基于嘌呤配体P2X门控离子通道型受体7的资生肾气丸镇痛机制研究.pdf

基金项目：黑龙江省中医药科研项目（）；黑龙江中医药大学校基金项目（）；黑龙江中医药大学基础医学院青年教师科研资助项目（）作者简介：李文昊（），女，博士，讲师，研究方向：经方治疗疑难杂症的临床与基础研究，龙江医派研究，：通信作者：姜德友（），男，博士，二级教授，研究方向：经方治疗疑难杂症的临床与基础研究，龙江医派研究，：基于嘌呤配体 门控离子通道型受体 的资生肾气丸镇痛机制研究李文昊任鹏鹏韩洁茹常佳怡解颖陈飞李富震姜德友（黑龙江中医药大学，哈尔滨，；哈尔滨医科大学附属第一医院中西医结合科，哈尔滨，）摘要目的：探索资生肾气丸对醋酸致小鼠扭体模型的镇痛作用。方法：将 只小鼠随机分为 组，分别给予相应药液灌胃，末次灌胃 后造模，建立醋酸致小鼠扭体模型。观察小鼠扭体次数，计算其扭体抑制率，应用酶联免疫吸附试验（）检测各组小鼠血清白细胞介素 （）、前列腺素（）、神经生长因子（）含量，采用实时 （）检测嘌呤配体 门控离子通道型受体 （）、样受体蛋白 （）、相关激酶（）的表达情况。结果：与模型组比较，随着时间的增加，资生肾气丸低剂量、中剂量、高剂量均可抑制小鼠扭体反应，降低扭体次数，增加小鼠扭体抑制率，降低小鼠血清中 、的含量，降低 、的表达以抑制疼痛反应，以高剂量效果最优（），与吲哚美辛、痛风舒片疗效相近。结论：资生肾气丸高剂量对小鼠血清疼痛因子的降低效果显著，其机制可能与嘌呤配体 门控离子通道型受体 信号通路有关。关键词资生肾气丸；镇痛机制；嘌呤配体 门控离子通道型受体 ；样受体蛋白 ；相关激酶 ；前列腺素；白细胞介素 ；痛风性关节炎 ，（，；，）：，（）（），（），（），（），（），（）：，（），：；，；中图分类号：文献标识码：痛风性关节炎（，）是尿酸钠晶体沉积所引起的一种严重疼痛性关节炎 ，其急性发作被认为是最痛苦的症状之一，与分娩或内脏绞痛同等程度 。即使是晚期痛风患者也常常表现为慢性关节疼痛、肿胀、运动受限和痛风复发。资生肾气丸（，）是姜德友教授 ，经过多年研究，结合临床实践，创制的纯中药复方。具有补肾利湿、标本兼顾之功，前期的临床观察、网络药理学及实验研究已初步证实 治疗 疼痛及炎 症 反 应 具 有 显 著 的 改 善 作 用 ，可 能 与 信号通路及 信号通路有关 。样受体蛋白 （），是 炎症反应的主要参与者，近年来研究发现其与嘌呤配体 门控离子通道型受体 （，）、相关激酶 （，）的关系密切 ，三者在 疼痛及炎症反应的发作中起到关键作用，但具体机制尚不清楚。因此，为了进一步探索 对 疼痛的具体调控机制，本实验采用小鼠冰醋酸扭体致痛模型复制疼痛反应，观察小鼠扭体次数，计算其扭体抑制率，并且应用酶联免疫吸附技术）检测相关疼痛因子白细胞介素 （，）、前 列 腺 素（，）、神经生长因子（，）含量，采用实时荧光定量 （）检测 信号通路中 的表达情况。材料与方法 材料 动物体质量 的健康雄性 小鼠 只，周龄，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号 （辽）。动物实验室为高清洁级，饲养温度（），相对湿度 ，通风条件良好，室内自然光照，符合 实验动物环境及设施 要求 。药物 处方由熟地黄、山药、茯苓、牡丹皮、怀牛膝、土茯苓等组成 ，方中药材从黑龙江中医药大学附属第一医院中药房一次性选购。痛风舒片（湖北绿金子药业有限责任公司，批号：），吲哚美辛（阿拉丁，批号：），冰醋酸（阿拉丁，批号：）。试剂与仪器 酶联免疫吸附试验检测试剂（武 汉 优 尔 生 公 司，货 号：）；酶联免疫吸附试验检测试剂盒（武汉优尔生公司，货号：）；酶联免疫吸附试验检 测 试 剂 盒（武 汉 优 尔 生 公 司，货 号：）；酶标仪（公司，美国，型号：）；电热恒温培养箱（天津泰斯特公司，型号：）；实时 仪（公司，韩国，型号：）等。方法 分组与模型制备 只雄性 小鼠适应性喂养 周后，随机分为 组，即空白组、模型组、痛风舒对照组、吲哚美辛对照组，低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组 只。模型制备：除空白组外，其余各组小鼠分别腹腔注射 冰醋酸生理盐水溶液 只 ，空白组注射等量生理 盐 水。分 别 观 察 并 记 录 注 射 冰 醋 酸 后 、内小鼠的扭体次数，小鼠出现腹部内凹、身体扭曲、躯干与后腿伸展、臀部高起、蠕行反应为扭体反应 ，出现任意一项计为 次。末次记录各组小鼠扭体次数后，以心脏采血法采集小鼠外周血。先将小鼠以 水合氯醛腹腔注射麻醉，打开胸腔，暴露心脏，用一次性采血针针头刺入右心室，吸取 血液，并移入以小鼠组别编号的离心管内，静置 ，离心 ，取上清液，移入对应编号的 管，冰箱保存。给药方法 已知成年人标准体质量为 ，方中药物总重量为 ，即成年人 口服用量。根据徐叔云等主编的 药理实验方法学 可知 ，小鼠每日灌胃剂量约是成年人每日服用量的 倍。由此可知，痛风舒对照组给予痛风舒片混悬液 ；吲哚美辛对照组给予吲哚美辛溶液 ；按照低 中 高 比例计算 ；低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给药 、，依据小鼠每日的体质量变化给药。空白组及模型组用等体积蒸馏水灌胃。各组均于造模前 开始给相应的药物或给蒸馏水灌胃，次 ，连续，末次给药 后造模。检测指标与方法）对小鼠一般状态的观察：观察各组小鼠摄食、饮水、体质量、排泄、活动及精神状态等一般情况。）统计小鼠扭体次数并计算小鼠扭体抑制率：扭体抑制率（）（模型组扭体次数 给药组扭体次数）模型 组 扭 体 次 数 。）酶联免疫吸附试验检测小鼠血清中 、物质、羟色胺的表达：酶联免疫吸附试验试剂按标签说明 储存，使用前恢复到室温，并充分摇匀，以避免试剂产生泡沫，造成浪费，按照试剂盒说明书进行操作。）检测 小 鼠 血 清 中 、的表达：提取总 。浓度检测：使用紫外分光光度计 测定各样本中 的浓度。反转录，引物的合成与设计，引世界中医药 年 月第 卷第 期物由金斯瑞生物科技有限公司根据 软件合成，引物序列见表 。表 扩增各靶基因的引物序列引物名称引物序列 正向 反向 正向 反向 正向 反向 正向 反向 注：以 作为内参，采用 方法分析相对折叠变化 统计学方法全部数据使用 统计软件进行数据分析，计量资料若满足正态性和方差齐性，则应用单因素 ；不满足正态性和方差齐性时给予非参数检验中 检验，为差异有统计学意义；多组比较，数据满足正态性和方差齐性时，采用单因素方差分析，不满足正态 性 和 方 差 齐 性 时 采 用 非 参 数 检 验 中 检验，以 为差异有统计学意义。结果 对小鼠灌胃后的一般情况的影响除空白组、模型组一般情况良好外，吲哚美辛对照组中部分小鼠逐渐出现饮食、饮水减少，腹泻，精神萎靡，毛发暗淡无光，活动减少等表现。痛风舒对照组中部分小鼠亦逐渐出现精神萎顿，活动减少表现。各剂量组小鼠饮食及二便皆正常，活动灵活，精神饱满，尤其以 高剂量组中小鼠的一般情况最佳。对冰醋酸致小鼠扭体反应次数以及扭体抑制率的影响与模型组比较，在 及 时，吲哚美辛对照组、痛风舒对照组及 高剂量组中扭体次数显著降低（），扭体抑制率均明显升高（均 ）；在 时，低剂量组及 中剂量组的扭体次数亦降低（），扭体抑制率亦升高（）。与吲哚美辛对照组比较，在 及 时，低剂量组扭体次数较高（），扭体抑制率降低（），而 中剂量组及 高剂量组差异无统计学意义（）；在 时，各剂量组差异有统计学意义（）。见图 。对小鼠血清 、表达的影响与空白组比较，模型组中 、的表达均明显升高（均 ）。与模型组比较，吲哚美辛对照组、痛风舒对照组、中剂量组及 高剂量组中 及 的表达均下降（均 ）；吲哚美辛对照组、痛风舒对照组及 高剂量组中 的表达亦下降明显（）。与吲哚美辛对照组比较，低剂量组及 中剂量组中 、表达差异有统计学意义（），痛风舒对照组及 高剂量组则没有差异；低剂量组中 的表达差异有统计学意义（），其他用药组则差异无统计学意义（）。见表。图 各组小鼠不同时间点的扭体次数图 各组小鼠不同时间点的扭体抑制率注：空白组中小鼠各时间点的扭体反应次数为 ，扭体抑制率为 ，不参与比较；与模型组比较，；与吲哚美辛对照组比较，表 各组小鼠血清 、的表达情况（珋 ，）组别 空白组 模型组 吲哚美辛对照组 痛风舒对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 注：与空白组比较，；与模型组比较，；与吲哚美辛对照组比较，对 、表达的影响与空白组比较，模型组中 、的表达量均明显升高（）。与模型组比较，吲哚美辛对照组、痛风舒对照组及 高剂量组中 、的表达均降低（均 ）。与吲哚美辛对照组比较，痛风舒对照组中 、表达降低，低剂量组及 中剂量组 者的表达均升高（均 ），但 高剂量组 者的表达差异无统计学意义（）。各给药观察组中，痛风舒片、高剂量及 吲 哚 美 辛 均 可 明 显 降 低 小 鼠 血 清 中 、的表达，其中 高剂量与吲哚美辛疗效相近，而 低剂量、中剂量疗效不明显。见图 。图 各组小鼠 、及 的表达情况注：与空白组比较，；与模型组比较，；与吲哚美辛对照组比较，讨论 对小鼠扭体次数及扭体抑制率的影响根据实验数据可得，各组治疗药物均能降低小鼠扭体次数，增加扭体抑制率，达到镇痛效果。进一步分析扭体抑制率可知，在 时，低剂量、中剂量的扭体抑制率比 时略有降低，而在 时明显升高。并且在 时，与模型组比较，各剂量组的扭体次数均显著降低，扭体抑制率显著增高。但在 时，各剂量均具有明显的镇痛作用，其疗效与痛风舒片及吲哚美辛相近。对多种疼痛因子的调控作用随着炎症细胞中 炎症小体激活，作为疼痛和炎症反应核心的 被释放如细胞外及血液中，诱导并产生更多的炎症介质及趋化因子 。临床研究发现，患者的疼痛与 、的水平正相关 。在与 相似的骨关节炎的研究中，亦发现外周血白细胞中 基因的高表达与疼痛增加相关 ，并且 与关节炎缓解后疼痛的持续或复发有关 。亦可通过向下丘脑发出炎症疼痛信号参与传入疼痛反应，促进痛觉过敏 ，并诱导下丘脑产生 。最新研究表明 亦与 的疼痛机制相关 ，其可通过致敏和兴奋作用与组胺、缓激肽协同作用，增强组织对疼痛递质和因子的敏感性，从而引起疼痛并加重疼痛 。除 外，亦与关节疼痛及关节软骨细胞和滑液中的炎症有关 。有学者在人类细胞培养中发现 对正常和骨关节炎成纤维细胞的 和蛋白的表达具有调控作用 。本实验发现模型组组小鼠血清中 、及 表达明显高于空白组，提示 、及 与小鼠疼痛反应密切相关。与模型组比较，吲哚美辛对照组、痛风舒对照组及 高剂量组的药物均能够明显下调 、及 的表达。由此可知，可通过下调 、及 的表达发挥镇痛作用。在 各剂量组中，以 高剂量下调 及 的效果最佳。对 、的调控作用通过国内外研究可知，在免疫系统激活的条件下，细胞释放 ，通过 促进细胞内外离子环境改变 ，进而调控 、的表达，促进 等炎症介质及疼痛介质的分泌，从而引起炎症反应及疼痛 。本研究进一步发现，模型组中 、的表达均明显高于空白组，可知在醋酸致小鼠扭体模型中，、均在转录水平参与疼痛反应。而吲哚美辛、痛风舒片及 各剂量在转录水平上对 、具有调控作用。研究亦发现，与 低剂量、中剂量比较，高剂量对 、的调控作用更强。结合扭体次数及扭体抑制率结果可推测，高剂量的镇痛效果更佳，疗效与吲哚美辛及痛风舒片相近，这提示 高剂量对小鼠疼痛反应的抑制作用更强有关。值得一提的是，通过观察小鼠的一般情况发现，吲哚美辛对照组中小鼠出现诸多消化系统异常的症状，如大便偏稀，毛色暗淡，精神萎顿等表现，可见虽然吲哚美辛镇痛效果显著，但其不良反应明显。痛风舒对照组中小鼠亦出现明显的精神倦怠表现，这可能与痛风舒片的功效侧重清热利湿，忽略补益脾肾有关。而 各剂量组小鼠的饮食、排泄均无异常，且精神饱满，尤其以 高剂量组的一般情况世界中医药 年 月第 卷第 期最佳，可见 扶正祛邪，标本同治之功强于痛风舒片及吲哚美辛。综上所述，在醋酸致小鼠扭体模型中，降低小鼠扭体次数，提高扭体抑制率从而发挥镇痛效果的机制可能与其在转录水平调控 信号通路，抑制 、的表达，进一步下调 、及 的表达有关。且 对扭体小鼠的镇痛效果呈剂量依赖性增加，与 低剂量、中剂量比较，高剂量的镇痛效果更佳，且无不良反应。因此，在 高剂量镇痛效果与吲哚美辛及痛风舒片相近的条件下，选择 治疗 更加符合临床实践。这一发现可为 调控 疼痛机制的深入研究提供理论依据。利益冲突声明：无。参考文献 ，（）：，（）：彭欣，徐蓉娟 健脾化痰、补肾泄浊法治疗高尿酸血症 中医杂志，（）：韩洁茹，解颖，常佳怡，等 资生肾气丸方化裁治疗急性痛风性关节炎临床疗效分析 长春中医药大学学报，（）：，（）：隋方宇，韩洁茹，周雪明，等 补肾利湿法中药复方对大鼠痛风性关节炎 信号传导通路调控作用的研究 上海中医药杂志，（）：路荣荣，曹越，雷晓蕾，等 基于 信号通路调控自噬探讨当归四逆汤对痛风性关节炎大鼠的影响 中国实验方剂学杂志，（）：，（）：，（）：姜德友，李文昊，解颖，等 嘌呤配体 门控离子通道型受体 及其下游分子在痛风性关节炎中作用机制的研究进展 世界中医药，（）：国家质量监督检验检疫总局、国家标准化管理委员会 实验动物环境及设施 中国实验动物信息网，：王亚斌，何建成 清天通络饮镇痛、抗炎作用的实验研究 中国中医药科技，（）：律广富，仇志凯，常诗卓，等 玉米须总黄酮抗炎镇痛及对急性痛风性关节炎的改善作用研究 药物评价研究，（）：徐淑云，卞如濂，陈修 药理实验方法学 版 北京：人民卫生出版社，：王芳，曹静，李阳，等 降尿酸复方抗痛风的药效学和急性毒性研究 天然产物研究与开发，（）：，周友良 蠲痹历节清方抗炎镇痛机制实验研究 长沙：湖南中医药大学，?，：（），（）：王钰洁，钟晓宇，王新红，等 基于 信号通路探讨灰毛党参抗类风湿性关节炎活性及机制 中国中药杂志，（）：，?，（）：，?，：？，（）：，（）：王丽苹，江涛，陈强威，等 八味痛风康微丸抗痛风作用的实验研究 中药药理与临床，（）：罗曼，费洪新，刘旭，等 急性痛风性关节炎的发病机制 黑龙江科学，（）：孙广瀚，刘健，万磊，等 基于血清蛋白组学探讨黄芩清热除痹胶囊改善急性痛风性关节炎急性炎症的作用研究 中草药，（）：，（）：，：，（）：，：，：，（），（）：（收稿本文编辑：张雄杰），