肿瘤自杀基因治疗及中药方药的增效作用和机制.ppt

肿瘤自杀基因治疗及中药方药的增效作用和机制肿瘤自杀基因治疗及中药方药的增效作用和机制主讲人：杜标炎主讲人：杜标炎广州中医药大学广州中医药大学课题资助情况 国家自然科学基金（编号：国家自然科学基金（编号：30171201;30572433;30672747 ）广东省科技攻关计划（编号：广东省科技攻关计划（编号：2005B3030102）广州市科委（编号：广州市科委（编号：2002J1-C7401）广东省中医药管理局（编号：广东省中医药管理局（编号：A401028；1050079）广州中医药大学广州中医药大学(K0050031)内内 容容 研究背景及研究思路研究背景及研究思路HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建肿瘤自杀基因治疗系统的构建中药方药对肿瘤自杀基因治疗的增效作用中药方药对肿瘤自杀基因治疗的增效作用中药方药增效作用的机制中药方药增效作用的机制肿瘤自杀基因治疗系统的改进工作肿瘤自杀基因治疗系统的改进工作研究背景及研究思路研究背景及研究思路基因治疗的概念基因治疗的概念基因治疗就是将外源性基因导入到正常或病变细胞中，基因治疗就是将外源性基因导入到正常或病变细胞中，利用其转录或翻译产物发挥治疗作用的一种方法利用其转录或翻译产物发挥治疗作用的一种方法基因治疗的策略基因治疗的策略基因治疗的临床试验基因治疗的临床试验肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗恶性肿瘤由于患者来源广，用于治疗的基因多，恶性肿瘤由于患者来源广，用于治疗的基因多，容易复制动物模型等原因而成为首选对象容易复制动物模型等原因而成为首选对象 目前常用的肿瘤基因治疗方案目前常用的肿瘤基因治疗方案 肿瘤的免疫基因治疗肿瘤的免疫基因治疗肿瘤抑制基因治疗肿瘤抑制基因治疗 自杀基因治疗自杀基因治疗（最有应用前景）（最有应用前景）肿瘤多药耐药性基因治疗肿瘤多药耐药性基因治疗 抑制血管生成的基因治疗抑制血管生成的基因治疗自杀基因的概念自杀基因的概念 所谓自杀基因是指在一定条件下，可以引所谓自杀基因是指在一定条件下，可以引起细胞自动死亡的基因起细胞自动死亡的基因 目前研究的多数自杀基因是通过编码病毒或细菌的酶目前研究的多数自杀基因是通过编码病毒或细菌的酶介导敏感性，这些酶能把药物的无活性形式转化为毒性代谢介导敏感性，这些酶能把药物的无活性形式转化为毒性代谢产物，引起细胞死亡产物，引起细胞死亡基因名称底物产物旁杀伤效应备注单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）GCV，ACV，PCV，BCV，BVDU，BVDC，IVDU等核苷类似物磷酸化的核苷类似物有研究最多已上临床水痘带状疱疹病毒胸苷激酶（VZV-tk）araMaraATP大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（EC-CD）5-FC5-FU有已上临床大肠杆菌硝基还原酶（NTR）CB1954，MTZ，NFT羟胺衍生物有研究正在兴起大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（EC-XGPRT或gpt基因）6TG6TX6-硫代鸟嘌呤酸有细胞色素P450CYP2B1CPA，IFA碱性化的底物有细胞羧肽酶G2（CPG2）CMDA芥类药物有大肠杆菌DeoD基因（PNP）Mep-dr6-甲嘌呤有白细胞介素1转化酶（ICE）RARP，LaminsRb，U1-70kD等被降解失活的底物p53有目前应用于实验室和临床主要的自杀基因治疗系统 自杀基因治疗的优势自杀基因治疗的优势特异性杀伤基因表达细胞特异性杀伤基因表达细胞杀伤多药耐药性（杀伤多药耐药性（MDR）肿瘤细胞肿瘤细胞基因的表达只需将一定量的前药转换成足以杀基因的表达只需将一定量的前药转换成足以杀伤肿瘤细胞的剂量即可，而无需基因的长期表达伤肿瘤细胞的剂量即可，而无需基因的长期表达绝大部分自杀基因存在极明显的绝大部分自杀基因存在极明显的“旁杀伤效应旁杀伤效应”，体外只需有体外只需有10以上的肿瘤细胞表达自杀基以上的肿瘤细胞表达自杀基因，就可以杀伤绝大部分甚至全部肿瘤细胞因，就可以杀伤绝大部分甚至全部肿瘤细胞良好的瘤苗良好的瘤苗 旁杀伤效应旁杀伤效应 旁杀伤效应作用机制旁杀伤效应作用机制“缝隙连接缝隙连接”机制机制 免疫介导机制免疫介导机制“细胞凋亡细胞凋亡”机制机制 介质机制介质机制 抗肿瘤血管生成抗肿瘤血管生成 缝隙连接机制缝隙连接机制免疫介导机制免疫介导机制tk+死亡死亡大量抗原释放大量抗原释放免疫细胞浸润免疫细胞浸润细胞因子释放细胞因子释放免疫炎症系统介导的免疫炎症系统介导的非特异性杀伤非特异性杀伤诱发特异性诱发特异性抗肿瘤免疫反应抗肿瘤免疫反应12免疫抑制免疫抑制免疫激活免疫激活免疫增强免疫增强旁杀伤效旁杀伤效应增强应增强死亡死亡“细胞凋亡细胞凋亡”机机制制自杀基因引起细胞死亡的形式为细胞凋自杀基因引起细胞死亡的形式为细胞凋亡亡tk+细胞凋亡形成凋亡小体为细胞凋亡形成凋亡小体为tk-细胞吞噬细胞吞噬引起引起tk-细胞死亡细胞死亡细胞死亡细胞死亡tk-细胞细胞介质扩散介质扩散 CD5-Fc5-Fu5-Fu5-Fu5-FuCD-细胞死亡细胞死亡抗肿瘤血管生成抗肿瘤血管生成注：注：自杀基因自杀基因单纯自杀基因治疗存在主要问题单纯自杀基因治疗存在主要问题目的基因转染率低而杀伤力不足；缺目的基因转染率低而杀伤力不足；缺乏靶向性，自杀基因的表达缺乏组织乏靶向性，自杀基因的表达缺乏组织特异性和时序性等，单纯自杀基因治特异性和时序性等，单纯自杀基因治疗难以完全消除肿瘤细胞疗难以完全消除肿瘤细胞肿瘤自杀基因疗法的增效方法肿瘤自杀基因疗法的增效方法 双自杀基因治疗双自杀基因治疗 联合治疗联合治疗 联合免疫基因治疗联合免疫基因治疗 联合放射治疗联合放射治疗 联合化学治疗联合化学治疗 联合其他基因联合其他基因 靶向基因治疗靶向基因治疗 增强旁杀伤效应增强旁杀伤效应 单纯自杀基因治疗单纯自杀基因治疗易复发易复发联合治疗增效联合治疗增效联合免疫基因联合免疫基因 联合放化疗联合放化疗多基因间互相干扰，多基因间互相干扰，难以保证导入基因难以保证导入基因表达或长期表达；表达或长期表达；使用病毒载体量增使用病毒载体量增多，潜在毒副作用多，潜在毒副作用增大；操作过程复增大；操作过程复杂，成本较高杂，成本较高联合中药方药联合中药方药载体转染效率低载体转染效率低靶向性不够靶向性不够自杀基因疗法联合中药方药可能是一种更为有效和可行的方案自杀基因疗法联合中药方药可能是一种更为有效和可行的方案研究思路研究思路增强免疫功能增强免疫功能增强增强“缝缝隙连接隙连接”功能功能增强杀伤增强杀伤敏感性敏感性提高旁杀伤效应提高旁杀伤效应 肯定的免疫药理作用肯定的免疫药理作用 多靶点作用多靶点作用 给药方便，价格低廉，毒副给药方便，价格低廉，毒副作用小或无明显毒副作用作用小或无明显毒副作用HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建肿瘤自杀基因治疗系统的构建 技术路线技术路线获得目的基因获得目的基因酶切酶切酶切鉴定酶切鉴定质粒重组质粒重组病毒包装和阳性克隆筛选病毒包装和阳性克隆筛选病毒感染胃癌细胞病毒感染胃癌细胞重组质粒鉴定重组质粒鉴定病毒滴度测定病毒滴度测定GCV杀伤试验杀伤试验斑点杂交鉴定斑点杂交鉴定目的基因（目的基因（tk基因）的获得基因）的获得 由美国匹兹堡大学药理教研室由美国匹兹堡大学药理教研室Huang L.教授惠赠，广州军区总医院赵亚刚博士教授惠赠，广州军区总医院赵亚刚博士提供提供（pICl9R/MCl-tk质粒质粒）pICl9R/MCl-tk质粒酶切鉴定结果质粒酶切鉴定结果12345a：pICl9R/MCl-tk质粒结构图质粒结构图 b：pICl9R/MCl-tk质粒的酶切鉴定电泳图谱质粒的酶切鉴定电泳图谱 注（注（b）：）：1：Marker(DNA Hind)；2：pICl9R/MCl-tk质粒质粒 3：pICl9R/MCl-tk质粒质粒/BamH；4：pICl9R/MCl-tk质粒质粒/BamH+EcoR 5：Marker(DNA/EcoR+Hind)重组质粒的限制性内切酶鉴定结果重组质粒的限制性内切酶鉴定结果 a a：pLXSN-tkpLXSN-tk质粒结构图质粒结构图b：pLXSN-tk质粒的酶切鉴定电泳图谱质粒的酶切鉴定电泳图谱1 2 3 4 5 61DNA marker(分子量分别为分子量分别为2.5kb,2.0kb,1.5kb,1.0 kb,500bp,300bp)2pLXSN-tk经经EcoR I单酶切单酶切34pLXSN-tk经经EcoR I/BamH I双酶切双酶切5 pLXSN-tk质粒质粒6 DNA/EcoR I/Hind marker 重组质粒的测序图鉴定结果重组质粒的测序图鉴定结果 PT67包装细胞筛选结果包装细胞筛选结果 a a：G418G418筛选筛选5d5d后的后的PT67 bPT67 b：筛选筛选2w2w后形成的阳性克隆细胞后形成的阳性克隆细胞图图3 pLXSN-tk质粒转染包装细胞质粒转染包装细胞PT67结果结果病毒滴度测定及结果病毒滴度测定及结果 本实验测定滴度最高为本实验测定滴度最高为1104cfu/mL胃癌细胞tk基因的斑点杂交鉴定 123胃癌细胞胃癌细胞SGC-7901、SGC-7901/tk的的 DNA与与tk探针的斑点杂交图探针的斑点杂交图 注：注：1.pLXSN/tk 质粒质粒DNA（阳性对照）；阳性对照）；2.SGC-7901细胞细胞DNA；3.SGC-7901/tk细胞细胞DNA GCV对人胃癌细胞对人胃癌细胞SGC-7901的体外杀伤试验的体外杀伤试验 结论及意义结论及意义已成功已成功构建了逆转录病毒载体介导已成功已成功构建了逆转录病毒载体介导的的HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统肿瘤自杀基因治疗系统 HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统成功的构建，自杀基因治疗系统成功的构建，为后续的研究工作奠定了坚实的基础为后续的研究工作奠定了坚实的基础 中药方药对肿瘤自杀基因治疗的增效作用中药方药对肿瘤自杀基因治疗的增效作用动物水平实验动物水平实验技术路线技术路线H22/tk和和H22/tk按按1 4混合混合接种小鼠皮下组织接种小鼠皮下组织（2106细胞细胞）病毒感染肝癌细胞病毒感染肝癌细胞疗效观察疗效观察动物分组动物分组GCV体外杀伤试验体外杀伤试验成瘤后成瘤后治疗治疗小鼠移植性肝细胞癌治疗实验小鼠移植性肝细胞癌治疗实验(六味地黄六味地黄)分组及治疗分组及治疗 模型对照组模型对照组正常对照组正常对照组联合治疗组联合治疗组 六味地黄丸治疗组六味地黄丸治疗组 自杀基因治疗组自杀基因治疗组（造模）（造模）第2天第6天第16天蒸馏水灌胃每天蒸馏水灌胃每天0.5mL 腹腔注射生理盐水每天腹腔注射生理盐水每天0.25mL 蒸馏水灌胃每天蒸馏水灌胃每天0.5mL 腹腔注射生理盐水每天腹腔注射生理盐水每天0.25mL 腹腔注射生理盐水每天腹腔注射生理盐水每天0.25mL 腹腔注射腹腔注射GCV100mgkg-1d-1 腹腔注射腹腔注射GCV100mgkg-1d-1六味地黄丸悬液灌胃六味地黄丸悬液灌胃10gkg-1d-1 蒸馏水灌胃每天蒸馏水灌胃每天0.5mL 六味地黄丸悬液灌胃六味地黄丸悬液灌胃10gkg-1d-1（造模）（造模）（造模）（造模）（造模）（造模）（生理盐水）（生理盐水）肿瘤生长体积曲线肿瘤生长体积曲线时间（d）肿瘤质量及肿瘤质量及抑瘤率抑瘤率组别组别n肿肿瘤瘤质质量（量（g）抑瘤率（抑瘤率（%）模型模型对对照照组组191.58251.2380六味地黄治六味地黄治疗组疗组190.84980.716346.3自自杀杀基因治基因治疗组疗组200.99040.979637.4联联合治合治疗组疗组180.58590.3786*63.0注：注：*与模型对照组比较与模型对照组比较P0.05抑瘤率抑瘤率=（模型组肿瘤质量治疗组肿瘤质量）（模型组肿瘤质量治疗组肿瘤质量）/模型组肿瘤质量模型组肿瘤质量100%肿瘤质量图示肿瘤质量图示病理检查结果病理检查结果(肉眼观察肉眼观察)注：第二组：肿瘤模型组；第三组：六味地黄丸治疗组；第四组：自杀基因治疗组；注：第二组：肿瘤模型组；第三组：六味地黄丸治疗组；第四组：自杀基因治疗组；第五组：联合治疗组第五组：联合治疗组 病理检查结果病理检查结果(光镜观察光镜观察)模型对照组模型对照组 肿瘤细胞数量较多，密集。六味地黄丸治疗组六味地黄丸治疗组 肿瘤细胞数量较多，密集。自杀基因治疗组自杀基因治疗组 肿瘤细胞数量密度相对较少。联合治疗组联合治疗组 肿瘤细胞数量密度相对较低。各组细胞密度各组细胞密度模型对照组：模型对照组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织 六味地黄丸治疗六味地黄丸治疗组：组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织 自杀基因治疗自杀基因治疗组：组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织 联合治疗组：联合治疗组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织。各组肿瘤坏死情况各组肿瘤坏死情况模型对照组：模型对照组：肿瘤周边纤维组织增生不明显，未见明显包膜 六味地黄丸治疗六味地黄丸治疗组：组：肿瘤周边纤维组织增生较明显，形成较明显的假包膜 自杀基因治疗组：自杀基因治疗组：肿瘤周边纤维组织增生较明显，形成较明显的假包膜 联合治疗组：联合治疗组：肿瘤周边纤维组织增生较明显，形成较厚的假包膜 各组肿瘤纤维结缔组织增生情况各组肿瘤纤维结缔组织增生情况模型对照组：模型对照组：肿瘤边缘见少量炎细胞浸润 六味地黄丸治疗六味地黄丸治疗组：组：肿瘤边缘纤维结缔组织内见较多量炎细胞浸润 自杀基因治疗组：自杀基因治疗组：肿瘤边缘纤维结缔组织内见较多量炎细胞浸润 联合治疗组：联合治疗组：肿瘤边缘纤维结缔组织内见大量炎细胞浸润 各组肿瘤组织炎细胞浸润情况各组肿瘤组织炎细胞浸润情况肝癌治疗实验结论肝癌治疗实验结论 自杀基因疗法与六味地黄丸联合应自杀基因疗法与六味地黄丸联合应用于小鼠移植性肝细胞癌的治疗具有用于小鼠移植性肝细胞癌的治疗具有协同效应，表明六味地黄丸对自杀基协同效应，表明六味地黄丸对自杀基因治疗小鼠移植性肝细胞癌具有增效因治疗小鼠移植性肝细胞癌具有增效作用作用 丹参注射液丹参注射液H22肝癌荷瘤小鼠剥落瘤块照片肝癌荷瘤小鼠剥落瘤块照片A 模型对照组；模型对照组；B 丹参组；丹参组；C tk/GCV组；组；D 联合组联合组.技术路线技术路线tk和和tk细胞按细胞按1 4混合混合接种小鼠皮下组织接种小鼠皮下组织（1106细胞细胞）病毒感染黑色素瘤细胞病毒感染黑色素瘤细胞疗效观察疗效观察动物分组及治疗动物分组及治疗GCV体外杀伤试验体外杀伤试验小鼠移植性黑色素瘤治疗实验小鼠移植性黑色素瘤治疗实验 分组及治疗分组及治疗 模型对照组模型对照组正常对照组正常对照组联合治疗组联合治疗组 六味地黄丸治疗组六味地黄丸治疗组 自杀基因治疗组自杀基因治疗组（造模）（造模）第2天第7天第27天蒸馏水灌胃每天蒸馏水灌胃每天0.5mL 腹腔注射生理盐水每天腹腔注射生理盐水每天0.25mL 蒸馏水灌胃每天蒸馏水灌胃每天0.5mL 腹腔注射生理盐水每天腹腔注射生理盐水每天0.25mL 腹腔注射生理盐水每天腹腔注射生理盐水每天0.25mL 腹腔注射腹腔注射GCV100mgkg-1d-1 腹腔注射腹腔注射GCV100mgkg-1d-1六味地黄丸悬液灌胃六味地黄丸悬液灌胃10gkg-1d-1 蒸馏水灌胃每天蒸馏水灌胃每天0.5mL 六味地黄丸悬液灌胃六味地黄丸悬液灌胃10gkg-1d-1（造模）（造模）（造模）（造模）（造模）（造模）（生理盐水）（生理盐水）成瘤时间接种接种模型对照组 六味地黄丸治疗组 自杀基因治疗组 联合治疗组 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30成瘤率肿瘤生长体积曲线肿瘤生长体积曲线时间（d）时间（d）肿瘤质量及肿瘤质量及抑瘤率抑瘤率注：注：*与模型对照组比较与模型对照组比较 P0.05 六味地黄治疗组因有六味地黄治疗组因有2只肿瘤较大的荷瘤小鼠后期死亡未能获得肿只肿瘤较大的荷瘤小鼠后期死亡未能获得肿瘤标本，该数据低于实际数据瘤标本，该数据低于实际数据 抑瘤率抑瘤率=（模型组肿瘤质量治疗组肿瘤质量）（模型组肿瘤质量治疗组肿瘤质量）/模型组肿瘤质量模型组肿瘤质量100%组别组别n肿肿瘤瘤质质量（量（g）抑瘤率（抑瘤率（%）模型模型对对照照组组100.95831.3260自自杀杀基因治基因治疗组疗组110.35660.856962.8六味地黄治六味地黄治疗组疗组70.43690.693754.4联联合治合治疗组疗组100.12340.2538*87.1各组肿瘤质量图示各组肿瘤质量图示注：六味地黄治疗组因有注：六味地黄治疗组因有2只肿瘤较大的荷瘤小鼠后期死亡未只肿瘤较大的荷瘤小鼠后期死亡未能获得肿瘤标本，该数据低于实际数据能获得肿瘤标本，该数据低于实际数据病理检查结果病理检查结果(肉眼观察肉眼观察)注：注：B：肿瘤模型组；肿瘤模型组；C：自杀基因治疗组；自杀基因治疗组；D：六味地黄丸治疗组；六味地黄丸治疗组；E：联合治疗组联合治疗组 病理检查结果病理检查结果(光镜观察光镜观察)模型对照组模型对照组 模型对照组：肿瘤组织内可见细胞密集，细胞内可见黑色素 自杀基因治疗组自杀基因治疗组肿瘤组织内可见细胞密集细胞内可见黑色素 六味地黄治疗组六味地黄治疗组肿瘤组织内可见密集的肿瘤细胞联合治疗组联合治疗组肿瘤组织内可见细胞密度稍降低 各组细胞密度各组细胞密度模型对照组模型对照组肿瘤内可见大片坏死组织 自杀基因治疗自杀基因治疗肿瘤内可见大片坏死组织六味地黄治疗组六味地黄治疗组肿瘤内可见大片坏死组织 联合治疗组联合治疗组肿瘤内可见坏死组织 各组肿瘤坏死情况各组肿瘤坏死情况模型对照组模型对照组肿瘤周围无明显胞膜形成 自杀基因治疗组自杀基因治疗组肿瘤周围见薄层假包膜 六味地黄丸治疗六味地黄丸治疗组：组：肿瘤周围见薄层假包膜 联合治疗组联合治疗组肿瘤周围明显的假包膜形成 各组肿瘤纤维结缔组织增生情况各组肿瘤纤维结缔组织增生情况模型对照组模型对照组肿瘤周围组织内见少量炎症细胞浸润 自杀基因治疗组自杀基因治疗组肿瘤周围组织内见少量炎症细胞浸润 六味地黄丸治六味地黄丸治疗组疗组肿瘤周围组织内有较多炎症细胞浸润 联合治疗组联合治疗组肿瘤间质及周围组织内见多量淋巴细胞浸润 各组肿瘤组织炎细胞浸润情况各组肿瘤组织炎细胞浸润情况恶性黑色素瘤治疗实验结论恶性黑色素瘤治疗实验结论六味地黄丸对自杀基因治疗小鼠移植六味地黄丸对自杀基因治疗小鼠移植性恶性黑色素瘤具有增效作用性恶性黑色素瘤具有增效作用 细胞水平实验细胞水平实验中药成分联合中药成分联合tk/GCV系统系统对肝癌细胞的杀伤作用对肝癌细胞的杀伤作用中药成分对肝癌细胞的作用中药成分对肝癌细胞的作用(确定筛选药物及联合用药剂量确定筛选药物及联合用药剂量)Q值法分析联合作用值法分析联合作用是否有协同性是否有协同性 有效中药成分增效机制探讨有效中药成分增效机制探讨 有效中药成分对细有效中药成分对细胞周期、细胞凋亡胞周期、细胞凋亡率的影响率的影响有效中药成分有效中药成分对对肝癌细胞肝癌细胞GJIC的的影响影响自身旁杀伤效应检测自身旁杀伤效应检测大鼠大鼠肝癌细胞肝癌细胞tk-、tk+细胞对细胞对GCV敏感性检测敏感性检测决定采用的决定采用的GCV浓度浓度建立大鼠建立大鼠肝癌细胞肝癌细胞 tk/GCV系统系统技术路线大鼠肝癌细胞大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk-和和CBRH7919/tk+对对GCV敏感性（敏感性（MTT法，法，72h）CBRH7919/tk-和和CBRH7919/tk+不同混合比例对不同混合比例对tk/GCV系统旁观者效应的影响系统旁观者效应的影响(MTT法）法）组别组别tktk+细细胞比例（）胞比例（）存活率（存活率（%）GCV15.7MGCV15.7M1 10 098.25.598.25.52 25 592.610.992.610.93 3101071.09.071.09.0 a4 4202057.35.257.35.2 b5 5404048.87.048.87.0 b6 6606031.03.531.03.5 b25.94.625.94.6 b7 7100100aP 0.05,bP 0.01,与组1比较(一一)六味地黄丸药物血清联合不同比例六味地黄丸药物血清联合不同比例tk/GCV系统对大鼠肝癌细胞的作用观察系统对大鼠肝癌细胞的作用观察血清（血清（%）GCV GCV 5%tk/GCV(0M)(39.2M)(39.2M)对照对照 对照对照 对照对照 含药含药 含药含药 含药含药 Q Q值值057.5100.0015.24 69.7015.12 63.601.71122.045.99 109.6711.85 94.786.86 128.7911.91 109.539.71 69.8728.12 a128.060.90 105.477.71 90.519.85 120.069.27 93.584.96 56.8613.71 a1.191.12 (meanSD n=3)The effect of herbs serum of Liuwei Diduang Bolus combining with 5%tk/GCV system5%tk/GCV system on CBRH7919(MTT assay)(Serum:12h)血清（血清（%）GCV GCV 10%tk/GCV(0M)(39.2M)(39.2M)对照对照 对照对照 对照对照 含药含药 含药含药 含药含药 Q Q值值057.5100.0015.63c 85.596.37ac 72.408.48b 89.0612.85c 73.46+12.55c 76.4016.17b 91.069.69c 84.586.25c 55.9713.06abd 97.4512.60c 91.888.34cb 75.1611.99b 92.7711.11c 87.891.87db 57.798.45bd1.231.73 (meanSD n=6)The effect of herbs serum of Liuwei Diduang Bolus combining with 10%tk/GCV system10%tk/GCV system on CBRH7919(MTT assay)(Serum:12h)10%tk/GCV，7.5%对照血清对照血清孵育孵育12h10%tk/GCV，7.5%含药血清含药血清孵育孵育12h血清（血清（%）GCV GCV 10%tk/GCV(0M)(39.2M)(39.2M)对照对照 对照对照 对照对照 含药含药 含药含药 含药含药 Q Q值值057.5100.006.28 83.509.35 69.578.78 77.133.17 72.937.94 71.983.11 a 113.664.19 84.159.57 74.8016.66 a 94.0710.08 68.848.88 66.3111.61 a 90.473.17 79.8810.09 66.5317.79 a1.041.26 (meanSD n=3)The effect of herbs serum of Liuwei Diduang Bolus combining with 10%tk/GCV system10%tk/GCV system on CBRH7919(MTT assay)（Serum:24h）血清（血清（%）GCV GCV 20%tk/GCV(0M)(39.2M)(39.2M)对照对照 对照对照 对照对照 含药含药 含药含药 含药含药 Q Q值值057.5100.001.30 73.107.93 60.9511.83 67.264.50 64.544.01 46.893.84 83.298.89 70.459.14 41.934.54 a81.736.96 76.566.36 58.155.87 96.404.92 81.013.90 64.658.43 1.020.82 (meanSD n=3)The effect of herbs serum of Liuwei Diduang Bolus combining with 20%tk/GCV system20%tk/GCV system on CBRH7919(MTT assay)(Serum:12h)血清（血清（%）GCV GCV 10%tk/GCV(0M)(39.2M)(39.2M)Q Q值值0510100.003.88 94.912.65 85.5111.41 105.051.69 92.844.24 78.494.62b 106.444.70 98.146.40 71.222.33ac 1.161.49 (meanSD n=6)The effect of herbs serum of Liuwei Diduang Bolus combining with 10%tk/GCV system on CBRH7919(MTT assay:dose-effect relationship)(Serum:12h)六味地黄丸含药血清联合六味地黄丸含药血清联合10%tk/GCV系统对肝系统对肝癌细胞生长的影响作用（癌细胞生长的影响作用（MTT法法;量效关系）量效关系）六味地黄丸药物血清联合不同比例六味地黄丸药物血清联合不同比例tk/GCV系统对大鼠肝癌细胞的作用系统对大鼠肝癌细胞的作用观察实验小结观察实验小结通过以上实验通过以上实验,七天血清七天血清:六味地黄丸含六味地黄丸含药血清联合药血清联合10%tk/GCV系统的协同杀伤系统的协同杀伤作用效果较好作用效果较好;血清孵育血清孵育12h是药效较好是药效较好的时间点的时间点;四天血清四天血清:协同杀伤作用呈现协同杀伤作用呈现剂量依赖性剂量依赖性,随血清浓度升高协同作用随血清浓度升高协同作用增强增强(P0.01)（二）中药活性成分对自杀基因（二）中药活性成分对自杀基因旁观者效应影响的体外筛选旁观者效应影响的体外筛选对丹参注射液（含水溶性混合成分）、对丹参注射液（含水溶性混合成分）、苦参苦参碱、三七总皂甙、芹黄素、白藜芦醇、姜碱、三七总皂甙、芹黄素、白藜芦醇、姜黄素、丹参素、小檗碱、苦参碱、大黄素、黄素、丹参素、小檗碱、苦参碱、大黄素、木犀草素、黄芩苷、木犀草素、黄芩苷、山奈素、山奈素、枸杞多糖枸杞多糖等等进行了筛选实验。进行了筛选实验。肿瘤自杀基因治疗系统的改进工作肿瘤自杀基因治疗系统的改进工作 重组质粒的构建方案重组质粒的构建方案 EcoR/BmHEcoR/XmatkcDNAXmatkcDNA(无终止密码)EcoR I-Xma I gfpcDNA Xma I EcoR I 质粒质粒pTKGFP构建流程图构建流程图B16/pTKGFP(tk+)B16/pEGFP-N1B16/pDsRed2-N1(tk-)(tk-)合作者 李杰芬谭宇蕙李杰芬谭宇蕙 吴映雅吴映雅易易 华华 杨巧红赵杨巧红赵 鹏鹏 王惠峰袁王惠峰袁 静静 宁异真宁异真 张爱娟张爱娟谢谢！