基于转录组测序探究地塞米松在前体脂肪细胞成脂分化过程中的作用机制.pdf

-88-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期基于转录组测序探究地塞米松在前体脂肪细胞成脂分化过程中的作用机制杨 涛1,2，周佳伟2，张 宇2，徐 忠2，吴俊静2，乔 木2，冯 越2，李梓芃2，彭先文2，周焕焕1，陈洪波1，徐 珂1*，梅书棋2*（1.武汉轻工大学动物科学与营养工程学院湖北省家畜种业技术创新中心，湖北武汉 430023；2.动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，湖北武汉 430064）摘 要：试验旨在研究地塞米松（DEX）在前体脂肪细胞成脂分化过程中的作用机制，为后续体外研究猪肌内脂肪（IMF）沉积的调控机制奠定前期基础。试验分别使用 DEX 及常用成脂诱导剂 MDI（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 0.5 mmol/L、地塞米松 1 mol/L、胰岛素 10 g/mL）处理 3T3-L1 细胞，利用 GO Term 和 KEGG PATHWAY 对差异基因进行功能及信号通路分析。结果发现：相比阴性对照组，MDI 组和 DEX 组分别筛选到2 280 个、1 188 个差异表达基因，差异基因富集到血管相关平滑肌收缩、脂质生物合成、脂肪细胞分化等生物学过程；对 2 处理组间的差异基因集进行 Venn 分析，获得 779 个共有差异表达基因，其中上下调模式一致的差异表达基因 751 个，且显著富集到脂肪细胞分化、脂肪酸代谢过程和 PPAR 信号通路等。本研究鉴定出通过 DEX 诱导前体脂肪细胞成脂分化过程的关键基因Selenbp1、Arid5b、Rgs2、Metrnl、Acsl6、Hmgcs1等。关键词：成脂分化；地塞米松；转录组测序；信号通路；猪中图分类号：S828.2 文献标识码：A DOI 编号：10.19556/j.0258-7033.20230630-05肌内脂肪（IMF）含量是猪重要经济性状，直接影响猪肉口感和风味1。IMF 的发育起始于胚胎形成期，在猪妊娠后 3 个月，间充质干细胞就开始向脂肪前体细胞进行分化，这一过程一直持续到仔猪的生长早期，直至脂肪前体细胞数量不再增加，最后脂肪前体细胞成脂分化为成熟脂肪细胞2。研究发现，使用含地塞米松（DEX）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、胰岛素（INS）的成脂诱导剂处理大鼠骨髓间充质干细胞后可使其分化形成脂滴3。成脂分化是一个受到一系列基因和信号通路调节的复杂过程，IMF 前体细胞的成脂分化直接影响 IMF 生成，而其分子机制仍待阐明。通过体外培养前体脂肪细胞不仅能完整地认识脂肪细胞的整个分化过程，还能够直接研究各个因素对成脂分化过程的调控。“鸡尾酒”法是一种常见的对体外前体脂肪细胞进行诱导分化的方法，其中包含了 IBMX、DEX、INS 3 种诱导因子4。DEX 是一种人工合成的糖皮质激素。在生理条件下，糖皮质激素对机体有多种作用，包括葡萄糖稳态、调节炎症反应和调节脂肪组织等功能5-7。目前 DEX 影响前体脂肪细胞分化的调控网络少见报道。转录组测序技术可以综合分析组织或细胞的所有转录本在不同物种、品种、发育阶段和不同处理条件下的种类、结构和表达水平的变化，揭示特定生物过程的分子调控机制8。本研究利用转录组测序筛选出 DEX 诱导前体脂肪细胞分化的目标基因集，通过 GO 与 KEGG富集分析探究 DEX 影响细胞成脂分化过程的信号通路及候选基因。1 材料与方法1.1 细胞培养 小鼠胚胎成纤维细胞（3T3-L1）购于中收稿日期：2023-06-30；修回日期：2023-07-14资助项目：国家自然科学基金项目（32102527）；动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室开放课题（KLAEMB-2023-01）；国家重点研发计划项目（2022YFF1001300）；湖北省重点研发项目（2022BBA0018）作者简介：杨涛（1997-），男，河南信阳人，硕士研究生，主要从事猪遗传育种研究，E-mail：*通讯作者：梅书棋（1971-），男，湖北武穴人，硕士，二级研究员，主要从事猪遗传育种研究，E-mail：；徐珂（1993-），女，安徽安庆人，博士，讲师，主要从事动物遗传育种研究，E-mail：-89-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 国科学院昆明细胞库，细胞用含 10%NBS（26010074，Gibco）的 DMEM（11960-044，Gibco）高糖培养基于37、5%CO2恒温培养箱中培养。1.2 实验分组与诱导分化 将 3T3-L1 细胞分 3 组进行培养，待细胞汇合完全时开始诱导分化处理：MDI组，加入含 0.5 mmol/L IBMX、1 mol/L DEX 和 10 g/mL INS、10%FBS 的 DMEM 高糖培养基诱导 48 h；DEX组，加入含 1 mol/L DEX、10%FBS 的 DMEM 高糖培养基诱导 48 h；Control 组，加入含 10%FBS 的 DMEM高糖培养基诱导 48 h。1.3 总 RNA 提取 取 3 组不同处理的细胞使用 Omega Bio-tek 公司 E.Z.N.A.HP Total RNA Kit 试剂盒提取细胞总 RNA（按照说明书进行操作）。使用 1%琼脂糖电泳检测 RNA 质量，然后使用 Nanodrop 2000 分光光度计测定浓度。1.4 转录组测序 RNA 文库制备以及测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。cDNA 文库的构建方法 参 照 美 国 Illumina 生 物 技 术 公 司 的 TruseqTM RNA sample prep Kit 建 库 试 剂 盒 说 明 书，利 用 Illumina NovaSeq6000 高通量测序平台对文库进行测序，并对原始测序数据进行过滤，得到高质量的 Clean Data。随后将样品的原始测序数据进行质控，去除接头、剪切末端低质量碱基等，利用 HiSat2 将质控后的序列（Clean Data）与指定的参考基因组进行比对，获得用于后续转录本组装、表达量计算等分析的 mapped data（Reads）。1.5 测序结果处理及分析 基于表达量定量结果，使用 DESeq2 软件进行组间差异基因分析，筛选阈值为|log2F|1 且P-adjust0.05。采用 Goatools（https:/ GO 富集分析。KOBAS（http:/ PATHWAY 富集分析。2 结 果2.1 细胞诱导分化 3T3-L1 细胞经过 2 种不同的处理诱导培养 2 d 后细胞形态上均有不同程度的变化。MDI 组细胞在诱导 2 d 后细胞变大变圆，DEX 组细胞也有相应变化，但从整体上来说比 MDI 组变化小（图 1）。2.2 测序数据质量控制 为保证转录组测序的准确性，分析前经过严格的质量控制，对原始数据进行过滤和筛选，去除了低质量的数据信息，同时检测了测序错误率及 GC 碱基含量分布，数据汇总见表 1。9 组样品，碱基质量值大于 20（Q20）和 30（Q30）的碱基占总体碱基比例分别介于 98.25%98.45%和 94.74%95.26%，碱基错误率在 0.024%左右，表明测序结果较好。通过样本间 PCA 分析显示，每组样本都有很清晰的聚类（图2），这表明生物学重复可靠。2.3 差异表达基因筛选 如图 3A 所示，MDI 处理组相比较于对照组共有 2 280 个差异表达基因，其中 904 个基因上调，1 376 个基因下调。如图 3B 所示，DEX 处理组相比较于对照组共有 1 188 个差异表达基因，其中683 个基因上调，505 个基因下调。组中成脂标记基因图 2 样本间 PCA 分析表 1 测序结果及质量控制图 1 3T3-L1 前脂肪细胞不同诱导处理 2 d 的形态（20）MDI DEX样本原始数据有效数据碱基错误率,%Q20,%Q30,%GC 含量,%NC167370690669371620.024198.3895.0650.51NC282008972814752800.024198.3895.1150.85NC353524076531511600.024298.3394.9151.28DEX169191868686661620.024498.2594.7550.91DEX264236040637670100.024498.2594.7451.01DEX373793912731979420.024198.3795.0651.31MDI167803582673456060.024198.3895.0650.27MDI268022002675738440.024198.3995.1150.02MDI374479508739727620.023998.4595.2650.26PCA analyslsDEX3DEX1DEX2NC2MDI2MDI1MDI3NC3NC1ControlDEXMDIPC2（20.66%）PC1（44.20%）121086420-2-4-6-14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16-90-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期Ppar、Fabp4都极显著上调。2.4 GO 功能富集分析 如图 4A 显示，MDI 处理组显著富集的生物学过程有血管相关平滑肌收缩、脂质生物合成过程的正调控、上皮细胞分化的调控等，差异基因也显著富集在脂肪细胞分化、长链脂肪酸辅酶 A 连接酶活性和脂肪酸生物合成等生物学过程。如图 4B 所示，DEX 处理组显著富集的生物学过程有嘌呤类化合物分解过程、血管相关平滑肌收缩、肌肉系统过程、脂肪细胞分化等，也显著富集在脂肪细胞分化的调节、脂肪酸代谢过程等与脂肪生成相关的生物学过程。2.5 KEGG 通路富集分析 如图 5A 所示，MDI 诱导后差异基因显著富集到癌症通路、钙信号通路、MAPK 信号通路、JAK-STAT 信号通路等。如图 5B 所示，DEX诱导后差异基因显著富集的代谢通路有钙信号通路、趋化因子信号通路、cAMP 信号通路、调节脂肪细胞脂肪分解、嘌呤代谢、醚脂代谢等。2.6 差异基因集 Venn 分析 为深入探究 DEX 在 MDI成脂诱导分化过程中的作用，对 DEX 和 MDI 相对处理组的差异基因集进行了 Venn 分析。如图 6 所示，2 个差异基因集之间共有 779 个差异表达基因，其中上下调趋势相同的基因 751 个。这表明 DEX 在诱导 3T3-L1前脂肪细胞分化过程中的功能主要是通过调控这 751 个基因的目标基因集来实现。2.7 目标基因集功能富集分析 对目标基因集进行 GO功能富集分析，发现目标基因集显著富集到脂肪细胞分化、脂肪细胞分化的调节、脂肪酸代谢等与成脂分化相关的生物学过程（表 2）。对目标基因进行 KEGG 通路分析发现，目标基因集显著富集到类固醇生物合成、PPAR 信号通路、甘油磷脂代谢等成脂分化相关的信号通路（表 3）。3 讨 论猪肌内前体脂肪细胞的分化与 IMF 含量直接相关，体外前体脂肪细胞的培养是研究其脂肪分化的重要手段，虽 DEX 作为体外诱导前体脂肪细胞成脂分化的常用物质，但其作用网络机制报道不全。本研究使用MDI、DEX、10%FBS 培养基同时诱导 3T3-L1 细胞，通过转录组测序发现 MDI 处理细胞后有 904 个基因上调，1 376 个基因下调，DEX 处理细胞后有 683 个基因上调，505 个基因下调，其中均包括Ppar、Fabp4等成脂分化标记基因。GO 功能富集分析发现，差异基因主要富集到血管相关平滑肌收缩、脂质生物合成过程、细胞分化等生物学过程。KEGG 通路分析富集到 MAPK信号通路、JAK-STAT 信号通路、cAMP 信号通路。以上信号通路也均在成脂分化过程中发挥关键作用9-11。本研究进一步对 2 个处理的差异基因集进行 Venn分析，从共有 779 个差异表达基因中筛选出上下调趋势相同的基因 751 个。推测 DEX 主要是通过作用这751 个基因来影响前体脂肪细胞的分化。通过 GO 富集发现 12 个基因显著富集在脂肪细胞分化、脂肪细胞分化的调节、脂肪酸代谢等成脂分化相关生物学过程，在脂肪细胞分化生物学过程中富集到 12 个基因，其中Selenbp1、Fabp4、Bnip3、Arl4a、Arid5b、Rgs2、Lrg1、Wfdc21基因上调，Metrnl、Atf5、Ptgs2、Lamb3基因下调。研究表明，SELENBP1 是成熟脂肪细胞的标志物12。敲除Selenbp1可通过调控Ppar影响小鼠图 3 差异基因火山图ABControl_vs_DEX.volcanoControl_vs_MDI.volcano-Log10（Padjunst）-Log10（Padjunst）350300250200150100500300280260240220200180160140120100806040200SignificantSignificantup(904)nosig(53136)down(1376)up(683)nosig(54228)down(505)-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12Log2FCLog2FC-91-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 图 4 GO 功能富集分析柱形图ABGO enrichment analysis(Control_vs_MDI_all_1)GO enrichment analysis(Control_vs_DEX_all_1)Number of genesNumber of genes0 5 10 15 20 25 30 350 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30-log10(Padjust)Number-log10(Padjust)NumberGO termGO termvascular associated smooth muscle contractionnegative regulation of extrinsic apoptotic signaling p.detection of molecule of bacterial origincell adhesion mediated by integrinregulation of epithelial cell apoptotic processnegative regulation of Nlotch signaling pathwayregulation of vascular associated smooth muscie celL.response to vitaminregulation of smooth muscle cell migrationpositive regulation of lipid biosynthetic processresponse to cAMP negative regulation of blood vessel diameterartery smooth muscle contractionregulation of epithelial cell differentiationnegative regulation of cellular response to growth fa.positive regulation of cell-substrate adhesionregulation of Rho protein signal transduction regulation of release of sequestered calcium ion into.Rho protein signal transduction regulation of Notch signaling pathwaychondrocyte morphogenesis involved in endocho.growth plate cartilage morphogenesisgrowth plate cartilage chondrocyte morphogenesischondrocyte morphogenesis cartilage morphogenesisacute-phase responseacute inflammatory responsepositive regulation of ossificationpurine-containing compound catabolic processcell adhesion mediated by integrinartery smooth muscle contraction vascular associated smooth muscle contractionleukocyte migrationhomophilic cell adhesion via plasma membrane a.cellular response to transforming growth factor be.muscle system processfat cell differentiation-vasoconstrictionnegative regulation of blood vessel diameterintegrin-mediated signaling pathway 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.50 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5-Log10（Padjunst）-Log10（Padjunst）-92-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期图 5 GO 功能富集分析气泡图AB图 6 差异基因集 Venn 分析图vennControl_vs_DEX_all_1409(15.21%)779(28.97%)1501(55.82%)Control_vs_MDI_all_1肾脏细胞的脂质代谢13。抑制Selenbp1降低了 3T3-L1细胞内硫化氢水平，抑制了半胱硫氨酸g-裂解酶（CSE）、半胱硫氨酸 b-合成酶（CBS）和 3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-MST）的表达，并显著抑制了脂肪细胞的分化14。Arid5b的敲除显著抑制了 3T3-L1 细胞的成脂分化15。还有研究发现，ARID5B的表达水平与猪背膘厚、IMF含量呈显著负相关，ARID5B可能是改善脂肪沉积性状及肉品质的重要候选基因16。敲除Rgs2基因的小鼠在高脂肪饮食中表现出脂肪增加的减少17。小鼠脂肪组织特异性敲除Metrnl会加重高脂饮食诱导的高甘油三KEGG enrichment analysis(Control_vs_MDI_all_1)KEGG enrichment analysis(Control_vs_DEX_all_1)KEGG pathwayKEGG pathwayPathways in cancerCalcium signaling pathwayECM-receptor interactionComplement and coagulation cascadesMicroRNAs in cancerFocal adhesionCytokine-cytokine receptor interactionPI3K-Akt signaling pathwayGlutathione metabolismMAPK signaling pathwway Viral protein interaction with cytokine and cyto.AGE-RAGE signaling pathway in diabetic co.Drug metabolism-cytochrome P450Circadian entrainment NF-kappa B signaling pathway Hypertrophic cardiomyopathyMetabolic pathwaysVascular smooth muscle contractionProteoglycans in cancer JAK-STAT signaling pathway-0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2 0.22 0.24 0.26 0.28-0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2 0.22Rich FactorRich FactorECM-receptor interactionDilated cardiomyopathyCalcium signaling pathwayViral protein interaction with cytokine and cyto.Cytokine-cytokine receptor interactionHypertrophic cardiomyopathyPathways in cancer Chemokine signaling pathwaycAMP signaling pathway Protein digestion and absorption Regulation oflipolysis in adipocytesPurine metabolism Complement and coagulation cascadesFocal adhesion Vascular smooth muscle contractionMetabolic pathwaysGlutathione metabolism Transcriptional misregulation in cancerTNF signaling pathwayIL-17 signaling pathwayPadjustPadjust0.01000.008000.006000.004000.002000.000.01000.008000.006000.004000.002000.001772127183114375108NumberNumber-93-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 酯血症18。利用 KEGG 通路富集分析，7 个基因显著富集到了PPAR 信号通路，其中Fabp4、Ppar、Rxra、Acsl6、Sorbs1基因上调，Slc27a6、Hmgcs1基因下调。PPAR在肪细胞分化起始时期起到不可或缺的作用，当PPAR存在时转录调控因子才能起始脂肪分化过程19-20。研究发现，在 3T3-L1 细胞中过表达和抑止Fabp4的表达会促进和抑止脂肪细胞的分化21。FABP4基因启动子活性能被 PPAR 应答元件增强，使其表达量升高，说明PPAR对FABP4具有调控作用22。骨骼肌 ACSL6 蛋白丰度与小鼠肌内脂质含量呈正相关23。HMGCS1 是酮体生物合成的重要控制酶，酮体生成是肝脏输出脂肪酸类能源的一种形式，HMGCS1基因可以调控猪肌肉发育过程中肌内脂肪的沉积，是影响猪肉质品质的一个潜在基因24。4 结 论本研究发现，与对照组相比，MDI、DEX 处理3T3-L1 细胞后分别鉴定到 2 280、1 188 个差异表达基因；Venn分析发现751个基因在2个处理组上下调一致，且主要富集到成脂分化生物学过程和 PPAR 信号通路等，获得Selenbp1、Arid5b、Rgs2、Metrnl、Acsl6和Hmgcs1等多个影响成脂分化的候选基因。解析 DEX调控成脂分化的分子机制，可为研究猪 IMF 沉积的调控机制奠定前期基础。参考文献：1 Fortin A,Robertson W M,Tong A K.The eating quality of Canadian pork and its relationship with intramuscular fatJ.Meat Sci,2005,69(2):297-305.2 Wang B,Yang Q,Harris C L,et al.Nutrigenomic regulation of adipose tissue development-role of retinoic acid:A reviewJ.Meat Sci,2016,120:100-106.3 Sobh M A.Adipogenesis of Sprague Dawely rats mesenchymal stem cells:a morphological,immunophenotyping and gene expression follow-up studyJ.Anat Cell Biol,2014,47(2):83-90.4 Ruiz-Ojeda FJ,Ruprez AI,Gomez-Llorente C,et al.Cell models and their application for studying adipogenic diffe-rentiation in relation to obesity:A ReviewJ.Int J Mol Sci,2016,17(7):1040.5 Crdenas G,Torres-Garca D,Cervantes-Torres J,et 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process8.46E-0519Edn2、Akr1c14、Fabp4、Abhd2、Slc27a6、Aig1、Tnxa、Elovl6、Pla2g15、Akr1c18、Gsta1、Hacd4、Slc25a17、Acsl6、Cyp2f2、Mgll、Cyp4f40、Lpin1、Sphk1N-acetylglucosamine-6-sulfatase activity0.00102Sulf2、Sulf1long-chain fatty acid-CoA ligase activity0.00193Acsl6、Slc27a6、Slc27a3unsaturated fatty acid metabolic process0.00428Akr1c14、Edn2、Elovl6、Mgll、Akr1c18、Gsta1、Cyp2f2、Sphk1fatty acid derivative metabolic process0.00489Akr1c14、Edn2、Elovl6、Mgll、Akr1c18、Gsta1、Acsl6、Cyp2f2、Sphk1fatty acid ligase activity0.00653Acsl6、Slc27a6、Slc27a3通路名称P值基因数基因名Steroid biosynthesis0.00404Msmo1、Cyp51、Sgle、Dhcr24PPAR signaling pathway0.02727Pparg、Fabp4、Slc27a6、Hmgcs1、Rxra、Acsl6、Sorbs1Glycerophospholipid metabolism0.04727Pld1、Pla2g2a、Pla2g15、Lpcat2、Agpat4、Plpp5、Lpin1-94-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期2011,60(11):1500-1510.8 孙菁希,逄世龙,孙敬春,等.基于转录组测序鉴定猪肌内脂肪沉积相关生物学通路及候选基因 J.中国畜牧兽医,2021,48(12):4508-4519.9 苏健,苏恒.脂肪细胞分化过程中 MAPK 信号通路的调控机制 J.生命的化学,2016,36(2):252-256.10 Zhang K,Guo W,Yang Y,et al.JAK2/STAT3 pathway is 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