菌种的管理和保藏.ppt

菌种的保藏和管理菌种的保藏和管理杜平杜平华华2024/5/212024/5/21周二周二1 1.菌种保藏的重要性菌种保藏的重要性 菌菌种保藏是微生物学种保藏是微生物学检验检验工作中的一工作中的一项项常常规规技技 术术，菌种的科学保藏和管理直接关系到，菌种的科学保藏和管理直接关系到检验结检验结 果的正确性。果的正确性。2024/5/212024/5/21周二周二2 2.菌种的来源菌种的来源国内或国外认可的菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所 有相关特性等效的商业派生菌株。2024/5/212024/5/21周二周二3 3.-广泛收集各种有用的微生物菌种。-选择最适宜的保藏方法。菌种保藏的中心任菌种保藏的中心任务务2024/5/212024/5/21周二周二4 4.常用菌种保藏方法常用菌种保藏方法 菌种保藏的原菌种保藏的原则则 根据微生物菌种的生理、生化特性根据微生物菌种的生理、生化特性 降低微生物降低微生物细细胞的代胞的代谢强谢强度。度。2024/5/212024/5/21周二周二5 5.标标准准菌菌株株的的复复活活或或培培养养物物的的制制备备应应按按供供应应商商提提供供的的说说明明或按或按验证验证的方法的方法进进行。行。标标准准储储备备菌菌株株-从从国国内内、外外菌菌种种收收藏藏机机构构获获得得的的标标准准菌菌株株经经复活并在适宜的培养基中生复活并在适宜的培养基中生长长后后,既既为标为标准准储备储备菌株。菌株。菌种的保藏菌种的保藏2024/5/212024/5/21周二周二6 6.菌种的保藏菌种的保藏 抑制微生物的代抑制微生物的代谢谢和生和生长长繁殖，繁殖，如低温、干燥和真空等如低温、干燥和真空等 标标准准储备储备菌株菌株经纯经纯度和特性确度和特性确认认后，分装于小瓶中后，分装于小瓶中,可采用低温冷可采用低温冷冻冻干燥，液氮干燥，液氮储储存，超低温冷存，超低温冷冻冻(低低 于于-70)-70)等方法保存。等方法保存。2024/5/212024/5/21周二周二7 7.菌种的保藏菌种的保藏低于-70-70或低温冷或低温冷冻冻干燥可以延干燥可以延长长菌种的保存菌种的保存时间时间.标标准准储备储备菌株可用于制菌株可用于制备备每月或每周一次每月或每周一次转转种的种的工作工作 菌株菌株。冷冷冻冻菌株一旦解菌株一旦解冻转冻转种制种制备备工作菌株后工作菌株后,不得重新冷不得重新冷冻冻 或再次使用。或再次使用。2024/5/212024/5/21周二周二8 8.菌种的保藏菌种的保藏工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株。2024/5/212024/5/21周二周二9 9.菌种的保藏菌种的保藏 不同的微生物，不同的微生物，应应根据其生物特征来根据其生物特征来选择选择最适宜的最适宜的 保藏方法，菌种的保藏方法一般分四个保藏方法，菌种的保藏方法一般分四个阶阶段：段：2024/5/212024/5/21周二周二1010.挑挑选选特征典型的特征典型的纯纯菌菌落。菌菌落。确确定定保保藏藏的的合合适适菌菌体体形形态态，孢孢子子和和芽芽孢孢死死亡亡代代谢谢作作用用弱弱，同同时时对对恶恶劣劣环环境境 有有很很强强的抵抗力。的抵抗力。选择选择最适宜的方法。最适宜的方法。定期定期对对保藏的菌种保藏的菌种进进行行鉴鉴定，确定保定，确定保藏方法的有效性。藏方法的有效性。菌种的保藏菌种的保藏2024/5/212024/5/21周二周二1111.方法方法方法方法主要原理主要原理主要原理主要原理 适用的微生物适用的微生物适用的微生物适用的微生物保藏保藏保藏保藏时间时间 特点特点特点特点 液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法 超低温超低温广泛广泛数十年数十年复复杂、需要、需要专门设备，有效，有效冷冷冻真空干燥保藏法真空干燥保藏法 干燥、缺氧、低温干燥、缺氧、低温 广泛广泛5 51010年以上年以上复复杂、需要、需要专门设备和方法，有效和方法，有效干燥（沙土、牛奶）保藏法干燥（沙土、牛奶）保藏法 干燥、无干燥、无营养养 产孢微生物微生物1 11010年年较简便，需制便，需制备沙土管，有效沙土管，有效液体石蜡保藏法液体石蜡保藏法低温、缺氧低温、缺氧广泛广泛1 1年以上年以上简便便琼脂斜面低温保藏法脂斜面低温保藏法 低温低温 4 4 广泛广泛短短时间简便便液体冷液体冷冻保藏保藏法法 液体培养基液体培养基 低温低温 广泛广泛半年以上半年以上简便便一定比例甘油一定比例甘油 低温、缺氧低温、缺氧 广泛广泛数十年以上数十年以上简便便瓷珠冷瓷珠冷冻保藏法保藏法 低温低温 广泛广泛1 1年以上年以上简便便菌种的保藏菌种的保藏2024/5/212024/5/21周二周二1212.琼琼脂斜面低温保藏法脂斜面低温保藏法 菌种菌种培养基培养基保存温度保存温度传接接时间细菌菌一般一般为营养养琼脂斜面培养基，或根据脂斜面培养基，或根据菌种菌种规定定选用培养基用培养基4 466芽芽孢菌菌3 36 6个月，其他个月，其他细菌菌约1 1个月个月酵母菌酵母菌霉菌霉菌琼脂或酵母浸出粉脂或酵母浸出粉胨葡萄糖葡萄糖琼脂脂斜面培养基斜面培养基4 466一般一般3 36 6个月个月真菌真菌PDAPDA琼脂或改良脂或改良马丁丁琼脂斜面培养基脂斜面培养基4 466一般一般3 36 6个月个月2024/5/212024/5/21周二周二1313.液体冷液体冷冻冻保藏法保藏法菌种菌种菌种菌种保存液（保存液（保存液（保存液（2mL2mL2mL2mL）保存温度保存温度保存温度保存温度 保存保存保存保存时间时间 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌营营养肉养肉养肉养肉汤汤1%1%蛋白蛋白蛋白蛋白胨胨甘油甘油甘油甘油水水水水 10%10%10%10%40%40%40%40%甘油甘油甘油甘油-30-30-30-30 -80-80-80-80 半年以上半年以上半年以上半年以上或数十年或数十年或数十年或数十年 枯草芽枯草芽枯草芽枯草芽孢孢杆菌杆菌杆菌杆菌大大大大肠肠埃希菌埃希菌埃希菌埃希菌胆胆胆胆盐盐乳糖增菌液乳糖增菌液乳糖增菌液乳糖增菌液乙型副乙型副乙型副乙型副伤伤寒沙寒沙寒沙寒沙门门菌菌菌菌铜绿铜绿假假假假单孢单孢杆菌杆菌杆菌杆菌生生生生孢孢梭菌梭菌梭菌梭菌疱肉培养基疱肉培养基疱肉培养基疱肉培养基白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌 改良改良改良改良马马丁培养丁培养丁培养丁培养基基基基黑曲霉黑曲霉黑曲霉黑曲霉2024/5/212024/5/21周二周二1414.液体冷液体冷冻冻保藏法保藏法 制制备备方法方法1%1%蛋白蛋白胨胨1.5ml1.5ml加入加入甘油甘油0.15ml0.15ml,接种接种新鲜培养物,培养.保存条件-80可保存数年.2024/5/212024/5/21周二周二1515.瓷珠菌种保存瓷珠菌种保存使用方法-用接种环挑取18-24小时新鲜培养物接入冻存液中-拧紧瓶盖，来回颠倒制成均匀的菌悬液-使菌悬液充分吸附在小瓷珠内外表面-将冻存管中的菌悬液吸出-使用时充分摇匀使管内瓷珠分散,取出小瓷珠，可以直接在平板培养基上划线接种或接种液体培养基,培养。保存条件室温保存12个月、-20保存12个月、-80可保存24个月2024/5/212024/5/21周二周二1616.二、菌种的二、菌种的传传代和使用代和使用工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代从菌种保藏中心获得的标准菌株为第0代）防止过度的传代造成菌种变异。2024/5/212024/5/21周二周二1717.细菌的接种、分离和培养 接种：将微生物的培养物、含有微生物或可能污染有微生物的样品接种到培养基上的一种操作技术。2024/5/212024/5/21周二周二1818.常用培养基种常用培养基种类类 斜面培养基 半固体斜面培养基 液体斜面培养基 平板斜面培养基2024/5/212024/5/21周二周二1919.接种方法接种方法涂布法涂布法划划线线法法穿刺法穿刺法直接加入法等直接加入法等2024/5/212024/5/21周二周二2020.分离分离：为为了了获获得得纯纯菌种（株），采用的将菌种（株），采用的将细细菌分离成菌分离成 单单个个细细胞，使其独立分裂繁殖形成胞，使其独立分裂繁殖形成单单个菌落的个菌落的 操技操技术术。分离一般采用平板培养基。分离一般采用平板培养基。分离方法主要有分段划分离方法主要有分段划线线法、法、连续连续划划线线法、法、涂布分离法、涂布分离法、倾倾注分离法等。注分离法等。2024/5/212024/5/21周二周二2121.接接种种后后的的培培养养基基，根根据据不不同同微微生生物物生生长长条条件件的的要要求求，培培养养基基放放在在适适宜宜微微生生物物生生长长的的环环境境中中温温度度、湿湿度度、氧氧气气等等），使使其其生生长长繁殖的繁殖的过过程。程。需气菌培养法需气菌培养法 厌厌氧培养法氧培养法培养培养2024/5/212024/5/21周二周二2222.培养后微生物的生培养后微生物的生长长判断判断固体培养基固体培养基有菌落生有菌落生长长或沿穿刺或沿穿刺线扩线扩散生散生长长。液体培养基液体培养基浑浊浑浊、菌膜、沉淀等。、菌膜、沉淀等。2024/5/212024/5/21周二周二2323.菌种的菌种的传传代和使用代和使用 冻冻干菌种（干菌种（0 0代）代）增菌液培养（增菌液培养（1 1代）代）增菌液培养（增菌液培养（2 2代）代分装冷分装冷冻冻保存保存 增菌液培养增菌液培养 适宜的斜面培养基适宜的斜面培养基 使用使用 工作菌株（工作菌株（3 3代）代）工作菌株工作菌株传传代（代（4 4代）代）冷冷冻冻保存保存 工作菌株工作菌株传传代（代（5 5代）代）冷冷冻冻保存保存 如如使使用用蛋蛋白白胨胨、甘甘油油水水，可可取取各各代代的的斜斜面面培培养养物物，加加入入培培养养基基中中，在在规规定条件培养后冷定条件培养后冷冻冻保存。保存。2024/5/212024/5/21周二周二2424.斜面培养物 稀释（比浊或预实验）菌液稀释 平板计数 验证实验、阳性对照 平板计数也可和试验同时进行菌液的制备和使用2024/5/212024/5/21周二周二2525.三、菌种的三、菌种的检查检查与复壮与复壮 菌种的衰退菌种的衰退 菌种菌种经过长经过长期人工期人工传传代培养或保藏，由自代培养或保藏，由自发发突突变变的作用的作用 而引起某些而引起某些优优良特性良特性变变弱或消失的弱或消失的现现象。象。控制菌种的衰退方法控制菌种的衰退方法 控制控制传传代次数代次数 创创造适宜的培养条件造适宜的培养条件 采用有效的保藏方法采用有效的保藏方法2024/5/212024/5/21周二周二2626.定期定期检查检查 定定期期检检查查 复复活活、分分离离、纯纯化化、检检查查鉴鉴定定和和再再保保藏藏。发发现现变变异异或或衰退，衰退，应应及及时给时给予恢复。予恢复。主要主要检查项检查项目目 菌菌落落形形态态、革革兰兰染染色色、显显微微镜镜下下菌菌体体形形态态、生生化化特特性性及及血血清清学学检检查查。菌种的菌种的检查检查与复壮与复壮2024/5/212024/5/21周二周二2727.菌种的复壮菌种的复壮 主要采用分离主要采用分离纯纯化的方法。化的方法。经过经过形形态态特征、生理生化特特征、生理生化特征、代征、代谢产谢产物、血清学等一系列物、血清学等一系列实验鉴实验鉴定，定，证证明复壮明复壮后的菌种与原种完全一致，方可后的菌种与原种完全一致，方可认为认为菌种已被复壮。菌种已被复壮。菌种的菌种的检查检查与复壮与复壮2024/5/212024/5/21周二周二2828.四、菌种的管理四、菌种的管理 使用菌种的使用菌种的单单位，位，应应具具备备从事微生物工作的条件和从事微生物工作的条件和设备设备。菌种菌种应应由由专专人人负责负责管理，管理人管理，管理人员应员应具有微生物具有微生物专业专业知知 识识和技和技术术水平，并水平，并应应具有具有较强较强的的责责任心。任心。2024/5/212024/5/21周二周二2929.菌种的管理菌种的管理 实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序管理制度；包括：每支菌种标注名称、标准号、接种日期、传代次数、进出、收集、贮藏、保存、确认试验以及销毁的记录、标准菌种的申购记录、从标准菌株到工作菌株操作记录，如菌种定期转种传代，鉴定（纯度、特性）、培养基和培养条件、菌种保存的位置和条件及其它需要的程序。2024/5/212024/5/21周二周二3030.菌菌种种应应冷冷藏藏或或冷冷冻冻保保存存，保保存存菌菌种种的的冰冰箱箱不不得得放放置置食食品品和和易易挥挥发发性性药药品，放置菌种品，放置菌种应应有有专专用的冰箱，用的冰箱，应应上上锁锁管理。管理。由由专专人人按按操操作作规规程程和和有有关关要要求求定定期期进进行行传传代代，并并定定期期对对保保存存的的菌菌种种进进行行检检查查，一一般般每每年年1 12 2次次，（或或定定期期更更换换冻冻干干菌菌种种）。发发现现菌菌种种的的异异常常情情况况应应及及时时检检查查。一一旦旦发发现现菌菌种种污污染染和和变变异异现现象，象，应应立即立即报报告、研究告、研究处处理。尤其理。尤其长长期保存期保存时时。菌种的管理菌种的管理2024/5/212024/5/21周二周二3131.详细记录详细记录菌菌种种的的来来源源、接接收收、传传代代、分分离离、复复壮壮、使使用用和和鉴鉴定定等等均均应应做做好好详详细细记记录录。包包括括菌菌保保存存位位置置、环环境境(温温度度)、种种传传代代或或使使用用时时间间、名名称称、菌菌号号、代代数数、传传代代或或保保存存形形式式、分分离离、复复壮壮方式、使用内容、方式、使用内容、鉴鉴定情况等都定情况等都应进应进行行详细详细的的记录记录。2024/5/212024/5/21周二周二3232.菌菌种种不不得得随随意意带带出出实实验验室室，外外单单位位索索取取、购购买买应应有有证证明和登明和登记记，并包装，并包装严严密。密。菌种菌种处处理理应严应严格按操作格按操作规规程程进进行，行，灭灭菌菌处处理理应应有有详细详细记录记录。2024/5/212024/5/21周二周二3333.菌菌悬悬液的制液的制备备与保存与保存采用经验证的方法制备菌悬液，除另有规定外，微生物限度试验用菌悬液的制备如下：1、接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养1824小时.2、接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养2448小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10100cfu的菌悬液。2024/5/212024/5/21周二周二3434.3、接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养57天。加入35ml含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50100cfu的孢子悬液。2024/5/212024/5/21周二周二3535.4、菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在28的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子悬液保存在28，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。2024/5/212024/5/21周二周二3636.2024/5/212024/5/21周二周二3737.