：[S]/Km＞8.18。
8. 转氨酶在细胞内的作用及生理意义？细胞内有众多的转氨酶，但相关研究及医学临床应用中却几乎都是只检测谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活力，而极少测定其它转氨酶活力，你推测可能的原因会是什么？为什么？
答：转氨酶在细胞内催化酮酸与氨基酸或氨基酸之间的转氨基反应，可以生成非必须氨基酸或产生酮酸分解产能或作为糖和脂肪酸的原料。转氨酶在肝脏中作用巨大，其中以谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）最为重要。前者是催化谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用，后者是催化谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨作用，其反应产物丙酮酸和草酰乙酸都是代谢的重要中间产物，而且GPT和GOT的活性在人体转氨酶中是最高的，所以但相关研究及医学临床应用中却几乎都是只检测谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活力。
9、转氨酶催化的是双底物可逆反应，根据酶活力测定的总体思路，要保证测定反应的初速度，根据实验指导所提供的资料，你认为是否保证了这一点？是如何保证的？
答：保证了这一点。通过加入过量的底物促进了正反应进行，而且适当增长了反应时间，使正反应反应充分。
10、指导所提供的两个转氨酶活力测定实验方案，设计的酶促反应时间是多少？终止酶促反应用的什么试剂？与淀粉酶活力测定规定的酶促反应时间相比是否有差异？差异可能的原因你分析认为会是因为什么？
答：酶促反应的时间是10min，用4ml 0.4M NaOH终止酶促反应，时间较淀粉酶活力测定规定的酶促反应的时间5min要多5min，我认为差异的原因为粉酶催化的反应为不可逆反应而转氨酶化的反应为可逆反应，时间适当延长可以使正反应充分。
九、实验小结
1、 酶具有极高的催化效率，因此需要注意反应的同时性。微小的时间差会在平行数据间带来巨大误差。可以考虑两人配合来保证其同时性。
2、 测定过程中需要沸水浴，大家应当按顺序摆放自己的试管，防止不小心拿错。
3、 我认为，为防止数据超出工作曲线，可以一开始就取一定量的酶液进行稀释，同时与未经稀释的酶液进行测定，可以防止重做。
十、参考文献
[1]康明丽.淀粉酶及其作用方式[J].食品工程,2008(3):11-14.

6 / 6