核壳型松香基高分子键合硅胶...相色谱固定相高效分离紫杉醇_李浩.pdf

第 43 卷第 1 期2023 年 2 月林产化学与工业Chemistry and Industry of Forest ProductsVol 43 No 1Feb 2023收稿日期:2021-11-17基金项目:国家自然科学基金资助项目(32060325)作者简介:李 浩(1985)，男，河南周口人，博士生，主要从事天然产物的开发及功能材料研究工作*通讯作者:雷福厚，教授，博士，博士生导师，研究领域为林产化工及功能高分子;E-mail:leifuhougxun126 com。doi:10 3969/j issn 0253-2417 2023 01 004核壳型松香基高分子键合硅胶液相色谱固定相高效分离紫杉醇LI Hao李 浩，谢文博，曾 磊，易柳钰，李 文，雷福厚*(广西民族大学 化学化工学院;林产化学与工程国家民委重点实验室;广西林产化学与工程重点实验室;广西林产化学与工程协同创新中心，广西 南宁 530006)摘要:将富马海松酸三(-丙烯酰氧基乙基)酯(FATE)通过自由基聚合反应键合到烷基化硅胶(TPM-SiO2)表面，制备了核壳型松香基高分子键合硅胶(P SiO2)固定相，对 P SiO2固定相进行了一系列表征和评价，探讨了 P SiO2柱对紫杉醇(PTX)及其类似物的分离性能和分离机理，并将其用于红豆杉树皮粗提物中 PTX 的分离纯化。结果表明:FATE 成功键合在硅胶表面，核壳型结构材料成功制备，P SiO2的平均粒径约为 5 m;P SiO2柱是类似于 C18 柱的典型反相色谱柱，表现出优异的色谱性能、良好的重现性和典型的反相色谱行为;采用 P SiO2柱分离紫杉醇类似物，连续洗脱样品的分离度均超过 6 6。计量置换保留理论(SDT-)和 van t Hoff 热力学分析结果表明:疏水相互作用决定了分析物的保留，在 P SiO2柱上分离紫杉醇类似物是一个焓驱动的放热过程，SDT-可用于解释其保留机理。采用 P SiO2柱从红豆杉树皮粗提物中分离纯化紫杉醇，紫杉醇的纯度由 6%提高到 81%。关键词:松香基固定相;高效液相色谱;保留机理;紫杉醇中图分类号:TQ35;O658文献标志码:A文章编号:0253-2417(2023)01-0034-09引文格式:李浩，谢文博，曾磊，等 核壳型松香基高分子键合硅胶液相色谱固定相高效分离紫杉醇J 林产化学与工业，2023，43(1):3442Highly Effective Separation of Paclitaxel by Using Core-shell osin-basedPolymer Bonded Silica as Liquid Chromatography Stationary PhaseLI Hao，XIE Wenbo，ZENG Lei，YI Liuyu，LI Wen，LEI Fuhou(School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi Minzu University;Key Laboratory of Chemistry and Engineering ofForest Products，State Ethnic Affairs Commission;Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products;Guangxi Collaborative Innovation Center for Chemistry and Engineering of Forest Products，Nanning 530006，China)Abstract:A rosin-based core-shell polymer bonded silica(P SiO2)stationary phase was prepared by the radical polymerizationof fumaropimaric acid tri(-acryloxyl ethyl)ester(FATE)onto alkylated silica(TPM-SiO2)The P SiO2stationary phase wascharacterized and evaluated，the separation performance and mechanism of P SiO2column for paclitaxel(PTX)and its analogswere discussed，and it was used for the separation and purification of PTX from crude yew-bark extract The results showed thatFATE was successfully bonded to the surface of silica，the core-shell structure material was successfully prepared，and theaverage particle size of P SiO2was about 5 m The P SiO2column was a typical reversed-phase column similar to C18column，showing excellent chromatographic performance，satisfactory performance reproducibility，and typical reversed-phasechromatographic behavior The P SiO2column was used to separate paclitaxel analogs，and the separation degree of continuouselution samples was more than 6 6 Stoichiometric displacement theory for retention(SDT-)and van t Hoff thermodynamicanalysis showed that hydrophobic interactions determined the analyte retention，and the separation of paclitaxel analogs on第 1 期李 浩，等:核壳型松香基高分子键合硅胶液相色谱固定相高效分离紫杉醇35P SiO2column was an exothermic process driven by enthalpy Furthermore，SDT-could be used to explain its retentionmechanism The P SiO2column was employed to separate and purify paclitaxel from crude yew-bark extract，increasingpaclitaxel purity from 6%to 81%Key word:rosin-based stationary phase;HPLC;retention mechanism;paclitaxel紫杉醇是从红豆杉中提取的一种二萜类抗癌药物，因其对食道癌、乳腺癌、肺癌及卵巢癌等有防治效果而受到广泛关注1 3。通过植物细胞培养、化学半合成、化学全合成等方法也可以获取紫杉醇，但是这些方法步骤繁琐且纯化成本较高4。因此，从天然资源红豆杉中提取紫杉醇，仍是分离纯化紫杉醇的主要途径。红豆杉中紫杉醇的含量很低，而且有很多类似物与紫杉醇共存，如三尖杉宁碱、10-去乙酰紫杉醇、巴卡亭、10-脱乙酰基巴卡亭等，使得紫杉醇的分离纯化面临较大挑战5。有文献报道采用分子印迹法有较好的选择性，但制备过程复杂且成本较高2，6。因此，开发一种高效分离纯化紫杉醇的方法是该领域热点问题之一。高效液相色谱(HPLC)是分离测定紫杉醇及相关化合物最常用的分析方法。固定相是高效液相色谱体系的关键组成部分，在液相分析中起着关键的作用7。因此，开发新型色谱固定相用于紫杉醇的分离和纯化具有重要意义。松香是含有双键、羧基和类菲环骨架的二萜类树脂酸，具有天然、环保、可降解等优点，通过对松香进行改性可得到松香衍生物8 9。本课题组前期工作中，制备了一系列松香基聚合物固定相，用于分离喜树碱10、盐酸小檗碱11 和咖啡因12。然而，松香基聚合物固定相的机械强度和柱效较低，分离效果较差。硅胶粒径均一、机械强度高且孔结构丰富，在制备化学键合固定相时常被用作基体。因此，基于前期研究结果，本研究将富马海松酸三(-丙烯酰氧基乙基)酯通过自由基聚合反应键合到烷基化硅胶表面，制备了核壳型松香基高分子键合硅胶(P SiO2)固定相，表征了 P SiO2的结构，评价了 P SiO2柱的色谱性能、重现性和反相色谱行为，并探讨了流动相组成、流速和温度等参数对紫杉醇类似物分离的影响;此外，进一步研究了化学计量置换保留理论(SDT-)、色谱热力学，以阐明分离机理;最后，利用 P SiO2柱从红豆杉树皮粗提物中分离纯化紫杉醇，以期为红豆杉中紫杉醇的分离纯化提供新思路。1实 验1 1材料与仪器富马海松酸三(-丙烯酰氧基乙基)酯(FATE，纯度 95%)，广西鼎弘树脂有限公司;球形硅胶(粒径5 m，比表面积 360 m2/g)，苏州纳微科技股份有限公司;3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(TPM，纯度 97%)、偶氮二异丁腈(AIBN，纯度 99%)、10-脱乙酰基巴卡亭(10-DAB，98%)、巴卡亭(BCT，99%)、10-去乙酰紫杉醇(10-DAT，98%)、三尖杉宁碱(CEP，98%)、紫杉醇(PTX，99%)，均购于上海阿拉丁公司;甲醇、乙腈(色谱纯)，美国 Fisher Scientific 公司;其他试剂均为市售分析纯。Zeiss Supra 55 Sapphire 扫描电镜，德国蔡司公司;Tecnai-G2-F30 FEI 透射电镜，美国 FEI 公司;Nicolet iS10 傅里叶变换红外光谱分析仪，美国 Nicolet 公司;TG 209 F1 Libra 热重分析仪，德国 Netzsch公司;Vario EL cube 有机元素分析仪，德国 Elemantar 公司;ASAP2020 比表面积及微孔物理吸附仪，美国Micromeritics 公司;CP-24 装柱机，美国 Scientific Systems 公司;LC-15C 高效液相色谱仪、LC-20A 制备型液相色谱仪，日本岛津公司。1 2固定相的制备称取 5 0 g 硅胶加入到盛有 100 mL 盐酸溶液(2 0 mol/L)的 250 mL 三口圆底烧瓶中，氮气保护，75 条件下反应 8 h。产物用去离子水洗涤，除去盐酸至水溶液呈中性，在 80 下真空干燥 24 h，得到活化硅胶。将 5 g 活化硅胶置于 250 mL 单口烧瓶中，加入 50 mL 无水甲苯、5 mL 硅烷偶联剂 TPM，在氮气保护下回流反应 8 h。反应结束后，减压抽滤收集 TPM 修饰的硅胶，依次用丙酮、甲醇和正己烷洗涤，于 80 真空干燥过夜，得到烷基化硅胶(TPM-SiO2)。将 FATE(0 92 g)、AIBN(0 05 g)溶于 3 mL氯仿中，超声波处理使其均匀分散，配成油相。称取硅胶质量 5%的油相溶于 30 mL 氯仿配成混合溶液，将上述混合溶液涂覆到 TPM-SiO2表面，并置于盛有十二烷基硫酸钠水溶液(3 g SDS 溶于 100 mL36林产化学与工业第 43 卷水)的 250 mL 单口烧瓶中，在 85 和 95 条件下各反应 2 h。反应结束后，减压抽滤，收集固体，用无水乙醇洗涤，于 80 真空干燥过夜，得到核壳型松香基高分子键合硅胶(P SiO2)固定相。1 3色谱柱的制备与评价1 3 1色谱柱的制备将 P SiO2固定相在 40 MPa 的压力下，以甲醇作为浆料和推进溶剂，采用装柱机将固定相填充到不锈钢柱(250 mm 46 mm)中。将色谱柱连接到高效液相色谱仪，在 0 3 mL/min 流速下冲洗色谱柱 24 h 以除去柱中的杂质，即得到核壳型 P SiO2色谱柱(250 mm 4 6 mm，5 m)。1 3 2色谱柱的评价以甲醇和乙腈为流动相，在 0 3 1 5 mL/min 的流速范围内，分别观察并记录液相色谱泵的压力。在流动相为甲醇/水体积比 6040，流速为 1 0 mL/min，柱温为 30，检测波长为254 nm 的色谱条件下，以尿嘧啶、苯、萘、蒽为探针，重复进样 20 次，考察 P SiO2色谱柱的稳定性和重现性。以烷基苯(苯、甲苯、乙苯、丙苯、丁苯、戊苯)为探针，流速为 1 0 mL/min，流动相为甲醇水溶液(体积分数 40%60%)，以 5%的间隔改变甲醇体积分数，对 P SiO2柱的反相色谱性能进行评价。1 4色谱柱的分离性能配制质量浓度为 0 1 g/L 的 10-脱乙酰基巴卡亭、巴卡亭、10-去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱和紫杉醇的混合样品溶液，用 P SiO2柱分离紫杉醇类似物。考察 HPLC 分析条件对分离性能的影响:流动相为乙腈-水(体积比 2575 4555)，流速 0 6 1 4 mL/min，柱温 25 45，进样量为 10 L，检测波长 227 nm。进样前，混合样品溶液用 0 22 m 有机滤膜过滤。1 5分离机理15 1计量置换保留理论计量置换保留理论(SDT-)是一种广泛用于描述反相色谱的色谱保留模式。根据 SDT-，对于吸附在固定相表面的每一摩尔溶质，一定量的溶剂从溶质和固定相之间的接触区域进行置换13。SDT-可以用以下 2 个线性方程14 来描述:lgk=lgI ZlgC(1)lgI=Zj+lg(2)式中:k溶质的保留因子;lgI溶质与固定相的亲和度;C置换溶剂的浓度(流动相中有机改性剂的浓度)，mol/L;Z溶质与固定相结合时从固定相与溶质之间区域释放出的溶剂的总摩尔数，mol;j溶剂与固定相的亲和度;柱相比。1 5 2色谱热力学通过热力学研究，探讨了紫杉醇及其类似物在 P SiO2柱上的保留机理。柱温会影响紫杉醇类似物与固定相之间的相互作用。因此，在25 45 范围内，以5 为间隔，研究了柱温对紫杉醇类似物保留的影响。保留因子与柱温的关系可用 van t Hoff 方程表示15:lnk=H/T+S/+ln(3)ln=H/T+S/(4)式中:气体常数，8 314 J/(molK);T温度，K;选择性因子;H摩尔焓的变化，kJ/mol;S摩尔熵的变化，J/(mol K);HH 的变化，kJ/mol;SS 的变化，J/(mol K)。1 6红豆杉树皮提取物的制备称取 20 g 干燥的红豆杉树皮，用粉碎机进行粉粹后，加入到盛有 600 mL 乙醇的烧杯中，在 40 条件下超声波提取 2 h，经过滤后得到提取液。将提取液旋蒸除去乙醇，得到固体，再用石油醚洗涤 3 次，以去除石油醚可溶的成分，然后减压抽滤得固体提取物。将回收的固体提取物溶于50 mL 氯仿中，再加入50 mL 水进行液液萃取，萃取3 次。萃取后分离得到水相和氯仿相，将得到的氯仿相经浓缩后溶解于乙腈中，备用。2结果与讨论2 1固定相的分析与表征通过扫描电镜观察 P SiO2的形貌，结果见图 1(a)。由图可知，固定相具有表面多孔的规则球形结构，粒径约 5 m。透射电镜如图 1(b)所示，可以看出硅胶表面存在明显的附着物，表明成功制备了第 1 期李 浩，等:核壳型松香基高分子键合硅胶液相色谱固定相高效分离紫杉醇37P SiO2核壳型结构的材料。由图 1(c)粒径分布可知，SiO2和 P SiO2的平均粒径均为 5 m，均一的粒径分布为后续色谱柱的成功制备奠定了基础。采用热重分析仪对 P SiO2进行表征，结果见图1(d)。由图可知，当温度低于 120 时质量下降归因于吸附在二氧化硅上的水的损失16;200 800 区间，TPM-SiO2和 P SiO2的质量分别减少了 8 7%和 12 5%，P SiO2的失重率较高是由于键合的FATE 分解所致。元素分析结果表明:SiO2、TPM-SiO2和 P SiO2的含 C 量分别为0、5 73%和8 08%，含 H 量分别为0 98%、1 17%和2 31%;可以看出 TPM-SiO2的含 C 量明显高于 SiO2，表明 TPM 成功键合在 SiO2表面;此外，P SiO2的含 C 量高于 TPM-SiO2，表明 FATE 成功与 TPM-SiO2结合。a SEM;b TEM;c 粒径分布 particle size distribution;d TG;e FT-I;f 氮气吸附-脱附等温线 N2adsorption-desorption isotherms图 1PSiO2的分析与表征Fig 1The analysis and characterization of PSiO2SiO2、TPM-SiO2和 P SiO2的红外光谱如图 1(e)所示。在 SiO2的谱图中，3 450 cm1处的宽峰归因于硅醇基团和水分子的OH 键的伸缩振动17，在 968 cm1处的峰属于 SiOH 弯曲振动。在 TPM-SiO2谱图中，3 450 cm1处的峰强度减弱，968 cm1处的峰消失，另外，在 2 896 和 2 946 cm1处出现CH2和CH3的 CH 伸缩振动，且在 1 705 cm1处出现了=CO 的吸收峰，说明硅烷偶联剂 TPM 已成功键合在硅胶表面。在 P SiO2的谱图中，1 705 cm1处=CO 的伸缩振动峰强度增强，再结合热重和元素分析结果，可以确定 P SiO2已制备成功。P SiO2的 N2吸附-脱附等温线见图 1(f)，由图可知，P SiO2的 N2吸附-脱附等温线表现为具有 H1 滞回环的 IV 型行为18，表明 P SiO2是一种介孔材料。SiO2的比表面积、孔容和平均孔径分别为 360 65 m2/g、0 85 cm3/g 和7 26 nm，P SiO2的比表面积、孔容和平均孔径分别为321 85 m2/g、0 71 cm3/g 和6 52 nm。与硅胶相比，P SiO2的孔结构数据有所下降，说明 FATE 成功键合在硅胶表面。2 2色谱评价22 1柱色谱性能分别以甲醇和乙腈为流动相，在 0 3 1 5 mL/min 的流速范围内，考察 P SiO2柱的色谱性能，结果见图 2(a)。由图可知，随着流速的增加，柱压逐渐升高，流动相流速和柱压呈现良好的线性关系，且线性相关系数(2)超过 0 999。将流速和柱压关系的实验重复了 3 次，得到的柱压数据较稳定。结果表明，P SiO2柱具有良好的色谱性能。2 2 2稳定性及重现性稳定性和重现性是色谱柱的基本特征。以尿嘧啶、苯、萘、蒽为探针，考察了38林产化学与工业第 43 卷P SiO2色谱柱的稳定性和重现性，结果见图 2(b)。由图可知，在 P SiO2柱上测试混合物 20 次进样的色谱图基本重合，尿嘧啶、苯、萘、蒽的保留时间的 SD 分别为 0 06%、0 01%、0 08%和 0 16%。结果表明，P SiO2色谱柱的物理填充性能良好，柱床稳定。此外，使用3 个月后，P SiO2柱的性能没有明显下降。2 2 3反相色谱模式采用6 种直链烷基苯混合物对所制备的 P SiO2柱的反相色谱性能进行了评价。如图2(c)所示，烷基苯的极性随烷基链长度的增加而减小，烷基苯的洗脱顺序与极性相反;弱极性化合物比强极性化合物更容易被 P SiO2固定相保留。结果表明:P SiO2色谱柱对化合物的分离主要受反相机理控制。另外，考察了流动相中甲醇体积分数对保留因子的影响。如图2(d)所示，随着流动相中甲醇体积分数的增加，烷基苯的保留因子降低。表明 PSiO2柱是类似于 C18 柱的典型的反相色谱柱 19。a 流速 vs 柱压 flow rate vs back pressure;b 进样 20 次 20 injections;c 反相色谱模式 PLC mode;d 保留因子 vs 甲醇体积分数 retention factors vs MeOH volume fraction图 2PSiO2色谱柱的性能评价Fig 2The performance evaluation of PSiO2column2 3PSiO2柱的分离性能2 3 1流动相组成的影响考察了流动相中乙腈体积分数对 HPLC 分离性能的影响。由图 3(a)可知，随着乙腈体积分数的增加，紫杉醇类似物在固定相中的保留因子(k)和分离度(s)逐渐降低。这与P SiO2柱的反相色谱特性有关。此外，随着流动相乙腈体积分数的增加，紫杉醇类似物的溶解度增加，从而加速了流动相的洗脱，缩短了分析物的保留时间。当乙腈/水体积比为 2575 时，紫杉醇类似物保留时间长，色谱峰形宽。当乙腈/水体积比为 3070 时，色谱峰清晰对称，总洗脱时间小于 40 min，分离度高。因此，选择乙腈体积分数为 30%作为分离紫杉醇类似物的最佳流动相组成。23 2流速的影响流速影响高效液相色谱系统的色谱性能。因此，考察了流速对紫杉醇类似物 k 和s的影响。从图 3(b)可知，随着流速的增加，k 没有明显变化。然而，随着流速的降低，保留时间增加，导致分析时间延长。s随流速增加先增大后逐渐减小，当流速为 1 0 mL/min 时，紫杉醇类似物的分离度最大且洗脱在 40 min 左右完成。因此，选择 1 0 mL/min 作为分离紫杉醇类似物的最佳流速。23 3柱温的影响柱温影响分析物在高效液相色谱中的保留和选择性。因此，考察了温度对紫杉醇第 1 期李 浩，等:核壳型松香基高分子键合硅胶液相色谱固定相高效分离紫杉醇39类似物 k 和 s的影响，结果见图 3(c)。由图可知，随着柱温的升高，紫杉醇类似物的 k 值逐渐降低。这是由于温度的升高增加了分析物在流动相中的溶解度，减弱了分析物与固定相的结合亲和力，增强了溶剂与固定相之间的相互作用，加速了传质扩散20。因此，分析物可从 P SiO2柱中快速洗脱。紫杉醇类似物的 s值随温度升高而降低，在 25 下获得了满意的分离效果。a 乙腈体积分数 acetonitrile volume fraction;b 流速 flow rate;c 柱温 column temperature图 3不同条件对 PSiO2柱保留因子(k)和分离度(s)的影响Fig 3Effects of different conditions on the retention factor(k)and degree of separation(s)of PSiO2column2 3 4P SiO2柱分离紫杉醇类似物在流动相为乙腈/水体积比 30 70、流速 1 0 mL/min、柱温25 和检测波长 227 nm 色谱条件下，采用 P SiO2柱和 C18 柱对紫杉醇类似物进行色谱分离，并评价其分离性能，结果见图4。图4(a)显示了5 个分离清晰的对称峰;10-DAB、BCT、10-DAT、CEP 和 PTX从 P SiO2柱中依次洗脱，洗脱物的 s均超过 6 6，PTX 的洗脱时间为 39 6 min。这是由于 P SiO2柱与紫杉醇类似物具有较强的疏水作用，10-DAB、BCT、10-DAT、CEP 和 PTX 的极性逐渐减小，并依次洗脱。因此，紫杉醇类似物在 P SiO2柱中的洗脱顺序与极性一致。在最佳色谱条件下，紫杉醇类似物在 P SiO2柱上获得满意的分离效果。图 4(b)为相同色谱条件下 C18 柱分离紫杉醇类似物的对比图。由图可知，紫杉醇类似物在 C18 柱上得到了较好的分离，但分离时间较长(153 1 min)，导致分离效率降低。另外，分离过程消耗的流动相较多，不利于节能环保。图 4紫杉醇类似物在 PSiO2柱(a)和 C18 柱(b)上的分离色谱Fig 4Chromatogram of PTX analogs separated on a PSiO2column(a)and C18 column(b)2 4分离机理分析2 4 1计量置换保留理论考察了流动相中乙腈体积分数对紫杉醇及其类似物保留因子的影响。图5(a)显示了保留因子对数(lgk)与乙腈浓度对数(lgC)的关系图。由图可知，随着乙腈体积分数的增加，紫杉醇类似物的保留因子逐渐降低。在反相色谱模式下，lgk 与 lgC 呈良好的线性关系，线性相关系数均超过 0 977。以上结果表明，紫杉醇类似物在 P SiO2固定相上的滞留主要是由于反相色谱模式40林产化学与工业第 43 卷下的疏水相互作用，这与 SDT-相一致。由 5 个线性方程的截距和斜率得到对应的 lgI 和 Z 值，结果见表 1。由表 1 可知，与紫杉醇类似物相关的 lgI 值按 10-DAB、BCT、10-DAT、CEP 和 PTX 的顺序逐渐增大，表明分析物与 P SiO2柱的亲和度逐渐增强，保留时间逐渐延长。Z 值逐渐增大，表明固定相与溶表 1lgk 与 lgC 的线性拟合参数Table 1Linear fitting parameters of the lgk vs lgC plots分析物 analytelgIZ210-DAB185 015240 0170977BCT225 013250 014098710-DAT394 006407 0070998CEP418 007419 0070998PTX461 005457 0060999质之间的区域释放出更多摩尔的溶剂。因此，表现为 10-DAB、BCT、10-DAT、CEP 和PTX 从 P SiO2柱中依次洗脱。以上结果与图 4(a)分离色谱相一致。图 5(b)中 lgI与 Z 之间呈现良好的线性关系，线性相关系数为 0 993。说明紫杉醇类似物在 PSiO2柱上的保留主要为反相机理，其保留过程符合 SDT-的第二线性方程。由拟合方程得到的 j 值为 1 19，小于理论值 1 28(乙腈作为流动相)，说明色谱分离过程还存在其他作用力。以上分析表明:SDT-可用于评价在 P SiO2色谱柱上分离紫杉醇类似物时的反相色谱模式相互作用。a lgk-lgC;b lgI-Z图 5PLC 模式下紫杉醇及其类似物的线性关系曲线Fig 5Linear relationship curves of PTX and its analogs in PLC mode2 4 2色谱热力学以乙腈/水为流动相(体积比为 3070)，在 P SiO2柱上构建了分离紫杉醇及其类似物的范霍夫图如图 6 所示，热力学参数见表 2。图 6lnk 与 1/T(a)和 ln 与 1/T(b)的范霍夫曲线Fig 6Van t Hoff plots of lnk vs 1/T(a)and ln vs 1/T(b)由图可知，lnk 与 1/T 在 25 45 温度范围内呈较强的线性关系，相关系数均超过 0 947。结果表明:紫杉醇类似物在 P SiO2柱上的保留机理在 25 45 温度范围内没有改变。较高的|H|表明分析物与色谱柱之间的相互作用焓贡献较大。由表 2 可知，10-DAB、BCT、10-DAT、CEP、PTX 的|H|逐渐增大，其保留顺序与 H 的变化一致。此外，H 为负值表明紫杉醇类似物在 P SiO2柱上的保留是放热过程。在25 45 范围内，k 和 随柱温升高而降低。上述结果与 P SiO2柱性能随温度变化的结第 1 期李 浩，等:核壳型松香基高分子键合硅胶液相色谱固定相高效分离紫杉醇41果相一致。由范霍夫曲线中观察到的线性关系表明，在研究温度范围内紫杉醇类似物的保留机制没有发生变化。|H|T|S|的结果表明，在 P SiO2柱上分离紫杉醇类似物是一个焓驱动过程21。表 2PSiO2柱分离 PTX 类似物的热力学参数Table 2Thermodynamic parameters of PTX analogs separated on PSiO2column分析物analyte回归方程regression equation2H/(kJ mol1)S/(J mol1 K1)H/(kJ mol1)S/(J mol1 K1)10-DABlnk=0682 4+153 66/T09471278567309932833BCTlnk=0448 3+306 22/T0991254637271606419410-DATlnk=0046 73+531 58/T09914420038909162462CEPlnk=0 205+556 58/T09954627170407020317PTXlnk=0 239 9+642 01/T0989533819952 5PSiO2柱对红豆杉树皮粗提物的分离纯化红豆杉树皮粗提物经 0 45 和 0 22 m 膜过滤器连续过滤后注入 HPLC。根据中国药典方法，在乙腈/水体积比 4060 为流动相、流速 1 5 mL/min、柱温 30、检测波长 227 nm 条件下，采用 C18 柱测定紫杉醇含量，如图7(a)所示，根据面积归一化法计算得到粗提物中紫杉醇纯度为6%。在2 3 节所述的最佳色谱条件下，采用制备型液相分离系统，将紫杉醇粗提物在 P SiO2柱上分离，确定紫杉醇色谱峰出现的时间范围。如图 7(b)所示，紫杉醇在 P SiO2柱上的保留时间为 39 40 min。采用 C18 柱测定收集的洗脱液中紫杉醇纯度，如图 7(c)所示，紫杉醇纯度达到 81%。上述结果表明:P SiO2柱可用于红豆杉树皮粗提物中紫杉醇的分离纯化。a 粗提物 crude extract，C18;b 粗提物 crude extract，P SiO2;c 纯化样 purified sample，C18图 7红豆杉树皮粗提物及其纯化样品的 HPLC 分析Fig 7HPLC analysis of crude yew-bark extract and its purified samples3结 论3 1将富马海松酸三(-丙烯酰氧基乙基)酯(FATE)通过自由基聚合反应键合到烷基化硅胶表面，制备了核壳型松香基高分子键合硅胶(P SiO2)固定相，分析表征及色谱评价结果表明:FATE 成功键合在硅胶表面，核壳型结构材料成功制备，P SiO2的平均粒径约为 5 m;P SiO2具有优良的色谱性能、良好的重现性和典型的反相色谱行为。32P SiO2柱对紫杉醇及其类似物的分离性能、分离机理研究结果表明:紫杉醇类似物在 P SiO2柱上的保留机理可以用 SDT-解释，热力学研究发现紫杉醇类似物在 P SiO2柱的分离是一个焓驱动放热过程。3 3采用 P SiO2柱对红豆杉树皮粗提物中紫杉醇进行分离纯化，可以使粗提物纯度由 6%提高到81%，说明 P SiO2柱可用于红豆杉树皮粗提物中紫杉醇的分离纯化。本研究为松香基固定相在天然产物分离中的应用提供了参考，今后本课题组将在优化固定相材料上进一步深入研究，以最大程度地提高紫杉醇的纯度。42林产化学与工业第 43 卷参考文献:1FAN J P，YUAN T T，XU X K，et al Preparation and characterization of mock strawberry-like aminopropyl-modified mesoporous silica forcolumn chromatographic purification of paclitaxel in Taxus Media J Chemical Engineering Journal，2019，359:15091517 2TAN L，ZHOU L D，JIANG Z F，et al Selective separation and inexpensive purification of paclitaxel based on molecularly imprinted polymersmodified with ternary deep eutectic solventsJ/OL Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2021，192:113661 2021-10-15https:doi org/101016/j jpba 2020 113661 3姜艳，沈晨佳，周丹英，等 红豆杉属植物中紫杉烷类物质含量比较J 浙江农业科学，2018，59(12):22802282JIANG Y，SHEN C J，ZHOU D Y，et al Comparative study of taxanes content in the branches and leaves of different species of TaxusJJournal of Zhejiang Agricultural Sciences，2018，59(12):22802282 4GHASEMI S，NEMATOLLAHZADEH A Molecularly imprinted ultrafiltration polysulfone 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