拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定.doc

遗传学实验报告
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
一、实验目的：
1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能
2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理
1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）
十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
Ø 植株形态个体小高度只有30cm左右；
Ø 生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；
Ø 种子多，每株可产生数千粒种子；
Ø 形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；
Ø 遗传转化简单，转化效率高；
Ø 基因组小，只有5对染色体，125MB；
Ø 在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物 。
2、突变体
突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理
T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组 。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定

图 1 结果鉴定 图 2 PCR引物设计
三、实验材料
1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；
2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；
3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
四、实验步骤
1、植物DNA提取方法（CTAB法）
1) 水浴加热CTAB提取液至65℃ ；
2) 取叶片100mg, 液氮研磨成粉末；
3) 加入600µl CTAB提取液并混匀；
4) 65 ℃水浴45min（至少30min）；
5) 12,000rpm 离心10min；
6) 将上清转移到新离心管，加入等体积氯仿/异戊醇, 混匀；
7) 12,000rpm离心5-10min, 将上清液转移到新管中；
8) 向上清中加入1/10体积3M NaAc,再加入预冷的等体积异丙醇或2V无水乙醇, 混匀冰上放置10min；
9) 12,000rpm 离心10min，弃上清，加入500µl 70％乙醇洗涤2min；
10) 12,000rpm 离心5min，弃上清，吸干残留并干燥；
11) 加20-50 µl TE缓冲液溶解DNA。
2、PCR反应
1)引物设计
Ø LP: 5’-TCA TCC ACC ATG GAA GAA AAG
Ø RP: 5’-TTG GAT ACG ATG CGA GTA AAC
Ø BP: 5’- TTG TTC ACG TAG TGG GCC ATC G
Ø LP+RP:1107bp
Ø BP+RP: 560-860bp
2）PCR 反应体系
Ø H2O: 12.4 μl
Ø 10×Buffer: 2 μl
Ø dNTP: 0.5 μl
Ø MgCl2: 2 μl
Ø LP/BP: 0.5 μl
Ø RP: 0.5 μl
Ø Taq: 0.1 μl
Ø DNA: 2 μl
Ø Total: 20 μl
3)PCR温度设定
Ø 94℃ 5min
Ø 33 cycle
n 变性：94℃ 30s
n 退火：53℃ 30s
n 延伸：72℃ 1min30s
Ø 72℃ 7min
3、琼脂糖凝胶电泳分析
1) 500-1000bp：1.2%，Agarose 0.5×TBE；
2) 化胶时应注意不能沸出，冷却至约60℃制胶，凝胶充分冷却凝固后点样进行电泳；
3) PCR产物加3-4 μl 6×loading buffer；
4) 120V稳压电泳；
5) EB染色10min，紫外观察。
五、结果分析
PCR产物电泳截图结果如下图所示。
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图 3 PCR产物电泳条带图

在图3，第7泳道为DL 2000 DNA marker，第5泳道是BP-RP引物体系，第六泳道是LP-RP引物体系。BP-RP体系的PCR产物产生一条略大于750bp的DNA条带，而LP-RP引物体系中没有在大致900bp的位置产生条带。由此，可以断定此样品为纯和突变体。
六、思考与讨论
1、加液氮碾磨叶片时，最好保持离心管中始终有液体氮存在，如果碾磨一段时间后中途要加液氮继续碾磨，一定注意，液氮沸腾时极易将已经碾磨好的叶片吹走；另一点，碾磨时要迅速，避免空气中的水汽在离心管上凝结。本次试验中，离心管出现了冰霜，可能对最后的结果有影响。
2、DNA有一定的物理脆性，所以在提取过程中混匀时一定要缓慢的摇晃，切忌剧烈震荡。 3、加液氮碾磨时，注意不要将叶片挤到离心管的底部，那样会导致碾磨不充分。遇到这种情况，建议重做。
4、 PCR中所需的各种试剂都应避免污染，而且尽量减少冻融的次数。

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