基于网络药理学、分子对接技术及体外实验验证探讨龙葵治疗乳腺癌的作用机制.pdf

天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1782-1793基于网络药理学、分子对接技术及体外实验验证探讨龙葵治疗乳腺癌的作用机制温馨，胡锦航1*，程敏1,2*，宋忠兴1陕西中医药大学陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心秦药特色资源研究开发国家重点实验室（培育）陕西省创新药物研究中心，咸阳7 12 0 8 3；商洛学院，商洛7 2 6 0 0 0摘要：基于网络药理学和细胞实验探讨龙葵治疗乳腺癌的作用机制。利用TCMSP数据库、Swiss-Target-Prediction和文献挖掘等方法收集龙葵的活性成分7 种,通过GeneCards数据库收集与乳腺癌相关靶基因110 个,运用Cyto-scape3.8.0软件构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络，将潜在靶点导入STRING11.5数据库中获取PPI网络，使用DAVID数据库对潜在靶点进行GO及KEGG富集分析。GO功能富集分析发现6 94个结果。KEGG通路富集分析发现12 8 个结果（P0.05），涉及癌症、PI3K/Akt、M A PK 等相关的信号通路。运用AutoDock-vina1.1.2软件对龙葵中的7 种关键活性成分,皮树脂醇、-胡萝卜素、谷笛醇、薯皂苷元、澳洲茄碱、胆固醇及皮素与潜在靶点AKT1、ESR1、EG FR、SRC、M A PK 1进行分子对接，结果显示预测的关键成分薯皂苷元与核心靶点AKT1和ECFR等具有较好的结合性。细胞实验结果表明，不同浓度的薯皂苷元可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖并促进细胞凋亡,薯皂苷元可调控EGFR、A K T 1以及p-AKT1蛋白的表达,同时薯皂苷元可下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达、上调促调亡蛋白Bax表达。综上结果表明,龙葵抗乳腺癌的潜在作用机制可能与调控MDA-MB-231细胞增殖及凋亡等过程相关,且通过两个关键靶基因AKT1 和EGFR发挥作用。关键词：龙葵；乳腺癌；网络药理学；分子对接；薯皂苷元;细胞调亡中图分类号:R285D0I:10.16333/j.1001-6880.2023.10.015Mechanism of Solanum nigrum in treatment of breast cancer based on networkpharmacology,molecular docking and in vitro experimental verifcation Shaanxi Innovative Drug Research Center,State Key Laboratory of Research&Development of CharacteristicQin Medicine Resources（Cu l t i v a t i o n)Co-c o n s t r u c t i o n Co l l a b o r a t i v e In n o v a t i o n Ce n t e r f o r Ch i n e s e M e d i c i n eResources Industrialization by Shaanxi&Education Ministry,Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712083,China;Abstract:To explore the mechanism of action of Solanum nigrum in the treatment of breast cancer based on network pharma-cology and cellular experiments.The TCMSP database,Swiss-Target-Prediction and literature mining were used to collect sev-en active ingredients of S.nigrum.One hundred and ten target genes related to breast cancer were collected through the Gene-Cards database,and Cytoscape 3.8.0 software was used to construct the drug-active-ingredient-target-disease network.Thepotential targets were imported into the STRING 11.5 database to obtain the PPI network,and GO and KEGG enrichment ana-lyses were performed on the potential targets using the DAVID Database.Go function enrichment analysis found 694 items.KEGG pathway enrichment analysis found 128 items(P 0.05),involving cancer,PI3K/AKT,MAPK and other signalingpathways related to S.nigrum.Molecular docking of seven key active ingredients medioresinol,B-carotene,sitosterol,diosge-nin,solanocapsine,cholesterol and quercetin from S.nigrum with potential targets AKTI,ESR1,EGFR,SRC,MAPK1,using收稿日期:2 0 2 3-0 4-2 0基金项目：国家自然科学基金（8 2 10 42 30）；陕西省科技创新团队（2 0 2 2 TD-56）；秦岭特色生物资源综合开发利用项目（2 0 19ZY-CXPT-09）；咸阳市2 0 2 0 重大科技专项（2 0 2 0 K01-20）*通信作者 E-mail:,文献标识码：AWEN Xin,HU Jin-hang*,CHENG Min-*,SONG Zhong-xing2 Shangluo University,Shangluo 726000,China接受日期:2 0 2 3-0 7-2 8文章编号：10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)10-17 8 2-12Vol.35AutoDock-vina 1.1.2 software.The molecular docking results showed that the predicted key component,diosgenin,showedgood binding to the core targets,such as AKT1 and EGFR.The results showed that different concentrations of diosgenin inhib-ited the proliferation and promoted apoptosis of triple-negative breast cancer cells MDA-MB-231,and diosgenin regulated theexpression of EGFR,AKT1 and p-AKT1 proteins,meanwhile diosgenin also down-regulated the expression of anti-apoptoticprotein Bcl-2 and up-regulated the expression of pro-apoptotic protein Bax.The above results suggest that the potential mecha-nism of action of S.nigrum against breast cancer may be related to the regulation of MDA-MB-231 cell proliferation and apop-tosis,and through two key target genes AKT1 and EGFR.Key words:Solanum nigrum;breast cancer;network pharmacology;macromolecular docking;diosgenin;apoptosis乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤之_1,也是女性癌症相关死亡的主要原因2 。乳腺癌的患病风险与很多因素有关,如年龄,遗传,生殖因素以及肥胖等3。目前,激素疗法、手术、化疗和放疗是乳腺癌治疗的主要策略，然而，由于乳腺癌是一种复杂且高度异质性疾病,多药耐药和严重的副作用限制了这些治疗方法的治疗效果,因此,迫切需要开发更有效、更安全的抗乳腺癌药物4.5。在癌症治疗中,中药和天然产物具有多层次、多途径、多靶点、高效且副作用小等优势，展现出良好的抗肿瘤效果6.7 。而中药及其活性化合物抗乳腺癌具有疗效确切,毒副作用小、靶点丰富及机制多样等特点，中药来源的抗乳腺癌药物具有良好的开发和应用前景。龙葵（Solanum nigrumL.）是茄科的一种药用植物，广泛分布于欧洲、亚洲和美洲。龙葵具抗癌、抗炎,抗氧化、抗菌和抗癫痫等作用,其主要的生物活性成分包括留体皂苷、生物碱、酚类和多糖8.9。现代研究表明,龙葵及其活性成分（主要为笛体类、有机酸类、木脂素类及其他类）可用于治疗不同类型的癌症,如肝癌10 、宫颈癌1、胰腺癌12 、乳腺癌13 等。龙葵甲醇提取物可诱导乳腺癌细胞MDA-MB-468发生自噬和凋亡14,龙葵水提物和乙醇提取物对乳腺癌细胞 MCF-7具有细胞毒性,并诱导MCF-7 细胞发生凋亡和周期阻滞1315,除此之外，龙葵也可通过表观遗传调节发挥抗乳腺癌的作用16 。薯皂苷元是一种来源于薯属植物的天然笛体皂苷元,具有较好的抗肿瘤活性,研究表明薯皂苷元可通过抑制Vav2活性抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移,并影响细胞的迁移行为,揭示薯皂苷元可能具有抗转移潜能17 。尽管上述研究取得了一定的进展，但龙葵抗乳腺癌的物质基础、作用靶点及详细的分子机制尚不完全明确。本研究基于网络药理学和分子对接相结合的技术方法，构建多层次、多角度的“药物-靶标-通路-疾病”网络关温馨等：基于网络药理学、分子对接技术及体外实验验证探讨龙葵治疗乳腺癌的作用机制后得到乳腺癌的相关疾病靶点。1.3收集龙葵活性成分治疗乳腺癌潜在靶点将挖掘到的乳腺癌相关疾病靶点和龙葵活性成分相关靶点导人线软件VENNY2.1（h t t p s:/b i o i n-b.csic.es/tools/venny/）进行分析,筛选映射获取交集得到龙葵治疗乳腺癌的潜在作用靶点，并绘制维恩Venn图。1.4蛋白质相互作用(PPI)网络的构建将龙葵治疗乳腺癌作用映射的交集靶点输人STRING10.5在线软件（https:/string-db.org）构建蛋白相互作用网络，然后将PPI网络数据导入Cyto-scape 3.8.0进行拓扑分析,并通过插件MCODE聚类分析共同靶点的度值大小筛选出核心靶点。1.5GO功能分析和KECG通路富集分析利用生物学信息注释数据库（DAVID,https:/david.ncifcrf.gov/summary.jsp,Version 6.8）将潜在1783系,并结合体外细胞实验进行验证,明确了龙葵有效成分薯皂苷元可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖并诱导细胞发生调亡，初步探讨了薯皂苷元的作用分子机制,为龙葵治疗乳腺癌的进一步研究提供参考。1材料与方法1.1龙葵活性成分筛选及作用靶点获取采用 TCMSP(http:/ l18)为筛选依据,获得龙葵的活性成分。此外，通过PubChem(https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库和 SwissTargetPredicition（h t t p:/w w w.s w i s s t a r-getprediction.ch/）数据库19 收集龙葵有效成分及其作用靶点，筛选后利用UniProt数据库（https:/www.uniprot.org/）进行蛋白靶点矫正。1.2收集乳腺癌相关靶点使用 GeneCards（h t t p s :/w w w.g e n e c a r d s.o r g/)数据库以“breast cancer”为关键词进行检索，去重1784作用靶点Symbol录人，Identifier选择为“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”,物种选择为“Homo sapiens”,列表类型选择为“Gene List”，进行 GO 功能分析和KEGG通路富集分析。根据P值筛选得到GO生物学功能分析结果和KEGG通路富集分析结果,并将获得的结果通过微生信分析平台（http：/w w 3.8.0中构建“药物-活性成分-靶点-通路”网络图。网络中各节点（node)分别代表活性成分和关键靶点基因；网络中边（edge）用来连接活性成分与关键靶点基因;连接到网络的节点以度值（degree）为单位进行表示。网络中节点度值越大，表明该有效成分发挥的作用越强。1.7分子对接将筛选得到的龙葵核心成分与乳腺癌疾病关键靶点进行分子对接，分析来计算网络中关键枢纽的亲和力。配体的三维(3D)结构从PubChem数据库下载。利用RCSB数据库（http:/www.rcsb.org/）获得受体的三维结构。配体和受体由 mgltools_win32_1.5.6软件修复，并保存为PDBQT文件。AutoDock Vina 1.1.2软件（http:/vina.scripps.edu/)用于测试关键活性成分和目标蛋白质之间对接的亲和力。1.8实验细胞人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自江苏凯基生物技术股份有限公司。细胞株用含10%胎牛血清的L15培养液培养，并置于37，10 0%空气，饱和湿度条件下恒温培养。1.9主要试剂薯皂苷元（批号：S229101，纯度为10 0%，Selleck生物科技有限公司），用1.2 0 59mL的乙醇将50 mg纯度为10 0%的薯皂苷元溶解,终浓度为10 0 mmol/L,-20 保存;Annexin V-FITC/PI 试剂盒（批号：A211-01，南京诺唯赞生命科技股份有限公司）；MTT（批号：90 6 M501，北京索莱宝科技有限公司）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（批号：P1200-2,北京索莱宝科技有限公司）、Hoechst33342（批号：2 0 2 110 15，北京索莱宝科技有限公司）；蛋白Marker(批号:912 2 7 18 9,Thermo公司）;BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：PA115，天根生化科技有限公天然产物研究与开发司）;ECL化学发光底物（批号：18 0-50 0 1，上海天能生命科学有限公司）；兔抗p-AKT1单克隆抗体（批号:90 18 S,Cell Signaling Technology）;兔抗AKT1单克隆抗体（批号：N12151652，沈阳万类生物科技有限公司）、兔抗ECFR单克隆抗体（批号：N08180628，沈阳万类生物科技有限公司）；鼠抗Bax单克隆抗体（批号：10 0 0 50 17,武汉三鹰生物技术有限公司）、鼠抗Bcl-2单克隆抗体（批号：10 0 2 2 354，武汉三鹰生物技术有限公司）、鼠抗-action单克隆抗体（批号：10 0 2 17 8 7，武汉三鹰生物技术有限公司）、HRP标记的山羊抗兔IgG（批号：2 0 0 0 0 2 58，武汉三鹰生物技术有限公司）、HRP标记的山羊抗鼠IgG（批号：2 0 0 0 0 37 4，武汉三鹰生物技术有限公司）。1.10MTT法检测薯皂苷元对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响将对数生长期的细胞接种于96 孔培养板中,加人不同浓度的薯皂苷元培养48 h,弃去上清，每孔加入18 0 L无血清的培养基和2 0 L5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h后,弃去上清,加人150 LDMSO溶解 MTT甲瓒沉淀,混匀后，使用酶标仪检测490 nm处的吸光度（A）。按公式计算肿瘤细胞生长抑制率：抑制率=（1-A样品/A对照）10 0%，以细胞抑制率对药物浓度对数作图,计算出薯皂苷元对 MDA-MB-231 细胞的 ICso值。1.11Hoechst 33342检测细胞形态将细胞接种至2 4孔板中，接种密度为110 个/孔;细胞贴壁后用不同浓度的薯皂苷元对细胞进行处理。用免疫染色固定液固定细胞,PBS洗3次,按照Hoechst 33342试剂盒中的说明书进行染色，使用荧光显微镜观察并拍照。1.12汤流式细胞术检测细胞凋亡率将对数生长期的细胞接种于6 孔培养板中,培养2 4h后用不同浓度的薯皂苷元进行处理，48 h后消化细胞并离心收集细胞。使用细胞调亡检测试剂盒对细胞进行染色,利用流式细胞仪检测细胞的调亡并用Flowjo软件分析。1.13Western blot检测相关蛋白的表达细胞处理同“1.12”,收集细胞，使用RIPA裂解液,提取细胞总蛋白。通过BCA定量法测定蛋白浓度,将等量的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳。采用湿转电转移的方法,将蛋白转移至 PVDF膜上,用5%的脱脂奶粉（TBST配制）37 封闭PVDF膜1Vol.35Vol.35h,去除封闭液,孵育一抗（1:2 0 0 0）,4过夜,TBST洗膜三次，室温孵育二抗（1:50 0 0)1h,TBST洗膜三次后用ECL发光液显影,使用ChemiDoc XRS图像系统结合Image Lab软件进行图像采集以及数据分析。1.14统计分析采用GraphPad Prism9.0软件对数据进行统计分析。实验数据以均数标准差（s）表示,进行Mol IDMOL002058MOL002773MOL000359MOL000546MOL007356MOL000953MOL000098温馨等：基于网络药理学、分子对接技术及体外实验验证探讨龙葵治疗乳腺癌的作用机制化合物Compound皮树脂醇Medioresinol-胡萝卜素-Carotene谷笛醇Sitosterol薯皂苷元Diosgenin澳洲茄碱Solanocapsine胆固醇 Cholesterol皮素 Quercetin1785组间比较采用ANOVA方差分析,P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1龙葵活性成分筛选及作用靶点确定通过TCMSP数据库,并结合相关文献报道，根据OB30%和DL0.18筛选出符合条件且剔除无对应靶点信息的龙葵活性成分共7 个（见表1)。表1龙葵活性成分信息Table 1Active ingredients of S.nigrum57.237.1836.9180.8852.9437.8746.43OB(%)DL0.620.580.750.810.670.680.282.2龙葵治疗乳腺癌的潜在作用靶点预测通过GeneCards数据库筛选获得乳腺癌相关靶点17 2 9个，利用在线软件Venny2.1对乳腺癌相关靶点和龙葵活性成分相关靶点进行映射,取交集后，获得共同靶点110 个，即龙葵可能通过多个潜在作用靶点协同治疗乳腺癌（见图1）。1316.6%1105.6%172987.8%龙葵Solamumnigrum图1龙葵活性成分相关靶点与乳腺癌相关靶点韦恩图Fig.1Venn analysis of breast cancer target and S.nigrum target2.3PPI 网络构建将龙葵与乳腺癌的110 个共同靶点输入STRING数据库,获得 PPI网络,利用 Cytoscape 3.8.0进行网络可视化（见图2）。该网络中涉及110 个节点,10 96 条边,其中节点表示靶基因,边表示靶基因间的相互作用关系。根据插件的网络拓扑分析结果显示，节点degree平均值为19.9。根据节点数值筛选ERBB2、EG FR、K IT、SRC、ESR1、A K T 1、M A PK 1、乳腺癌BreastcancerPIK3CA等关键靶点,并认为这些靶点对龙葵治疗乳腺癌起到关键作用。2.4靶点的GO富集分析将龙葵110 个交集靶点录人DAVID数据库中，共得到GO富集分析结果6 94个，其中包括499个生物过程（biological processes,BP）6 3个细胞组分（c e l l c o m p o s i t i o n,CC）和132 个分子功能（molecularfunction,MF）。各筛选出排名前10 的GO富集结果1786天然产物研究与开发Vol.35RKCNTRK25HBGPPARAMAPK14CYPIOATCYP3A42PTKARPIK3R1MDM2PIK3CAPPARGMMP9ERBB2EMAPK1SRCEGFRESR1AKT1MMP13RXRAABL1KITESR2CDK1AK2COK4MCLICYP2C19FTPN1KORNR3CTRALT-5F1LGRMBCNEKESRRAMP12NR1H2PM图2PPI网络互作图Fig.2 PPI network interaction graph绘制柱形图（见图3）。生物富集结果表明激酶活性正调节、蛋白酪氨酸激酶活性、结合蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、MAPK级联的正向调节、PI3K信号RNApolymeraseIItranscriptionfactoractivity,ligandactivated sequencespecifieDNAbindingProtein serine/threoninekinase activityEnzymebindingKinaseactivityZinc ion bindingSteroid binding0图3GO功能富集分析Fig.3GO enrichment analysis2.5靶点的KEGG通路富集分析KEGG通路富集分析中筛选得到137 条信号通路,取排名前2 0 的通路进行KEGG可视化，绘制气泡图（见图4）。与乳腺癌相关的通路主要有癌症通正向调节、锌离子结合、ATP结合等生物过程均在龙葵治疗乳腺癌过程中发挥着重要作用。Positive regulation ofkinase activityPeptidyl-tyrosine phosphorylationTransmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathwayProtein autophosphorylationProtein phosphorylationMulticellularorganismdevelopmentPositive regulation of cell proliferationNegativeregulationofapoptotic processPositiveregulationofMAPKcascadePositive regulation of phosphatidylinositol 3-kinase signalingReceptorcomplexPlasmamembraneNucleus-NucleoplasmCytoplasmMacromolecularcomplexCytosolPerinuclear regionofcytoplasmIntegral component of plasma membraneIntracellularmembrane-boundedorganelleTransmembranereceptor protein tyrosine kinase activityProtein tyrosinekinase activityATPbindingProtein kinase activity路、PI3K/Akt信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性信号通路、ErbB信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路和Rapl信号通路等。该结果提示龙葵通过作用于多条信号通路来发挥治疗乳腺癌的作用。-logio(pvalue)3082010MF20406080Vol.35温馨等：基于网络药理学、分子对接技术及体外实验验证探讨龙葵治疗乳腺癌的作用机制1787ErbBsignaling pathwayAcutemyeloid leukemiaGiastric cancerFocaladhesion-Progesterone-mediated oocytematurationMicroRNAs incancerRapl signaling pathwayMelanoma-Prolactin signaling pathwayMAPKsigmaling pathwayBladdereancerRas signaling pathwayProteoglycans in cancerProstate cancerNon-small cell lung eancerCentralcarbonmetabolism incancerEGFRtyrosinekinase inhibitorresistanceEndocrine resistancePI3K-Ak signaling pathwayPathways in cancer图4共有靶点的前2 0 条KEGG通路Fig.4Bubble chart of KECG enrichment for common target protein2.6“成分-靶点-通路”网络构建采用Cytoscape软件构建“成分-靶点-通路”网络图（见图5），该网络共有138 个节点，其中7 个成分（橙色菱形）、110 个靶点（蓝色四边形）、2 0 条通-logio(pvalue)252015102030400.00+005.00-101.009路（绿色圆形）,492 条边。图中用度值（degree）预测出节点间的关联数，且度值越大表明该成分或该靶点越重要。1.5e-092.00-09ESR2NTRKTERTCYP1B1COKAHRMETRANBAL1H5O178RARAADC1UACOK1TOP2ACYP24A1PARAMYLKFARPlamiLOXT4CDK4FANTRYMOLTL0277图5龙葵-靶点-疾病及相关通路的互作网络Fig.5Interaction network of S.nigrum-target-disease and related pathways2.7分子对接根据龙葵抗乳腺癌互作网络的主要活性成分，选择基因网络中具有大多数靶点的五个组分和具有高度节点的蛋白质进行分子对接。表2 和图6 为关键靶点的活动中心坐标以及对接的结合能,分子对接结合自由能越小,则代表受体与配体间的亲和力越大。取与每个蛋白质结合最强化合物进行可视化处理（见图7）。结果显示,所有化合物与蛋白对接的结合能均小于-6 kcal/mol,说明各化合物与各蛋白均能较好结合。为了验证上述结果，使用分子对接分析来计算网络中关键枢纽的亲和力。2.8薯皂苷元对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响MTT实验表明,与对照组（O mol/L）相比,不同浓度(3.12 5、6.2 5、12.5、2 5、50、10 0、2 0 0 mol/L)的薯皂苷元对MDA-MB-231细胞增殖的抑制率均显著增高，说明薯皂苷元可抑制MDA-MB-2311788天然产物研究与开发Binding energy(keal/mol)MAPKIVol.35结合能-6.900SRCEGFRESRIAKTIB-胡萝卜素谷葡醇S-11.70停Sitosterol碧预皂书元Diosgenin澳洲市威Solanocapsine搏皮素Queretitsterol图6 龙葵活性成分与靶点蛋白结合能热图Fig.6 Thermogram of binding energy between active components of S.nigrum and target protein表2活性成分与靶点蛋白结合能Table 2Binding energy of active components to target proteins活性成分结合能 Binding energy(kcal/mol)Active componentAKT1皮树脂醇Medioresinol-9.2-胡萝卜素-Carotene-7谷笛醇Sitosterol-11.7薯皂苷元Diosgenin-10.5澳洲茄碱Solanocapsine-9.7胆固醇 Cholesterol-10皮素 Quercetin-10.5ESR1-7.6-7.2-8.3-7.1-6.9-7.8-8.1EGFR-8.1-8.2-10.1-8.8-8.1-9.2-9SRC-7.4-8.3-9.9-7.7-8.2-9.2-9.5MAPK1-7.1-7-8.6-7-7.5-8.8-10.3BataraetuetH-8otbenoACOCtAKTI福H-BondsDorot福tmterantimESR1续图7(Continued Fig.7)Vol.35温馨等：基于网络药理学、分子对接技术及体外实验验证探讨龙葵治疗乳腺癌的作用机制1789H-BonDonoEGFRH-BondsSRCH-BondsDorMAPKI图7 薯皂苷元与关键靶点分子对接模式图Fig.7 Docking pattern diagram of diosgenin elements with key target molecules细胞的增殖,并且抑制作用呈剂量依赖性（见图8）。计算薯皂苷元抑制MDA-MB-231细胞的ICso为44.983.06mol/L，故后续实验采用0、15、30、6 0mol/L薯皂苷元处理MDA-MB-231细胞进行机制研究。8060-*40-*20-*022525薯皂苷的浓度Concentration of diosgenin(mol/L)图8 不同浓度薯皂苷元对MDA-MB-231细胞增殖的影响（xs,n=3)Fig.8 Effects of diosgenin with different concentrations on proliferation of MDA-MB-231 cells(x s,n=3)注：与0 umol/L薯皂苷元组相比，*P0.001。No t e:Co mp a r e d w i t h 0 mol/Ldiosgenin group,*P0.001.2.9薯皂苷元对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响Hoechst33342染色，并采用荧光显微镜观察细胞形态。如图9所示,对照组细胞核被 Hoechst33342染成均匀的蓝色,呈圆形或椭圆形，不同浓度薯皂苷元处理组则出现典型的调亡特征，包括不同程度的呈致密浓染的细胞核。1790天然产物研究与开发Vol.35薯横皂苷元对照组ControlDiosgenin(umol/L)153060S1150umS0Jum5050mm图9不同浓度薯皂苷元对MDA-MB-231细胞形态学的影响Fig.Effects of diosgenin with different concentrations on cell morphology of MDA-MB-231 cells注：白色箭头标记凋亡细胞。Note：W h i t e a r r o w s ma r k a p o p t o t i c c e l l s.Annexin V-FITC/PI 双染法结果显示,与对照组相比，不同浓度（15、30、6 0 mol/L）的薯皂苷元A50m均可诱导MDA-MB-231细胞凋亡（见图10）。薯横皂苷元Diosgenin(umol/L)对照组ControlQ3.0%1O15Q1101.660%30101.74%60QI3.52%10101410AnnexinVAnnexinVB30-20-10-Annexinv早期调亡Earlyapoptosis晚期凋亡LateapoptosisAnnexinv6薯横皂苷元Diosgenin(umol/L)图10 不同浓度薯皂苷元对MDA-MB-231细胞凋亡的影响(xs,n=3)Fig.10 Effects of diosgenin with different concentrations on apoptosis of MDA-MB-231 cells(x s,n=3)注:与对照组相比，*P 0.001。No t e:Co mp a r e d w i t h c o n t r o l,*P 0.0 0 1.2.10薯皂苷元对MDA-MB-231细胞中AKT1、P-AKT1、EG FR以及凋亡相关蛋白表达的影响Western blot 检测 MDA-MB-231细胞中EGFR、AKT1、p-A K T 1、Ba x、Bc l-2 蛋白的表达,-action作为内参。实验结果显示，与对照组相比,薯皂苷元可下调MDA-MB-231细胞中EGFR蛋白表达，同时上调AKT1蛋白表达，下调p-AKT1蛋白表达（见图11A）。与对照组相比，薯皂苷元可上调MDA-MB-231细胞中Bax蛋白表达,同时下调Bcl-2蛋白表达(见图 11B)。60Vol.35注：与对照组相比，*P0.05,*P0.01,*P0.001。No t e:Co mp a r e d w i t h c o n t r o l,*P 0.0 5,*P 0.0 1,*P 0.0 0 1.3讨论与结论龙葵是我国传统中草药，现代药理学发现龙葵有多种生物活性，且大多数集中在抗肿瘤领域2 0 2 1。有研究表明其活性成分薯皂苷元可通过调节多种细胞信号通路发挥抗肿瘤作用,且与细胞生长、分化、凋亡等众多重要的分子靶点密切相关2 2,2 3本研究通过网络药理学TCMSP数据库2 4 分析,共筛选出皮树脂醇-胡萝卜素、谷笛醇、薯皂苷元、澳洲茄碱、胆固醇和皮素7 个有效活性成分,将挖掘到的龙葵活性成分相关靶点与乳腺癌疾病靶点导人线软件VENNY2.1映射获取交集，同时PPI网络分析表明这些交集靶点间具有密切的联系。有研究表明,皮素、澳洲茄碱和谷笛醇具有抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡等药理作用2 5-2 7 。薯皂苷元可促进乳腺癌MCF-7细胞和Skp2细胞的凋亡2 8 。由此可见,龙葵有效成分皮素、澳洲茄碱、谷笛醇和薯皂苷元可发挥抗肿瘤作用。化合物-靶点网络图可知，龙葵-疾病靶点取交集后共得到110 个靶点，进一步筛选发现ERBB2、EGFR、K IT、SRC、ESR1、A K T 1、M A PK 1、PIK 3CA 等为龙葵有效成分治疗乳腺癌的靶蛋白。其中皮树脂醇、薯皂苷元和皮素等都作用于AKT1和温馨等：基于网络药理学、分子对接技术及体外实验验证探讨龙葵治疗乳腺癌的作用机制A对照组ControlEGFRAKT1P-AKTIB-actinBBaxBcl-2-actin图11不同浓度薯皂苷元对相关蛋白表达的影响(s,n=3)Fig.11 Effects of diosgenin with different concentrations on the expression of related proteins(x s,n=3)1791薯皂元Diosgenin(umol/L)1530薯皂苷元Diosgenin(mol/L)对照组Control6-604-2对照组Control8BaxBcl-21530EGFRAKT1P-AKT160642ControlEGFR靶点，AKT（