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DEN联合NMOR诱导建立具有转移潜能的肝癌模型【摘要】 目的 探讨二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)联合N亚硝基吗啉(Nnitrosomorpholine，NMOR)诱导建立具有转移潜能的SD大鼠肝癌模型以及合适的剂量和周期。方法 5周龄雄性SD大鼠110只，分成4组：DEN+NMOR组(60只)、DEN组(20只)、NMOR组(20只)以及正常对照组(10只)。第1天DEN+NMOR组和DEN组大鼠按100 mg/kg腹腔注射DEN 1次，NMOR组和对照组给予等量的生理盐水腹腔注射。第2天DEN+NMOR组和NMOR组给予含质量分数为110-4 NMOR的饮水自由饮用，DEN组和对照组饮用灭菌自来水。实验共进行20周。结果 16周时DEN+NMOR组、DEN组、NMOR组及正常对照组肝癌发生率分别为60%(6/10)、20%(1/5)、0(0/5)、0(0/2)；20周时分别为88%(21/24)、17%(1/6)、14%(1/7)、0(0/2)。DEN+NMOR组16周及20周肝癌肺转移率分别为33%(2/6)和48%(10/21)，其他组未发现肺转移。结论 (1)用DEN启动，NMOR促进的方法诱导建立SD大鼠肝癌模型操作简便、效果确切、成瘤周期短，有一定的肺转移率。(2)按100 mg/kg给予1次DEN腹腔注射，给予含质量分数为110-4 NMOR的饮水连续20周可能是有效的剂量和周期。【关键词】 N亚硝基吗啉； 肺转移； 肝肿瘤； SD大鼠 【Abstract】 Objective To establish diethylnitrosamine (DEN) and Nnitrosomorpholine (NMOR) induced metastatic hepatocellular carcinoma (HCC) model in SD rats and investigate proper dose and treatment period. Methods One hundred and ten 5weekold male SD rats were randomly divided into DEN+NMOR group (n=60), DEN group (n=20), NMOR group (n=20) and control group (n=10). Rats in DEN+NMOR group and DEN group were given a single intraperitoneal injection of DEN at 100 mg/kg, and rats in NMOR group and control group were intraperitoneally injected with normal saline at the same dosage at the first day. From the second day on, groups DEN+NMOR, NMOR were given 110-4 NMOR in the drinking water, while DEN group and control group were given sterilized water for 20 weeks. Results The HCC incidence in groups DEN+NMOR, DEN, NMOR and control group was 60%(6/10), 20%(1/5), 0(0/5), 0(0/2) by the end of the 16th week, and 88%(21/24), 17%(1/6), 14%(1/7), 0(0/2) by the end of the 20th week. Lung metastasis incidence in group DEN+NMOR by the end of the 16th and 20th week was 33%(2/6), 48%(10/21), respectively. No lung metastasis was observed in groups DEN, NMOR, and control group. Conclusions (1) Establishment of hepatocarcinogenesis model induced by DEN and NMOR in SD rat provides an efficient means for rapid induction of lung metastasis of HCC. (2) A single intraperitoneal injection of DEN as an initiator of hepatocarcinogenesis at a dose of 100 mg/kg and followed by 110-4 NMOR in the drinking water for 20 weeks are appropriate. 【Key words】 Nnitrosomorpholine; Lung metastasis; Liver neoplasm; SD rat 诱导性大鼠肝癌模型是肝癌研究中应用广泛的动物模型，最常用的诱导药物为二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)。但DEN诱导的肝癌多为Edmondson 级和级，转移率很低，与人肝癌易转移复发的情况不甚符合1。因此我们探讨用DEN联合N亚硝基吗啉(Nnitrosomorpholine,NMOR)诱导建立具有转移潜能的SD大鼠肝癌模型。 1 材料与方法 诱癌剂 DEN，分子式(C2H5)2NNO；NMOR，分子式C4H8N2O2。均购自Sigma公司。 实验动物及分组 5周龄雄性SD大鼠110只，体质量()g，由安徽医科大学实验动物中心提供。分成4组：DEN+NMOR组(60只)，DEN组(20只)，NMOR组(20只)，正常对照组(10只)。饲养于该中心SPF环境下，灭菌饲料和饮用水由该实验中心提供，稳定饲养1周后，开始诱癌处理。 诱癌方法 参照文献2及我们预实验的结果，第1天DEN+NMOR组和DEN组按100 mg/kg腹腔注射DEN 1次，NMOR组和对照组给予等量的生理盐水。第2天DEN+NMOR组和NMOR组给予含质量分数为110-4 NMOR的饮水自由饮用，DEN组和对照组饮用灭菌自来水。实验共进行20周。分别于第4、8、12周取DEN+NMOR组大鼠23只、其他组12只处死观察。剩余的大鼠于16周和20周分两批处死。实验中死亡的大鼠随时解剖观察。 观察指标 (1)一般情况：观察动物的精神、饮食、活动等情况，定期称体质量。(2)组织学检查：摘取肝脏、肺用10%甲醛固定24 h后以层厚1 mm大体切片观察有无肿瘤结节或转移灶。无癌灶者，取肝、肺组织；有癌灶者取癌结节及距癌灶边缘 cm的组织。苏木精伊红染色镜检，肝细胞癌按Edmondson分级法分为、级。 统计学分析 采用SPSS 统计软件，体质量采用s表示，检验用方差分析；统计肝癌发生率、肺转移率、大鼠病死率采用2检验及Fisher确切概率法。 2 结果 大鼠一般情况 诱癌第1周内，DEN+NMOR组和DEN组部分动物出现活动减少、饮食差，有大鼠死亡；第2周最为严重；前3周是死亡发生的高峰期；4周后大鼠情况好转，体质量增加，死亡数量明显减少；512周时，各组情况良好，体质量增长较快；14周以后DEN+NMOR组大鼠体质量增加较其他组减慢；20周3组体质量比较差异有统计学意义(F=34 499，)。DEN+NMOR组、DEN组、NMOR组及对照组大鼠16周病死率分别为28%(17/60)、25%(5/20)、15%(3/20)、0(0/10)，20周病死率分别为30%(18/60)、25%(5/20)、20%(4/20)、0(0/10)，DEN+NMOR、DEN、NMOR 3组比较差异无统计学意义(2=，)。 肝癌发生率及肝脏病理变化 16周和20周时各组肝癌发生率见表1。早期(48周)主要病理改变为肝细胞变性、坏死。16周时，DEN+NMOR组部分肝脏表面可见灰白色结节，一般为12个，直径为 cm；20周时，大鼠肝脏多肿大，表面粗糙，质地脆弱，呈典型结节性肝硬化表现。癌结节增大、增多，散在、多发，直径为 cm。镜下肝脏呈结节性肝硬化、肝癌表现。癌细胞多排列实片状及腺样，可见静脉癌栓(图1)。在DEN+NMOR组27只成癌动物中，25只为肝细胞癌，2只为混合性肝癌。肿瘤分化以中、低分化为主，其中级4只，级9只，级12只。表1 肝癌发生率及肺转移率 肺转移 DEN+NMOR组发生肝癌的大鼠中，肺转移率在16周和20周时分别为33%(2/6)、48%(10/21)(表1)。肺表面出现灰白色结节，部分有融合。病理检查为肝癌肺转移并可见血管内癌栓(图2)。 3 讨论 诱发性肝癌模型的建立多采用氨基偶氮染料、芳香胺类化合物、亚硝胺及黄曲霉素等化学药物，其中以亚硝胺类，尤其是DEN是公认可靠的诱癌药物。NMOR属于亚硝胺类，用DEN+NMOR诱导建立F344大鼠肝癌模型，发现肝癌发生率和肝癌肺转移率均较高，而且如果剂量合适，可以明显减少大鼠的病死率2。国内普遍使用的是SD或Wistar等封闭群大鼠。本实验提示，用DEN+NMOR联合诱导建立具有转移潜能的SD大鼠肝癌模型是可行的。虽然Yoshino等2使用DEN 100 mg/kg，然后给予含质量分数为410-5 NMOR饮水建立F344大鼠肝癌模型，20周时肝癌发生率达到100%。但我们预实验时在SD大鼠上使用质量分数为410-5 NMOR却只得到很低的诱癌成功率，原因可能是SD大鼠对肿瘤的易感性低于F344大鼠。改用质量分数为110-4 NMOR后，效果较好。是否还可以加大剂量或延长实验周期来获得更好的效果，尚需进一步研究。 大鼠死亡时间分布多在实验开始4周内，死亡的原因主要有肺部感染、急性肝损害、肠坏死等。 前4周主要是变性，8周后可看到增生反应，出现嗜酸性、嗜碱性结节，而这些现象被认为是肝癌发生过程中的几种关键变化3-5。16周时出现肉眼可见的癌结节，20周时肝脏呈现典型的结节性肝硬化，癌结节散在、多发。近一半的肝癌大鼠发生肺转移。此过程与我国人肝癌多经历肝炎肝硬化肝癌发生、发展侵袭转移的病理过程相类似。DEN+NMOR组肝癌发生率高于单用DEN或NMOR组，分级多为、级，有静脉癌栓和肺转移灶。这说明DEN+NMOR诱发肝癌效果肯定，癌分化程度较低，有一定的侵袭性和转移能力。 本实验表明，用DEN+NMOR联合诱导建立SD大鼠肝癌模型，操作简便、成瘤周期较短，有一定的肺转移率；病理过程遵循损伤、增生、硬化和肝癌发生、发展与转移的规律，可为研究肝癌的机制以及干预治疗提供平台。 【参考文献】 1 陈华,赵德明.肝癌动物模型.实验动物科学与管理,2005,22(4):32-35. 2 Yoshino H, Futakuchi M, Cho YM, et al. Modification of an in vivo lung metastasis model of hepatocellular carcinoma by low dose Nnitrosomorpholine and diethylnitrosamine. Clin Exp Metastasis,2005,22(5):441-447.3 赵鲁笳,刘小北,郭宏伟.3MeDAB诱发大鼠肝癌模型的建立与病理研究.中国实验诊断学,2004,8(3):243-245.4 姜幼纯,董奇男,肖邦良,等.非坏死剂量二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌模型的研究.华西医科大学学报,2001,32(4):555-558，628.5 王晓明,王宝恩,王泰龄,等.实验性肝细胞癌变过程中嗜碱性小细胞病灶的癌变趋势.中华肝脏病杂志,2006,14(7):495-498.