PCR技术及其应用.ppt

申申 红红 基础医学教研室1.聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR无细胞的分子克隆法)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍.PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。2.基因基因基因基因组组组组DNADNADNADNA获获获获取特定取特定取特定取特定DNADNADNADNA片段片段片段片段扩扩扩扩增增增增特特特特定定定定D D D DN N N NA A A A片片片片段段段段3.生物生物生物生物样样样样品品品品DNADNA片段片段基基基基因因因因诊诊诊诊断断断断基基基基因因因因治治治治疗疗疗疗基基基基因因因因工工工工程程程程产产产产品品品品法法法法医医医医学学学学检检检检测测测测人人人人类类类类学学学学研研研研究究究究4.PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长5.PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物6.PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶7.PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发展都使克隆基因没有成为现实，所以，Khorana的设想被人们遗忘了8.PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）。基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制。最初采用E-coli DNA聚合酶I I 的的KlenowKlenow片段进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错。9.PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1988年 Saiki 等 从 水 生 嗜 热 杆 菌(Thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶，命名为Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪，使PCR技术得到了广泛应用1993年，Mullis因此项技术获诺贝尔化学奖10.PCR的基本原理PCR过程PCR反应条件PCR的特点 模拟DNA的体内复制过程,即利用DNA聚合酶在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成。PCR技术基本原理:类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：加热至93左右后，成为单链，与引物结合，作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物,在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环,变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。11.1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR过程PCR反应条件PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1-3步25-30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍12.变变性性（denaturationdenaturation）在在高高温温条条件件下下（90909595），双双链链模模板板DNADNA的的氢氢键键断断裂裂，解解链链成成两两条条单单链链DNADNA，提提供供复制的模板。复制的模板。13.变变性温度与性温度与时间时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因一般9394lmin足以使模板DNA变性若低于93则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。14.模板DNA9415.退火退火（annealingannealing）在在低低温温条条件件下下（4040 6565），使使加加入入的的引引物物与与单单链链DNA模模板板上上待待扩扩增增DNADNA区区域域的的两两个个侧侧翼翼准准确确地地配配对对结结合合，并并提提供供DNADNA复复制制起起始的始的3-OH3-OH。16.退火退火(复性复性)温度与温度与时间时间：退火温度退火温度是影响PCR特异性的重要因素退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55作为选择最适退火温度的起点较为理想17.PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物18.变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，而且引物的分子数远远多于模板DNA，故引物与模板DNA结合的机率远远高于DNA分子自身的复性。19.延伸（延伸（extensionextension）DNADNA聚聚合合酶酶在在适适当当温温度度（70707575）下下，以以dNTPdNTP为为原原料料，从从特特异异结结合合到到DNADNA模模板板上上的的引引物物3-OH3-OH端端开开始始，根根据据碱碱基基互互补补配配对对和和半半保保留留复复制制原原则则，进进行行DNADNA链链的的延延伸伸，合合成成与与模板互模板互补补的新的的新的DNADNA分子。分子。20.大大肠肠杆菌体内各聚合杆菌体内各聚合酶酶作用作用DNA DNA 聚合聚合酶酶 无无5353外切外切酶酶活性切除引物活性切除引物,是复制是复制时时的主要聚合的主要聚合酶酶；DNA DNA 聚合聚合酶酶 I:I:主要主要负责负责除去引物并利用脱氧核苷酸填除去引物并利用脱氧核苷酸填满满空隙；空隙；1.1.5353聚合聚合酶酶活性。活性。2.532.53外切外切酶酶活性活性切除引物。切除引物。3.353.35外切外切酶酶活性起校活性起校对对作用作用DNA DNA 聚合聚合酶酶 有有1 1和和3 3的作用，其他作用尚不清楚。的作用，其他作用尚不清楚。DNA DNA 聚合聚合酶酶和和 涉及涉及DNADNA错误错误修复。修复。21.延伸温度与延伸温度与时间时间：Taq DNA聚合聚合酶酶的生物学活性：的生物学活性：7080 150核苷酸核苷酸/S/酶酶分子分子 70 60核苷酸核苷酸/S/酶酶分子分子 55 24核苷酸核苷酸/S/酶酶分子分子22.延伸温度与延伸温度与时间时间：延伸温度：一般选择在7075之间常用温度为72过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）34kb的靶序列需34min扩增10Kb需延伸至15min延伸时间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些23.PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点70引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶24.PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束94第2轮开始25.PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点945072TaqTaqTaqTaq26.PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束27.PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增28.PCR产产物的物的积积累累规规律律DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数形式（2n）增加，随着目的DNA片段的积累，在引物模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期平台期，这种效应称平台效应。（25-30个循环）29.PCR的基本原理PCR过程PCR反应条件PCR的特点标标准的准的PCRPCR反反应应体系体系10扩扩增增缓缓冲液冲液 10ulMg2+1.5mmol/L4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5u 加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ul30.PCRPCR操作程序操作程序 向一微量离心管中依次加入缓冲液、Mg2+、dNTP、引物、DNA模板、Taq DNA聚合酶然后用双蒸水加到最佳体系。混匀后，离心数秒，使反应成分集于管底。加矿物油50100l于反应液表面（防蒸发）,置反应管于PCR仪上，设置程序，进行热循环。31.部分基因组DNAFig1.1 Genomic DNA extracted from blood of part sheep32.296bpMDRB1基因外显子PCR结果检测的电泳图33.琼脂糖凝胶电泳（1-2%）检测扩增酶切产物。34.1.DNA片段长度(核苷酸数)琼脂糖凝胶电泳的核苷酸数与凝胶的范围。DNA片段长度的检测（0.8%）PCR扩增产物检测（1.5%）。酶切片段检测（2-3.5%）。2.DNA片段长度(核苷酸数)丙烯酰胺 1Kb700bp 3.5(%)700b500b 5(%)500b200b 8(%)200b 12(%)35.PCRPCR反反应应五要素五要素引物（引物（primer）酶酶（Taq DNA polymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板模板（template）Mg2+（magnesium）36.1、引物、引物引物是引物是PCR特异性反特异性反应应的关的关键键PCR 产产物的特异性取决于引物与模板物的特异性取决于引物与模板DNA互互补补的程度的程度理理论论上，只要知道任何一段模板上，只要知道任何一段模板DNA序序列，就能按其列，就能按其设计设计互互补补的寡核苷酸的寡核苷酸链链做引做引物，用物，用 PCR就可将模板就可将模板DNA在体外大量在体外大量扩扩增增37.基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。引物设计的原则38.引物引物长长度：度：15-30bp，常用，常用20bp左右左右 引物的有效引物的有效长长度不能大于度不能大于 38 bp，否，否则则最适最适 延伸温度会超延伸温度会超过过TaqDNA聚合聚合酶酶的最适温度的最适温度 （74），不能保），不能保证证PCR扩扩增增产产物的特异性。物的特异性。引物引物扩扩增跨度：增跨度：以以500bp为为宜宜 特定条件下可特定条件下可扩扩增增长长至至10kb的片段的片段39.引物碱基：引物碱基：G+C含量以含量以40-60%为为宜宜 G+C太少太少扩扩增效果不佳，增效果不佳，G+C 过过多易出多易出现现非非 特异条特异条带带 ATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免5个以上的个以上的嘌嘌呤或呤或 嘧啶嘧啶核苷酸的成串排列，尤其核苷酸的成串排列，尤其3端不端不应应超超过过3 个个连续连续的的G或或C，因，因为这样为这样会使引物在会使引物在G+C富富 集区集区 引引发错误发错误延伸延伸避免引物内部出避免引物内部出现现二二级结级结构和构和引物引物间间互互补补 特特别别避免避免 3端的互端的互补补，否，否则则会形成引物二聚会形成引物二聚 体，体，产产生非特异性的生非特异性的扩扩增条增条带带 40.引物引物 3端的碱基要求端的碱基要求严严格配格配对对（不能做任何（不能做任何修修饰饰）特特别别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配碱基不配对对而而导导致致PCR失失败败引物引物5端可修端可修饰饰 引物引物5端限定着端限定着PCR产产物的物的长长度，但度，但对扩对扩增特增特 异性影响不大；引物异性影响不大；引物5端碱基可不与模板端碱基可不与模板DNA 互互补补而呈游离状而呈游离状态态；引物引物5端最多可加端最多可加10个碱个碱 基而基而对对PCR反反应应无影响无影响 41.引物的特异性：引物的特异性：引物引物应应与核酸序列数据与核酸序列数据库库的其它序列无明的其它序列无明显显同同源性源性引物量：引物量：每条引物的每条引物的浓浓度度0.1 0.5umol或或10 100 pmol以最低引物量以最低引物量产产生所需要的生所需要的结结果果为为好好 引物引物浓浓度偏高会引起度偏高会引起错错配和非特异性配和非特异性扩扩增，增，且可增加引物之且可增加引物之间间形成二聚体的机会形成二聚体的机会42.2、酶酶及其及其浓浓度度目前有两种目前有两种 Taq DNA 聚合聚合酶酶供供应应天然天然酶酶：从水生嗜：从水生嗜热热杆菌中提杆菌中提纯纯基因工程基因工程酶酶：大：大肠肠菌合成菌合成一个典型的一个典型的 PCR反反应约应约需需酶酶量量1-2.5U/100 ul体系体系浓浓度度过过高可引起非特异性高可引起非特异性扩扩增，增，浓浓度度过过低低则则合成合成产产物量减少物量减少43.DNADNA聚合聚合酶酶l KlenowKlenow片段片段 l T4 DNAT4 DNA聚合聚合酶酶 l TaqTaq DNA DNA聚合聚合酶酶（应应用最广）用最广）l 其他其他DNADNA聚合聚合酶酶：TthTth DNA DNA聚合聚合酶酶 VentVent DNA DNA聚合聚合酶酶 PfuPfu DNA DNA聚合聚合酶酶等等44.Taq DNA聚合聚合酶酶的特性的特性酶活性该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa。其比活性为200000单位/mg。7580时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70延伸率大于60个核苷酸/秒，55时为24个核苷酸/秒。温度过高(90以上)或过低(22)都可影响Taq DNA聚合酶的活性。45.热稳定性有良好的热稳定性，在92.5、95、97.5时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和56min后，仍可保持50%的活性。Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。46.离子依赖性 Taq DNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，对Mg2+浓度非常敏感。以活性程度很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.70.8mmol/L时，用不同浓度Mg2+进行 PCR反应10min，测定结果为MgCl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高，此浓度能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。Mg2+过高就抑制酶活性，当MgCl2浓度在 10mmol/L时可抑制4050%的酶活性。47.忠实性 1.TaqDNA聚合酶的功能？2.合成方向？3.为什么不是35？(再次磷酸化需能量)三种聚合酶只有2没有校正活性，TaqDNA聚合酶具有53聚合酶活性和53外切酶活性（切除引物），而无35外切活性(校正），因而，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能的。保真性不如Pfu DNA聚合酶等。Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.110-4。而DNA复制时109-1010才错配。48.3、dNTP 的的质质量与量与浓浓度度dNTP的的质质量与量与浓浓度和度和 PCR扩扩增效率有密增效率有密切关系切关系dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解49.1.在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量2.注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制）,如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低）,就会引起错配3.dNTP3.dNTP可与可与MgMg2+2+结结合，使游离的合，使游离的MgMg2+2+浓浓度下降度下降，影响影响DNADNA聚合聚合酶酶的活性的活性 50.4 4、模板、模板DNADNA模板DNA的来源：微生物中提取DNA 从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛 发、精斑、口腔上皮细胞 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 模板DNA的浓度：0.12ug/100ul体系 PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高 模板DNA浓度过高会导致非特异性产物增加。51.5 5、MgMg2+2+浓浓度度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响在一般的 PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。52.6 6、循循环环次数次数循环次数决定PCR扩增程度主要取决于模板DNA的浓度 选在3040次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多53.如何避免引物二聚体如何避免引物二聚体形成？（1）两种引物如果3端互补的话，便容易出现引物二聚体。通过引物设计可避免。（2）几种聚合酶（包括Taq DNA聚合酶）已被证明具有较弱的非模板指导的聚合作用，该作用可以将核苷酸添加到一条引物的3端，与另一条引物形成短的重叠。应用最低量的引物和酶来减少引物二聚体发生。54.如何提高如何提高PCRPCR过过程中的程中的DNADNA聚合聚合酶酶的保真性？的保真性？在PCR反应体系中，除使用Taq DNA聚合酶，掺入 少量的具有35外切酶活性的耐热DNA聚合 酶，如Pfu，Vent，Pwo等，错配率可降为原来的 1/10；使四种dNTP浓度相等；Mg2+浓度尽可能低，但不影响DNA合成；减少高温反应时间，这样DNA热损伤将减少；减少循环数;反应体系pH值在70时尽量低于6.0。55.如何提高如何提高PCRPCR扩扩增的特异性？增的特异性？升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性；缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及多余的DNA聚合酶分子参与酶促延伸的机会；降低引物和酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是能减少引物二聚体的引发；改变Mg2+的浓度可进一步提高扩增的特异性；56.引物设计的特异性；减少循环次数；热启动（Hot Start）。即首先将模板变性，然后在较高温度时加入Taq DNA聚合酶、引物及 MgCl2等一些重要成分，这样使得引物在较高温 度下与模板退火，提高了反应的严谨性，使扩 增更特异；采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来提高 扩增的特异性。57.PCR的类型和应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他58.PCR的类型和应用类类型：型：逆逆转录转录PCR 反向反向PCR巢式巢式PCR 标记标记PCR多重多重PCR 原位原位PCR不不对对称称PCR 定量定量PCR锚锚定定PCR 差异差异显显示示PCR长长PCR 免疫免疫PCRRACE RAPDPCR-FRLP PCR-SSCP59.1 1、RT-PCRRT-PCR及定量及定量RT-PCRRT-PCR（1 1）RT-PCRRT-PCR（reverse transcription-PCR）原原理理：先先在在逆逆转转录录酶酶的的作作用用下下、以以mRNAmRNA为为模模板板合合成成互互补补的的cDNAcDNA（complementary complementary DNADNA），再再以以cDNAcDNA为为模模板板进进行行PCRPCR反反应应，这这样样，低低丰丰度度的的mRNAmRNA得得以以扩扩增增放放大大。是是一一种种快快速速、简简便便、敏敏感感性性极极高高的的检检测测mRNAmRNA表达的方法。表达的方法。60.61.oligo（dT）一一般般指指的的是是多多个个T碱碱基基连连接接而而成成的的寡寡聚聚引引物物，其其长长度度有有多多种种，至至少少包包括括oligo d(T)10、oligo d(T)12、oligo d(T)14和和oligo d(T)16这这么么几几种种。最最好好15以以上上，否否则则效效率率有有所所降降低低，而而且且也也更更容容易易与与RNA中中的寡聚的寡聚A的位置的位置结结合而起始反合而起始反转转，使，使cDNA效率下降。效率下降。常用的两种逆常用的两种逆转录转录酶酶AMVAMV（avian myeloblastosis virus）：）：酶酶活性最适温度活性最适温度4242MMLVMMLV（Moloney murine leukemia virus）：酶酶活活性性最最适适温温度度373762.（2 2）定量）定量RT-PCRRT-PCR（QRT-PCRQRT-PCR）：）：通过过设立一定的RNA竞争性参考标准（RNA competitive reference standard,RNA-CRS)，利用RT-PCR对mRNA 水平进行半定量或绝对定量分析。63.半定量半定量RT-PCRRT-PCR 选选用在用在组织组织中普遍表达、表达量比中普遍表达、表达量比较较恒恒定的定的“管家管家”基因基因mRNAmRNA作作为为内源性基因模板内源性基因模板标标准。准。“管家管家”基因基因mRNAmRNA和目的和目的mRNAmRNA混合物混合物共同共同进进行逆行逆转录转录，在各自的引物引，在各自的引物引导导下共同下共同扩扩增。增。计计算出算出扩扩增后目的增后目的cDNA/“cDNA/“管家管家”基基因因cDNAcDNA的比的比值值，从而达到半定量的目的。，从而达到半定量的目的。64.65.半定量半定量RT-PCRRT-PCR的不足的不足由由于于管管家家基基因因的的mRNAmRNA与与靶靶基基因因使使用用不不同同的的引引物物，两两种种mRNAmRNA在在序序列列、大大小小及及二二级级结结构构上上可可能能亦亦存存在在较较大大的的差差异异，使使两两者者的的扩扩增增效效率率差差异异极极大大，从从而而影响定量的准确性；影响定量的准确性；不不同同来来源源的的组组织织或或细细胞胞的的mRNAmRNA可可能能有有着着不不同同的的逆逆转转录录效效率率，这这种种逆逆转转录录效效率率的的差差异异在在随随后后进进行行的的PCRPCR中被成百万倍地放大。中被成百万倍地放大。66.2 2、实时荧实时荧光光定量定量PCRPCR 荧光共振能量传递(FRET)：某荧光标记基团在激发光刺激下生成某波长的发射光，当另一屏蔽基团与其距离合适时，原发射光将会被屏蔽基团所吸收，并转化为其他波长的发射光或热能，称之为FRET。荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。67.荧光定量PCR仪比普通的PCR仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，实时荧光定量PCR仪主要是用来定量分析和确定基因转录水平的，而普通的PCR仪是做定性分析和扩增基因片段，定量PCR仪可以做普通PCR仪的工作，而反之就不行了，况且这样代价太大了，一般的实验室都不允许这样做的。总之两者的功能不能互相取代。常规定量PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量 重复性差 半定量实时定量PCR技术：对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量 68.实时荧光定量PCR原理在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。69.（1）Ct 值是荧光定量PCR技术的一个很重要的概念 C代表Cycle，t代表threshold。含义是：每个反应管内的荧光信号到达 设定的域值时所经历的循环数。70.（2）荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号荧光域值是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10 SDcycle 31571.Ct值的确定 72.相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图Ct值则极具重现性73.（3）Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。74.荧光定量标准曲线 75.特异性强：具有引物和探针的双重特异性重复性好：同一标本的Ct值相同敏感性高：可检测百万分之一个感染细胞或 病毒DNA分子线性范围广：定量的动态范围达5-6个数量 级，因而相差较大的DNA起始拷 贝数也不需稀释工作效率高：一次定量96个样品仅需1-2h 但仪器及配套试剂极其昂贵实时荧光定量PCR的特点76.用途 定量起始模板浓度 基因型分析 产物鉴定 单核苷酸多态性（SNPSNP）检测77.3 3、反向、反向PCRPCR（inverse PCRinverse PCR，IPCRIPCR）IPCR是对已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究的一种简捷方法。原原理理：用限制性内切酶消化DNA片段，然后用连接酶将酶切产物连接成环状，再用已知序列上两端相反方向的引物进行PCR。78.反反向向PCRPCR原原理理图图（A A和和B B分分别别为为限限制制性性内内切切酶酶位位点点P1P1、P2P2分分 别为别为引物；引物；黑色区域黑色区域为为已知序列；空白区域已知序列；空白区域为为未知序列）未知序列）79.反向反向PCRPCR成功要点成功要点 第第一一步步选选择择限限制制性性内内切切酶酶消消化化基基因因组组DNADNA模模板板时时，必必须须选选择择已已知知DNADNA上上无无该该酶酶切切位位点点的的限限制制性性内内切切酶酶，若若产产生粘性末端生粘性末端DNADNA片段片段则则更易于更易于环环化。化。限限制制性性内内切切酶酶消消化化后后产产生生的的DNADNA片片段段大大小小要要适适当当，太太短短（200200300bp300bp）则则不不能能环环化化，太太长长的的DNADNA片片段段则则受受PCRPCR本身本身扩扩增片段有效增片段有效长长度的限制。度的限制。80.4 4、原位、原位PCR(In-situ PCR)PCR(In-situ PCR)原位PCR是在组织细胞里进行PCR反应，它结 合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特 异敏感的PCR技术的优点。原位PCR是Hasse等于1990年建立的，实验用 的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细 胞、血细胞等。81.基本方法：基本方法：固定固定组织组织或或细细胞：多聚甲胞：多聚甲醛处醛处理理蛋白蛋白酶酶K K消化消化处处理理PCRPCR扩扩增：加增：加PCRPCR反反应应液在液在组织细组织细胞片上，覆胞片上覆 盖液体石蜡后，直接放在盖液体石蜡后，直接放在扩扩增增仪仪的金属板上的金属板上 进进行行PCRPCR循循环扩环扩增。有的基因增。有的基因扩扩增增仪带仪带有有专专 门门用于原位用于原位PCRPCR的装置。的装置。杂杂交：交：PCRPCR扩扩增增结结束后，用束后，用标记标记的寡核苷酸探的寡核苷酸探 针进针进行原位行原位杂杂交。交。显显微微镜观镜观察察结结果。果。82.人人类类染色体端粒染色体端粒DNA的的荧荧光原位光原位杂杂交照片交照片 83.原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值;其特异性和敏感性高于一般的PCR。84.5 5、巢式、巢式PCRPCR（nested PCRnested PCR，N-PCRN-PCR）由于扩增模板含量太低，为了提高检测灵敏度和特异性，采用改进过的PCR-RFLP方法即 N-PCR。N-PCR是设计两对引物，一对外引物（outer primer）对应的序列在模板的外侧，另一对内引物（inner primer）在同一模板的外引物的内侧，即外引物扩增产物较长，含有内引物扩增的靶序列，这样经过二次PCR放大将单拷贝的目的DNA片段检出。85.296bpM第二轮PCR检测结果第一轮PCR检测结果：没有目的条带出现。86.N-PCR的优点是：第一，克服了单次扩增“平台效应”的限制，使扩增倍数提高，从而极大地提高了PCR扩增的敏感性。第二，由于模板和引物的改变，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性。第三，内侧引物扩增的模板是外侧引物扩增的产物，第二阶段的反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定，因此可以保证整个反应的准确性及可行性。87.N-PCR的缺点是：进行二次PCR扩增引起交叉污染的几率大。我们为了克服此缺点，可采用同一反应管中巢式PCR（one-tube nested PCR）,主要利用内外引物Tm值不同。外引物Tm高，内引物Tm低，PCR反应开始的若干轮循环采用较高的退火温度，内引物由于Tm值低，高温下无法与模板结合不能延伸，而外引物可与模板退火延伸，再采用较低的退火温度进行后面的循环，内引物则可与模板退火延伸，这样实际上进行了二次扩增，但只进行一次操作，可减少交叉污染的机会。可采用同一反应管巢式PCR，主要利用内外引物的Tm值不同。外引物的退火温度高于内引物退火温度。进行两次PCR扩增，一次操作，可减少交叉污染机会。88.PCR反应是一个复杂的生物化学反应体系，各成分之间存在着动态的相互作用，每一个条件的改变都会影响到整个PCR的效果，因此在实验过程中对反应条件应做综合的考虑。进行一系列的巢式PCR反应体系优化，通过Mg2+浓度、引物浓度、退火温度的梯度比较选择，来确定实验的最佳反应体系。89.6 6、不、不对对称称PCRPCR（asymmetric PCRasymmetric PCR）不不对对称称PCRPCR的目的是的目的是扩扩增增产产生特异生特异长长度度的的单链单链DNADNA。此法。此法产产生的生的单链单链DNADNA可用作可用作杂杂交探交探针针或或DNADNA测测序的模板。序的模板。90.用一对不等量的引物，这对引物分别称为非限制引物(高浓度引物)与限制性引物(低浓度引物)，其比例一般为501001.在PCR反应的最初1015个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA。91.高浓度引物低浓度引物92.不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双链DNA，然后以此双链DNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备单链DNA。93.7 7、多重、多重PCR(multiple PCR)PCR(multiple PCR)多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增一份DNA样品中的不同序列。用于检测特定基因序列的存在或缺失。94.多重PCR电电电电泳泳泳泳引物引物95.8、标记PCR（Labelled primers，LP-PCR)利用同位素、荧光素等对引物进行标记，用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分病毒病毒1 1 病毒病毒2 2 病毒病毒 3 3 病毒病毒4 496.标记标记标记标记引物引物引物引物观观察察PCRPCR产产物物97.9、锚定PCR已知靶基因片段两测的序列 98.VHVHCH1CH1CH1CH1CH2CH2CH2CH2CH3CH3CH3CH3VHVHVLVLVLVLCLCLCLCL99.cDNAcDNA末端核酸末端核酸转转移移酶酶3GGGG3GGGG5 5 CCCC CCCC 锚锚定引物定引物3GGGG3GGGG5 5 CCCCCCCC3GGGG3GGGGCCCCCCCC100.1010、快速快速扩扩增增cDNAcDNA末端末端 （rapid amplification of cDNA ends，RACE）RACE是一种由已知的部分cDNA序列来快速获得完整cDNA 5或3末端的PCR技术。101.原理：原理：首先从已知的部分cDNA序列选择3和5端方向的引物，两种引物分别与3或5端寡聚dT引物组合扩增3或5端cDNA，最后从两个有相互重叠的3或5端RACE产物来获得全长cDNA序列。102.103.1111、mRNAmRNA差差异异显显示示逆逆转转录录PCRPCR（mRNA mRNA differential differential display display RT-PCRRT-PCR，DDRT-PCRDDRT-PCR）DDRT-PCRDDRT-PCR是是目目前前筛筛选选差差异异表表达达未未知知基基因因的的有效方法之一。有效方法之一。104.原理：原理：利利用用真真核核细细胞胞mRNAmRNA均均含含polypoly（A A）末末端端的的特特点点，把把33端端引引物物设设计计成成T T1212MNMN（M=AM=A，C C或或G G，N=AN=A，G G，C C或或T T），共共1212条条，与与mRNA mRNA 33端端poly poly A A结结合合，进进行行逆逆转转录录，形形成成mRNA:cDNAmRNA:cDNA杂杂交交分分子子，55端端采采用用2020条条随随机机引引物物，与与锚锚定定引引物物一一起起进进行行PCRPCR扩扩增增，通通过过比比较较实实验验与与对对照照样样本本mRNAmRNA表表达达谱谱，差差异异表表达达的的基基因因会会全全部部呈呈现现出出来来。回回收克隆收克隆鉴鉴定差异条定差异条带带。105.优优点点 此此法法是是一一种种简简便便、灵灵敏敏、高高效效、快快速速筛选筛选差异表达未知基因差异表达未知基因方法。方法。缺点缺点 具有具有较较高高频频率的假阳性和短小的差异率的假阳性和短小的差异片段等缺点片段等缺点，从而限制了此方法的广泛，从而限制了此方法的广泛应应用。用。106.107.1212、代代表表性性差差示示分分析析（representational representational difference analysis,RDAdifference analysis,RDA）RDARDA是是一一种种新新的的依依赖赖PCRPCR技技术术的的有有效效地地筛筛选选和和克克隆差异表达基因的方法。隆差异表达基因的方法。108.109.1313、PCR-SSCPPCR-SSCP（PCR-single strand conformation polymorphism）分析）分析PCRPCR产产物物单单链链构构象象多多态态性性分分析析是是一一种种适适合合大大样样本本筛查筛查基因突基因突变变的分析方法。的分析方法。110.PCR-SSCPP