基于无定形沸石-咪唑框架-8材料固定米根霉源脂肪酶研究.pdf

第 41 卷 第 6 期2023 年 11 月食 品 科 学 技 术 学 报Journal of Food Science and TechnologyVol.41 No.6Nov.2023doi:10.12301/spxb202200982文章编号:2095鄄6002(2023)06鄄0039鄄13引用格式:芦瑜涵,张成楠,李秀婷,等.基于无定形沸石-咪唑框架鄄8 材料固定米根霉源脂肪酶研究J.食品科学技术学报,2023,41(6):39-51.LU Yuhan,ZHANG Chengnan,LI Xiuting,et al.Immobilization of lipase derived from Rhizopus oryzae based on amor鄄phous zeolitic imidazolate framework鄄8 material J.Journal of Food Science and Technology,2023,41(6):39-51.基于无定形沸石-咪唑框架鄄8 材料固定米根霉源脂肪酶研究芦瑜涵1,摇 张成楠1,*,摇 李秀婷1,2,摇 徐友强1,摇 李微微1(1.北京工商大学 食品与健康学院/北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京摇 100048;2.北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京摇 100048)摘摇 要:多级孔沸石-咪唑框架鄄8(zeolitic imidazolate framework鄄8,ZIF鄄8)材料相较于传统的 ZIF鄄8材料具有更大的孔径,在固定化酶领域展现了较好的应用前景。目前,利用多级孔 ZIF鄄8 材料固定米根霉源脂肪酶(Rhizopus oryzae lipase,ROL)的效果仍不清楚。通过调节 ZIF鄄8 材料前驱体的初始物质的量比例,制备得到一种无定形 ZIF鄄8(amorphous zeolitic imidazolate framework鄄8,aZIF鄄8)材料,基于 ZIF鄄8 和 aZIF鄄8 材料,采用原位自封装法制备得到固定化脂肪酶ROLZIF鄄8 和ROLaZIF鄄8。利用红外光谱仪、X鄄射线衍射仪和扫描电子显微镜等研究了 ZIF鄄8、aZIF鄄8、ROL ZIF鄄8 及 ROLaZIF鄄8 的形貌及结构差异,比较了在不同 ROL 质量浓度条件下制备的 ROL aZIF鄄8 与相同质量浓度 ROL 的酶活力,考察了 ROL 和 ROL aZIF鄄8 的酸碱稳定性、温度耐受性、储藏稳定性以及对邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)和邻苯二甲酸二异丁酯(diisobutyl phthalate,DIBP)的水解能力。结果表明,aZIF鄄8 材料呈现出包含十字花形、正方形、球形等多种形态的无定形形貌,是一种具有微孔和介孔的多级孔材料。在ROL 的质量浓度为4mg/mL 的条件下制备的ROLaZIF鄄8 呈现最大酶活力,为5郾 69 U/mg。在相同的 ROL 质量浓度条件下,aZIF鄄8 材料的疏水性及多级孔特性促使 ROL aZIF鄄8 的酶活力比 ROL 高。ROL aZIF鄄8 比 ROL 具有更好的碱稳定性、温度耐受性、储藏稳定性以及更高的对 DBP 和 DIBP 的水解能力。关键词:脂肪酶;多级孔沸石-咪唑框架鄄8 材料;固定化酶;原位自封装法;形貌中图分类号:TS202郾 3摇 摇 摇 摇 摇 文献标志码:A收稿日期:20221027基金项目:国家自然科学基金资助项目(32001638;31830069)。Foundation:National Natural Science Foundation of China(32001638;31830069).第一作者:芦瑜涵,女,硕士研究生,研究方向为食品酶学。摇*通信作者:张成楠,男,副教授,博士,主要从事食品生物技术方面的研究。摇 摇脂肪酶(triacylglycerol acyl hydrolases,EC 3.1.1.3)是一类丝氨酸水解酶,在微水和非水相中能够催化酯化、转酯、酯解等多种反应1-2,被认为是目前生物领域中最为重要的工业酶之一3,在食品和饲料等领域具有较大的商业价值4。米根霉源脂肪酶(Rhizopus oryzae lipase,ROL)作为常用的商业酶之一,能够改变甘油骨架连接的脂肪酸类型,在油脂加工、风味酯类物质合成和天然等同酯香料制备方面具有重要的应用5-8。然而,游离的 ROL 存在化学稳定性差、回收困难和无法连续化操作等问题9-10,限制了其在工业中的实际应用。寻找提升ROL 稳定性及可重复利用率,同时在最大程度上保93持其催化活性的方法,一直是研究者面对的艰巨任务与挑战11。固定化酶技术是解决生物酶稳定性差、回收困难等问题的有效方法之一12-14。目前,研究人员已成功将 ROL 固定在 NKA鄄9 树脂、HPMC鄄PVA 膜、磁性纳米颗粒、苯乙 烯-二乙烯基苯等多种基质上10,15-17。尽管基于这些载体制备的固定化 ROL展现了稳定性提高及可重复利用等优点,但由于其大多采用吸附法制备,载体对酶分子的束缚较弱,在一定条件下容易出现酶渗漏、浸出等问题11。沸石-咪 唑 框 架鄄8(zeolitic imidazolate framework鄄8,ZIF鄄8)是以 Zn2+和咪唑连接体通过配位键自组装形成的一种金属有机骨架材料18-19。ZIF鄄8 材料具有较大的比表面积、可调控的孔道尺寸及较强的化学和热稳定性等优点,在酶固定化领域备受关注20-21。以 ZIF鄄8 材料为载体制备固定化酶的方法主要包括吸附法、共价交联法、孔隙封装法和原位自封装法11,18。原位自封装法是将酶加入ZIF鄄8 材料的前驱体溶液中,在自组装形成 ZIF鄄8材料的同时,直接把酶固定在 ZIF鄄8 内部18。与吸附法制备的固定化酶相比,原位自封装法制备的固定化酶减少了酶渗漏、浸出等问题,其稳定性和可重复利用性提高。目前,基于 ZIF鄄8 材料利用原位自封装法已实现了产碱杆菌源脂肪酶、黑曲霉源脂肪酶和皱褶假丝酵母源脂肪酶的固定化22-24。尽管基于 ZIF鄄8 材料采用原位自封装法制备的固定化脂肪酶已展现了较好的应用前景,但是由于 ZIF鄄8 材料较小的孔径,酶的底物或产物在进出 ZIF鄄8 材料孔隙时会产生较大的传质阻力,降低固定化酶的催化效率22-25。为了解决该问题,研究人员开发了多种具有更大孔径的 ZIF鄄8 材料。Feng 等26在无水甲醇体系下合成了具有微孔(孔径 2 nm)和介孔(孔径为 2 50 nm)的多级孔ZIF鄄8 材料,并基于此材料利用原位自封装法制备了包含细胞色素 C 和葡萄糖氧化酶的多酶催化纳米反应器。然而,由于 ROL 的甲醇耐受性较差,在固定化过程中 ROL 可能发生变性失活27。Cui等28研究发现,在一定的前驱体初始物质的量比例条件下可以制备出具有介孔的十字花形状ZIF鄄8材料,利用此材料原位封装过氧化氢酶制备的固定化酶活性,比采用传统ZIF鄄8 材料制备的固定化酶活性提高了 4 倍。Wu 等29通过缺陷法制备出具有微孔及介孔的多级孔 ZIF鄄8 材料,应用该材料通过原位自封装法制备了固定化葡萄糖氧化酶,其显示出比基于仅具有微孔的 ZIF鄄8材料制备的固定化酶高 5 20 倍的表观活性。采用多级孔 ZIF鄄8 材料固定化酶不仅提高了酶的稳定性和可重复利用性,而且保持甚至提高了酶的催化活性。在原位自封装过程中,酶分子表面的电荷分布、酶分子与 ZIF鄄8 材料间形成的氢键、疏水相互作用等显著影响 ZIF鄄8 材料的成核、生长及组装,进而影响固 定 化 酶 的 形 貌 及 催 化 活 性11,28,30。Liang等19基于 ZIF鄄8 材料采用原位自封装法固定脂肪酶、尿素酶、葡萄糖脱氢酶等不同酶时发现,固定化酶因酶的结构差异呈现不同的形貌特征。Chen等31比较了利用 ZIF鄄8 材料原位自封装葡萄糖氧化酶、细胞色素 C、辣根过氧化物酶、过氧化氢酶、尿酸氧化酶和乙醇脱氢酶制备的固定化酶的催化性能,发现酶的表面净电荷对固定化酶的固载率和酶活力具有较大影响。目前,利用多级孔 ZIF鄄8 材料采用原位自封装法固定 ROL 的效果仍不清楚。本研究拟通过调节前驱体初始物质的量的比例,制备无定形 ZIF鄄8(aZIF鄄8)材料,希望获得一种具有更大孔径的 aZIF鄄8 材料。采用原位自封装法固定米根霉源脂肪酶,制备固定化脂肪酶 ROL aZIF鄄8,研究 ZIF鄄8、aZIF鄄8、ROL aZIF鄄8 及采用 ZIF鄄8 材料固定化 ROL(ROL ZIF鄄8)的形貌及结构差异,比较游离 ROL 与 ROL aZIF鄄8 的热稳定性、酸碱耐受性、贮存 稳 定 性 及 对 邻 苯 二 甲 酸 二 丁 酯(dibutylphthalate,DBP)和邻苯二甲酸二异丁酯(diisobutylphthalate,DIBP)的水解能力,以期为基于多级孔ZIF鄄8 材料制备固定化脂肪酶提供更多的思路。1摇 材料与方法1郾 1摇 材料与试剂ROL、2鄄甲基咪唑、醋酸锌、异丙醇和对硝基苯酚丁酸酯(p鄄nitrophenyl butyrate,p鄄NPB),美国 Sig鄄ma鄄Aldrich 公司;乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic Acid,EDTA),西陇科学股份有限公司;DBP 和 DIBP,国药集团化学试剂有限公司。实验所用试剂均为分析纯。1郾 2摇 仪器与设备CR 22N 型多用途冷冻离心机、jsm7610f 型扫描04食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 11 月电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)、Jem2100p 型透射电子显微镜(transmission electronmicroscopy,TEM)、扫描透射电镜-能量色散 X 射线光谱仪(scanning transmission electron microscopy鄄energy dispersive X鄄ray spectrometry,STEM鄄EDX),日本日立公司;Free zone 4郾 5 plus 型真空冷冻干燥机,美国 Labconco 公司;Nicolet IS50 型傅里叶变换红外光谱仪(Fourier transform infrared spectroscopy,FT鄄IR),赛默飞世尔科技有限公司;D8advance 型 X鄄射线衍射仪(X鄄ray diffraction,XRD),布鲁克公司;N2吸附解吸仪,美国康塔公司;Theta Flex 型水接触角仪,瑞典百欧林公司;电感耦合等离子体发射光谱仪(inductively coupled plasma optical emission spectrom鄄eter,ICP鄄OES)、7890B 型气相色谱仪,美国安捷伦科技有限公司。1郾 3摇 实验方法1郾 3郾 1摇 aZIF鄄8、ROL aZIF鄄8、ZIF鄄8 及 ROL ZIF鄄8的制备1郾 3郾 1郾 1摇 aZIF鄄8 及 ROL aZIF鄄8 的制备参考 Wu 等29的方法并适当修改。将 1 mL20 mmol/L 的醋酸锌溶液逐滴加至 1 mL 33郾8 mmol/L的 2鄄甲基咪唑溶液中,立刻加入 80 滋L、5 mg/mL 的ROL 溶液,在300 r/min 下反应30 min。反应结束后用去离子水洗涤沉淀物 3 次,收集沉淀,冷冻干燥12 h,得到 ROL aZIF鄄8。在相同条件下不添加 ROL溶液制备 aZIF鄄8 材料。1郾 3郾 1郾 2摇 ZIF鄄8 及 ROL ZIF鄄8 的制备参考梁鑫等24的方法并适当修改。将 20 mL1 mol/L 的2鄄甲基咪唑溶液与 80 mg 的 ROL 混合均匀,加 入 2 mL 0郾 5 mol/L 的 醋 酸 锌 溶 液,在300 r/min 下反应 30 min。反应结束后用去离子水洗涤沉淀物 3 次,收集沉淀,冷冻干燥 12 h,得到ROL ZIF鄄8。在相同条件下不添加 ROL 溶液制备ZIF鄄8 材料。1郾 3郾 2摇 aZIF鄄8、ROL aZIF鄄8、ZIF鄄8 及 ROL ZIF鄄8的形貌及结构观察取一定量的 aZIF鄄8、ROL aZIF鄄8、ZIF鄄8 以及ROL ZIF鄄8 样品,研磨至均匀粉末。采用 XRD、SEM 和 TEM 观察样品形貌和晶体结构;采用FT鄄IR、STEM鄄EDX 及 ICP鄄OES 分析样品中元素组成、分布及比例;采用 N2吸附解吸仪测定温度为 77 K 时样品的 N2吸附解吸等温线,计算 Brunauer鄄Emmett鄄Teller(BET)面积、孔径分布和孔隙体积;采用水接触角仪分析样品的亲疏水性。1郾 3郾 3摇 ROL 和 ROL aZIF鄄8 酶活力的测定ROL 和 ROL aZIF鄄8 酶活力的测定方法参考Qi 等32的方法并稍加修改。将一定量的 ROL 和ROL aZIF鄄8 加入 pH 值为 7郾 5 的 1 mL 0郾 01 mol/L的磷酸盐缓冲液中,与 1 mL 2 mg/mL 溶于异丙醇中的 p鄄NPB 溶液混匀后,在室温条件下反应5 min。反应结束后,加入 1 mL 终止液(40 g NaOH 和 93郾 5 gEDTA 溶于 1 L 去离子水中)终止反应,在 4 益条件下离心收集上清液,在 405 nm 波长处测定吸光值。酶活力单位定义为:每分钟释放 1 滋mol 对硝基苯酚(p鄄nitrophenol,p鄄NP)所需的 ROL 和 ROL aZIF鄄8的质量,以 U/mg 表示。1郾 3郾 4摇 不同质量浓度的 ROL 与 ROL aZIF鄄8 酶活力的测定采用不同质量浓度(3、4、5、6、7 mg/mL)的 ROL溶液分别制备 ROL aZIF鄄8,分析 ROL aZIF鄄8 与相同质量浓度 ROL 的酶活力。1郾 3郾 5摇 不同条件下 ROL 与 ROL aZIF鄄8 酶活力的测定1郾 3郾 5郾 1摇 不同 pH 值条件下 ROL 与 ROL aZIF鄄8酶活力的测定将 ROL 以及 ROL aZIF鄄8 置于不同 pH 值(7郾 5、8、9、10)的 0郾 01 mol/L PBS 缓冲液中,在室温下保温 60 min,测定其酶活力。1郾 3郾 5郾 2摇 不同温度条件下 ROL 与 ROL aZIF鄄8 酶活力的测定将 ROL 以及 ROL aZIF鄄8 置于 pH 值为7郾 5 的0郾 01 mol/L PBS 缓冲液中,在不同温度(30、40、50、60、70 益)下保温 60 min,测定其酶活力。1郾 3郾 5郾 3摇 不同储藏时间条件下 ROL 与 ROL aZIF鄄8酶活力的测定将 ROL 以及 ROL aZIF鄄8 置于 pH 值为7郾 5 的0郾 01 mol/L PBS 缓冲液中,在 4 益 下储藏不同时间(0、2、4、6、8、10、15、20、25 d),测定其酶活力。1郾 3郾 6摇 ROL 及 ROL aZIF鄄8 水解 DBP 和 DIBP 能力的测定以 pH 值为 7郾 4 的 0郾 05 mol/L Tris鄄HCl 溶液为缓冲体系,将 0郾 78 mL Tris鄄HCl 缓冲液、200 滋L50 mg/mL 的ROL 溶液或 50 mg ROL aZIF鄄8,以及20 滋L 10 g/L 的 DBP 和 DIBP 混合溶摇液充分混合,在 150 r/min、37 益条件下反应2 h。反应结束后,使用正己烷(含内标油酸乙酯)萃取,进行气相色谱分14第 41 卷 第 6 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 芦瑜涵等:基于无定形沸石-咪唑框架鄄8 材料固定米根霉源脂肪酶研究析。分析条件:安捷伦 HP鄄INNO WAX 色谱柱,80 益保持 3 min,以 20 益/min 的速率升至 250 益,保持22郾 5 min。以未加入 ROL 溶液或 ROL aZIF鄄8 的催化反应体系中的 DBP 和 DIBP 残余量为 100%,计算 ROL 以及 ROL aZIF鄄8 对 DBP 和 DIBP 的分解率。1郾 4摇 数据处理数据以平均值 依 标准偏差表示。采用 SPSS 25统计 软 件 经 单 因 素 方 差 分 析 进 行 数 据 比 较,P 0郾 05 为差异显著。2摇 结果与分析2郾 1摇 ZIF鄄8、aZIF鄄8、ROLZIF鄄8 和 ROLaZIF鄄8的形貌比较在原位自封装过程中,前驱体的初始物质的量比例不同,会形成具有不同形貌及结构的 ZIF鄄8 材料28-29。在本研究中,ZIF鄄8 材料是在 2鄄甲基咪唑和醋酸锌(前驱体)初始物质的量比例为 20颐 1的条件下制备获得,而 aZIF鄄8 材料是在 2鄄甲基咪唑和醋酸锌初始物质的量比例为 1郾 69颐 1郾 00 的条件下制备获得。ROL ZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 分别是在 ZIF鄄8和 aZIF鄄8 材料组装过程中加入 ROL 制备获得。对ZIF鄄8、ROL ZIF鄄8、aZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 进行了晶体结构和形貌分析,分析结果见图 1 至图 3。由图1 可见,ZIF鄄8 材料和 ROL ZIF鄄8 在2兹 为7郾 40毅、10郾 41毅、12郾 78毅、14郾 74毅、16郾 50毅和 18郾 07毅处出现强峰,其衍射峰分布规律与基于理论数据模拟的 ZIF鄄8材料一致,且相对强度相似33-34;而 aZIF鄄8 材料和ROL aZIF鄄8 在 2兹 为 11郾 05毅、12郾 14毅、17郾 25毅 和18郾 43毅处出现强峰,这与 ZIF鄄8 材料和 ROL ZIF鄄8衍射峰分布规律具有明显差异,表明相较于 ZIF鄄8材料和 ROL ZIF鄄8,aZIF鄄8 材料和 ROL aZIF鄄8 的晶体结构发生了明显改变35。由图 2(a)和(c)可见,ZIF鄄8 材料呈现出规则的多面体形貌,而 aZIF鄄8材料呈现出包含十字花形、正方形、球形等多种形态的无定形形貌。微观结构分析结果与形貌分析结果一致图 3(a)和(c)。研究发现,在 2鄄甲基咪唑和醋酸锌的初始物质的量比例为4颐 1以及更高的条件下,ZIF鄄8 材料呈现出规则的菱形十二面体结构,这与我们的研究结果相似23,29。Cui 等28研究发现,在 2鄄甲基咪唑和硝酸锌的初始物质的量比例为摇 摇1郾 6颐 1郾 0 的条件下,catalase ZIF鄄8 呈现十字花形的聚合物形貌,而在 2鄄甲基咪唑和硝酸锌的初始物质的量比例为1郾 8颐 1郾 0 的条件下,catalase ZIF鄄8 呈现多面体形貌。这表明,aZIF鄄8 材料的无定形形貌是因为在相对低的前驱体初始物质的量比例条件下制备获得的。兹 表示 X 射线的入射角度。图 1摇 ROL aZIF鄄8、aZIF鄄8、ZIF鄄8、ROL ZIF鄄8 和模拟 ZIF鄄8 的 XRD 分析Fig.1摇 XRD analysis of ROL aZIF鄄8,aZIF鄄8,ZIF鄄8,ROL ZIF鄄8 and simulated ZIF鄄8摇尽管 ROL ZIF鄄8 也呈现出多面体形貌,但相较于 ZIF鄄8 材料,ROL ZIF鄄8 的边界变得凹凸不平,并且面积有轻微的减小图 2(b)、图 3(b)。ROL aZIF鄄8 呈现出与 aZIF鄄8 材料相似的无定形形貌,但其形态更加多样图2(d)、图3(d)。为了确证 ROL ZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 中是否含有 ROL,对 ROL、ZIF鄄8、ROL ZIF鄄8、aZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8进行了红外光谱分析(图 4)。由图 4 可见,ZIF鄄8、ROL ZIF鄄8、aZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 均在波数为560 cm-1和 1 308 cm-1处出现特异吸收峰。位于560 cm-1处的吸收峰是 Zn鄄N 拉伸振动产生的,而位于1 350 1 500 cm-1处的吸收峰是2鄄甲基咪唑振动产生的。这些结果说明,ZIF鄄8、ROL ZIF鄄8、aZIF鄄8和 ROL aZIF鄄8 结 构 中 存 在 Zn2+与 2鄄甲 基 咪唑36-37。ROL ZIF鄄8 和ROL aZIF鄄8 均在1 600 1 700 cm-1处出现蛋白质酰胺键的特异吸收峰,而ZIF鄄8 以及 aZIF鄄8 未观察到相应的吸收峰,表明ROL 已成功固定在 ZIF鄄8 和 aZIF鄄8 材料上35,38-39。这些结果表明,在固定化 ROL 后,与 ZIF鄄8 和 aZIF鄄8材料相比,ROL ZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 的形貌发生了改变19,40-41。24食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 11 月图 2摇 ZIF鄄8、ROL ZIF鄄8、aZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 的形貌分析Fig.2摇 Conformational analysis of ZIF鄄8,ROL ZIF鄄8,aZIF鄄8 and ROL aZIF鄄8图 3摇 ZIF鄄8、ROL ZIF鄄8、aZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 的微观结构分析Fig.3摇 Microstructural analysis of ZIF鄄8,ROL ZIF鄄8,aZIF鄄8 and ROL aZIF鄄8摇2郾 2摇 ZIF鄄8、aZIF鄄8、ROLZIF鄄8 和 ROLaZIF鄄8的结构比较ZIF鄄8 材料形貌的改变往往伴随着其结构的变化28-29。利用 STEM鄄EDX 及 ICP鄄OES 对 ZIF鄄8、ROL ZIF鄄8、aZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 中 Zn 和 N 元素分布及比例进行了研究,分析结果见图 5 和表 1。由图 5 可见,ZIF鄄8、ROL ZIF鄄8、aZIF鄄8 和 ROLaZIF鄄8 中 Zn 和 N 元素分布均匀40。由表 1 可见,ZIF鄄8 材料和 ROL ZIF鄄8 中 N 与 Zn 的物质的量比为4郾 58 和4郾 35,而aZIF鄄8 材料和ROL aZIF鄄8 中34第 41 卷 第 6 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 芦瑜涵等:基于无定形沸石-咪唑框架鄄8 材料固定米根霉源脂肪酶研究图 4摇 ROL、ROL aZIF鄄8、aZIF鄄8、ZIF鄄8 和ROL ZIF鄄8 的红外光谱分析Fig.4摇 Infrared spectral analysis of ROL,ROL aZIF鄄8,aZIF鄄8,ZIF鄄8 and ROL ZIF鄄8摇N 与 Zn 的物质的量比则降至1郾 53 和1郾 94。这表明在 ZIF鄄8 材料和 ROL ZIF鄄8 中,平均一个锌离子与4郾 3 4郾 5 个氮原子配位,而在 aZIF鄄8 材料和 ROLaZIF鄄8 中,平均一个锌离子与 1郾 5 1郾 9 个氮原子配位。Wu 等29研究发现,与仅具有微孔的 ZIF鄄8 材料相比,具有微孔及介孔的多级孔 ZIF鄄8 材料的 N与 Zn 的物质的量比例降低,这与本研究结果相似。当锌离子与相对较少的氮原子配位时,ZIF鄄8 材料会出现结构缺陷,导致其孔径变大甚至出现介孔29。为 了 探 究ZIF鄄8、ROL ZIF鄄8、aZIF鄄8和ROL aZIF鄄8 的孔径大小,利用 N2吸附法测定了其N2吸附-解吸等温线、孔径分布及比表面积,分析结果见图 6、图 7 和表 2。由图 6 可见,随相对压力的增加,不同材料及固定化 ROL 的 N2吸附量呈现不摇 摇黄色表示 Zn 元素的分布,红色表示 N 元素的分布。图 5摇 ZIF鄄8、ROL ZIF鄄8、aZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 的 STEM鄄EDX 分析Fig.5摇 STEM鄄EDX analysis of ZIF鄄8,ROL ZIF鄄8,aZIF鄄8 and ROL aZIF鄄8摇表 1摇 ZIF鄄8、aZIF鄄8、ROL ZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 中的N 和 Zn 元素比例Tab.1摇Ratio of N and Zn elements in ZIF鄄8,aZIF鄄8,ROLZIF鄄8 and ROL aZIF鄄8组别m/mgw(N)/%w(Zn)/%n(N)/n(Zn)ZIF鄄82郾 012 025郾 8126郾 154郾 58aZIF鄄82郾 211 011郾 9836郾 461郾 53ROL ZIF鄄81郾 925 025郾 2626郾 934郾 35ROL aZIF鄄82郾 344 016郾 3339郾 061郾 94同的变化趋势。通过与 6 种类型 N2吸附-解吸等温线的标 准 形 状 比 较 发 现,ZIF鄄8 材 料 和 ROL ZIF鄄8 的N2吸附-解吸等温线呈现出玉型吸附等温线特征,表明 ZIF鄄8 材料和 ROL ZIF鄄8 的微孔性质;而 aZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 的 N2吸附-解吸等温线呈现出域型吸附等温线特征,表明 aZIF鄄8 材料和图 6摇 ROL ZIF鄄8、ZIF鄄8、aZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 的 N2吸附-解吸等温线Fig.6摇N2adsorption鄄desorption isotherm of ROL ZIF鄄8,ZIF鄄8,aZIF鄄8 and ROL aZIF鄄8摇ROL aZIF鄄8存在微孔和介孔42-43。由图 7 可见,ZIF鄄8材料和ROL ZIF鄄8的孔径分布在1 2 nm,44食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 11 月V 表示孔容,D 表示孔径。图 7摇 ZIF鄄8、ROL ZIF鄄8、aZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 的孔径分布Fig.7摇Pore size distribution of ZIF鄄8,ROL ZIF鄄8,aZIF鄄8and ROL aZIF鄄8摇表 2摇 ZIF鄄8、aZIF鄄8、ROL ZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 的 BET 表面积和孔隙体积Tab.2摇BET surface area and pore volume of ZIF鄄8,aZIF鄄8,ROL ZIF鄄8 and ROL aZIF鄄8组别BET 比表面积/(m2 g-1)孔隙体积/(cm3 g-1)ZIF鄄81 569郾 4310郾 549 7aZIF鄄883郾 8970郾 189 0ROL ZIF鄄81 569郾 1590郾 577 5ROL aZIF鄄826郾 2610郾 217 7表明 ZIF鄄8 材料和 ROL ZIF鄄8 形成了微孔;而aZIF鄄8 材料和 ROL aZIF鄄8 的孔径分布在1 20 nm,表明 aZIF鄄8 材料和 ROL aZIF鄄8 中既存在微孔又存在介孔。由表 2 可见,相较于 ZIF鄄8 材料和 ROL ZIF鄄8,aZIF鄄8 材料和ROL aZIF鄄8 的BET比表面积和孔隙体积均出现显著减小,这可能是因为,在相对低的前驱体初始物质的量比例条件下,aZIF鄄8 材料出现结构缺陷,造成 BET 比表面积减小和孔容下降29。本研究结果表明,通过调节前驱体的物质的量比例制备得到的 aZIF鄄8 材料是一种具有微孔和介孔的多级孔材料。2郾 3摇 酶质量浓度对 ROLaZIF鄄8 酶活力的影响为探究利用 aZIF鄄8 材料采用原位自封装法固定 ROL 的效果,本研究比较了在不同 ROL 质量浓度条件下制备的 ROL aZIF鄄8 与相同质量浓度的ROL 的酶活力差异,分析结果见图 8。由图 8 可见,当 ROL 的质量浓度从3 mg/mL 增加到4 mg/mL 时,ROL aZIF鄄8 催化 p鄄NPB 水解的能力逐渐增强;当ROL 的质量浓度从 4 mg/mL 增加到 7 mg/mL 时,ROL aZIF鄄8 的酶活力逐渐减弱。在 ROL 的质量浓度为 4 mg/mL 的条件下制备的 ROL aZIF鄄8 呈现最大酶活力,为 5郾 69 U/mg。通过与文献报道的固定化 ROL 的酶活力相比较,本研究中制备的 ROL aZIF鄄8 的酶活力处于最高水平10,13,15-17,44-48。在相同质量浓度条件下,ROL aZIF鄄8 的酶活力比ROL 高,表明利用 aZIF鄄8 材料采用原位自封装法固定 ROL 可以增强酶的催化活性。图 8摇 酶质量浓度对 ROL 和 ROL aZIF鄄8 酶活力的影响Fig.8摇Effects of enzyme mass concentrations on enzymaticactivities of ROL and ROL aZIF鄄8摇ROL aZIF鄄8 催化活性增强的效果可能与ROL“盖子冶 结构的构象变化有关49-51。ROL 具有由两亲性氨基酸组成的“盖子冶 结构52。“盖子冶结构具有独特的打开-闭合构象变化现象52。当“盖子冶结构处于闭合构象时,ROL 的催化中心会被“盖子冶盖住,阻止了底物进入催化中心,表现为酶的催化活性较低;当“盖子冶结构处于打开构54第 41 卷 第 6 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 芦瑜涵等:基于无定形沸石-咪唑框架鄄8 材料固定米根霉源脂肪酶研究象时,底物和产物可以较容易地进出催化中心,表现为酶的催化活性大幅提高53-54。研究发现,当使用疏水性的载体固定化脂肪酶时,脂肪酶的“盖子冶结构可以处于稳定的打开构象,固定化脂肪酶表现出较高的催 化 活 性53-56。为 探 究 ROLaZIF鄄8 催化活性增强效果的可能原因,本研究比较了 ZIF鄄8、ROL ZIF鄄8、aZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 的亲疏水性差异,分析结果见图 9。由图 9 可见,ZIF鄄8材料和 aZIF鄄8 材料均具有较强的疏水性,aZIF鄄8 材料的疏水性相较于 ZIF鄄8 材料减弱。这表明利用 aZIF鄄8 材料固定化 ROL 可能诱导 ROL的“盖子冶结构处于打开构象,从而使 ROL aZIF鄄8的催化活性提高49-50。疏水性的载体可能在固定化过程中诱导酶的聚集,导致固定化酶催化活性的下降57。aZIF鄄8 材料的疏水性相较于 ZIF鄄8材料减弱可能有助于减少在固定化过程中 ROL 的聚集,促使固定化酶的催化活性保持甚至提高57。由图 9 可知,ROL ZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 均呈现出亲水性,这可能是由于在固定化 ROL 后,ROL增强了材料的亲水性29。ROL aZIF鄄8 中因结构缺陷形成的多级孔结构可能造成部分的 ROL 暴露于固定化酶表面,导致 ROL aZIF鄄8 的亲水性相较于 ROL ZIF鄄8 增强,这也同时促使了底物更容易与 ROL 的催化活性中心结合29。本研究结果表明,aZIF鄄8 材料的疏水性及多级孔特性对 ROL aZIF鄄8 催化活性的增强有重要的促进作用。图 9摇 ZIF鄄8、ROL ZIF鄄8、aZIF鄄8 和 ROL aZIF鄄8 的接触角分析Fig.9摇 Contact angle analysis of ZIF鄄8,ROL ZIF鄄8,aZIF鄄8 and ROL aZIF鄄8摇2郾 4摇 不同条件下 ROL 和 ROLaZIF鄄8 酶活力的比较2郾 4郾 1摇 pH值对 ROL 和 ROL aZIF鄄8 酶活力的影响pH 值对 ROL 和 ROL aZIF鄄8 酶活力的影响,实验结果见图 10。由图 10 可见,在 pH 值为 7郾 5 10郾 0 时,固定化酶 ROL aZIF鄄8 的酶活力均高于游离脂肪酶 ROL,表明固定化酶比游离酶具有更好的碱耐受性。这可能是由于 aZIF鄄8 材料和 ROL 间通过疏水相互作用、范德华相互作用和氢键等创造了一个保护酶分子的微环境从而改善了酶的碱稳定性30,39。2郾 4郾 2摇 温度对 ROL 和 ROL aZIF鄄8 酶活力的影响温度对 ROL 和 ROL aZIF鄄8 酶活力的影响,实验结果见图 11。由图 11 可见,在 30 70 益下保温1 h 后,ROL aZIF鄄8 比 ROL 具有更高的酶活力,这表明固定化酶比游离酶具有更好的温度耐受性,这可能是因为 aZIF鄄8 材料对 ROL 产生的保护作用28-29。2郾 4郾 3摇 储藏时间对 ROL 和 ROL aZIF鄄8 酶活力的影响储藏时间对 ROL 和 ROL aZIF鄄8 酶活力的影响,实验结果见图 12。由图 12 可见,随储藏时间的摇 摇64食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 11 月图 10摇 pH 值对 ROL 和 ROL aZIF鄄8 酶活力的影响Fig.10摇 Effect of pH on enzymatic activities of ROL andROL aZIF鄄8摇图 11摇 温度对 ROL 和 ROL aZIF鄄8 酶活力的影响Fig.11摇 Effect of temperature on enzymatic activities ofROL and ROL aZIF鄄8摇延长,ROL aZIF鄄8 和 ROL 的酶活力均下降,但ROL aZIF鄄8 的酶活力降低幅度相较于 ROL 较小。在经过 25 d 储藏后,ROL aZIF鄄8 的酶活力降至其初始酶活力的30郾 5%,而 ROL 的酶活力降至其初始酶活力的20郾 4%,表明 ROL aZIF鄄8 比 ROL 具有更好的储藏稳定性。储藏稳定性的提高可能是因为aZIF鄄8 材料包裹在 ROL 周围,防止 ROL 水解和聚合以及环境对酶活性位点的破坏,从而使酶活力降低 减 缓2,51。Cheng等58研 究 发 现,利 用Cu鄄BTC 金属有机骨架材料采用原位自封装法制备的固定化脂肪酶在经过 20d 的储藏后仍保持了97郾 1%的酶活力。Nadar 等23研究发现,利用 ZIF鄄8材料采用原位自封装法制备的固定化脂肪酶在经过25 d 的储藏后酶活力降低了 10%。与这些固定化脂肪酶相比,ROL aZIF鄄8 的储藏稳定性较弱,原因可能 是 由 于 aZIF鄄8 材 料 的 结 构 缺 陷 降 低 了ROL aZIF鄄8 在苛刻条件下的稳定性10。图 12摇 储藏时间对 ROL 和 ROL aZIF鄄8 酶活力的影响Fig.12摇 Effect of storage time on enzymatic activities of ROLand ROL aZIF鄄8摇2郾 5摇 ROL和 ROLaZIF鄄8 对 DBP 和 DIBP 水解能力的比较DBP 和 DIBP 是塑化剂的典型代表,具有较强的生殖毒性,即使微量摄入也会造成脂质代谢异常,诱发肥胖病,干扰免疫和过敏反应等59-60。利用生物酶法水解 DBP 和 DIBP 具有条件温和、效率高和不产生二次污染等优势59-60。为了进一步探究ROL aZIF鄄8 催化活性增强的效果,本研究比较了ROL 和 ROL aZIF鄄8 对 DBP 和 DIBP 的水解能力,分析结果见图 13。由图 13 可见,ROL aZIF鄄8 催化不同小写字母表示组间数据差异显著(P 0郾 05)。图 13摇 ROL 和 ROL aZIF鄄8 对 DBP 和 DIBP 的水解能力分析Fig.13摇 Hydrolytic capacities analysis of ROL andROL aZIF鄄8 on DBP and DIBPDBP 和 DIBP 水解 2h 后,DBP 和 DIBP 的残留量分别为 83郾 7%和 83郾 1%,而 ROL 催化水解 2 h 后,DBP 和 DIBP 的残留量分别90郾 8%和91郾 2%。这表74第 41 卷 第 6 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 芦瑜涵等:基于无定形沸石-咪唑框架鄄8 材料固定米根霉源脂肪酶研究明与 ROL 相比,ROL aZIF鄄8