超高效液相色谱-串联质谱法检测食品中腰果过敏原_宁亚维.pdf

安全检测 食品科学 2023,Vol.44,No.04 329超高效液相色谱-串联质谱法检测食品中 腰果过敏原宁亚维1，杨 正1，马俊美2，刘 茁1，陈 佳3,*，李 强2,*（1.河北科技大学食品与生物学院，河北 石家庄 050018；2.河北省食品检验研究院，河北 石家庄 050000；3.石家庄学院化工学院，河北 石家庄 050035）摘 要：基于超高效液相色谱-串联质谱系统建立食品中腰果过敏原的定量检测方法。腰果经提取、胰蛋白酶酶解、净化后，经Easy-nLC 1000纳升液相色谱分离，随后进入四极杆-静电场轨道离子阱高分辨质谱以全扫描模式进行数据采集，使用ProteinPilot软件结合Uniprot蛋白数据库对样品扫描结果进行分析，并基于基本局部比对搜索工具（BLAST）验证肽段特异性，最终筛选出6 条腰果特异性肽段，利用超高效液相色谱-三重四极杆质谱系统的多反应监测模式对实际样品进行检测。结果表明，该方法在0.00510 mg/mL范围内线性关系良好，R2均大于0.99，固体基质中定量限为2.55 mg/kg，饮料基质中定量限为0.0050.01 mg/mL，平均回收率在82.5%109.9%之间，相对标准偏差不大于8.9%。该方法灵敏度高、特异性好，可用于饼干、面包、蛋糕、桃酥、巧克力和饮料6 种食品基质中的腰果过敏原检测。关键词：超高效液相色谱-串联质谱；腰果过敏原；检测Detection of Cashew Allergens in Foods by Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryNING Yawei1,YANG Zheng1,MA Junmei2,LIU Zhuo1,CHEN Jia3,*,LI Qiang2,*(1.College of Food and Biology,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China;2.Hebei Food Inspection and Research Institute,Shijiazhuang 050000,China;3.Institute of Chemical Technology,Shijiazhuang University,Shijiazhuang 050035,China)Abstract:A quantitative method for the detection of cashew allergens in foods was established based on ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).Cashew samples were extracted,trypsinized,purified,and separated using an Easy nLC 1000 nano-liquid chromatograph,and then data were collected in the full-scan acquisition mode by quadrupole/orbitrap high-resolution mass spectrometry.The scanning results were analyzed by ProteinPilot software search against the UniProt protein database,and the peptide specificity was verified using the basic local alignment search tool(BLAST).Finally,six cashew specific peptides were selected,and actual samples were detected by UPLC-quadrupole/orbitrap MS in the multi-reaction monitoring(MRM)mode.The results showed that the proposed method had good linearity in the range of 0.00510 mg/mL with correlation coefficients(R2)greater than 0.99.The quantitation limit was 2.55 mg/kg and 0.0050.01 mg/mL for solid-state and beverage matrices,respectively.The average recoveries were 82.5%109.9%,and the relative standard deviation(RSD)was not more than 8.9%.This method has high sensitivity and specificity,and it can be used for the detection of cashew allergens in six food substrates including biscuit,bread,cake,walnut cookie,chocolate and beverage.Keywords:ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry;cashew allergens;detectionDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220411-119中图分类号：TS20 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）04-0329-08收稿日期：2022-04-11基金项目：河北省“三三三人才工程”资助项目（A202005015）；河北省重点研发计划项目（20327125D）第一作者简介：宁亚维（1983）（ORCID:0000-0003-1128-6940），女，教授，博士，研究方向为食品生物技术与食品安全。E-mail:*通信作者简介：陈佳（1982）（ORCID:0000-0001-9714-1843），女，讲师，博士，研究方向为食品生物技术与安全。E-mail:chenjia-李强（1981）（ORCID:0000-0001-5744-1403），男，正高级工程师，硕士，研究方向为食品安全。E-mail:330 2023,Vol.44,No.04 食品科学 安全检测引文格式：宁亚维,杨正,马俊美,等.超高效液相色谱-串联质谱法检测食品中腰果过敏原J.食品科学,2023,44(4):329-336.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220411-119.http:/NING Yawei,YANG Zheng,MA Junmei,et al.Detection of cashew allergens in foods by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometryJ.Food Science,2023,44(4):329-336.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220411-119.http:/近年来，食物过敏在世界范围内的发生率呈现上升趋势，食物过敏已成为仅次于微生物污染的第2大食品安全问题1。据数据研究显示，食物过敏在成年人中的患病率约为5%，儿童由于自身的免疫系统尚未发育成熟，患病率约为8%2。当患者接触过敏原时，典型的过敏症状包括呕吐、腹泻、呼吸困难以及皮肤表面出现荨麻疹等，但也有患者出现比较严重的过敏性休克等危及生命的症状3。现阶段对于食物过敏尚无有效的治疗手段，避免接触食物过敏原是避免消费者诱发过敏反应的唯一方法4。为了给消费者提供更可靠的食品信息，各国均制定了严格的食品过敏原标注要求5-7，但由于各国对食品标签要求不尽相同，因此过敏原信息标注存在差异，同时食品标签难以对食品在生产、运输和贮存过程中由于交叉污染而产生的隐性过敏原进行标注，这给过敏人群造成了潜在的风险8。为了帮助过敏患者规避食品中的过敏原，同时监督食品标签准确性，开发食品过敏原高灵敏度检测方法十分重要。常见的食品过敏原主要包括花生、鸡蛋、牛奶、大豆、坚果、含麸质的谷物、鱼类和贝类八大类9。腰果与核桃、杏仁和榛子并称为世界四大坚果10，具有丰富的营养价值。然而腰果中存在坚果过敏原，可引起体温下降、腹部疼痛、全身瘙痒及呼吸困难的食物过敏症状11。现阶段用于腰果过敏原的检测技术主要有酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法12-13、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）法14-15 以及液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectromotry，LC-MS）法16-19。其中，ELISA为现阶段过敏原检测技术中最为成熟的方法。该方法以致敏蛋白为检测依据，基于抗原和抗体间的特异性结合反应进行检测。Zhao Yiqing等12以Ana o 3为蛋白标记物，开发了一种双抗体夹心ELISA法用于检测预包装食品中的残留腰果成分。在饼干基质和巧克力基质中的定量限（limit of quantitation，LOQ）分别为40 mg/kg和4 mg/kg，在巧克力中回收率为74.0%87.7%，但在饼干中的回收率仅为40.2%44.9%，回收率较低。由此可见尽管ELISA技术检测过敏原存在具有特异性强、灵敏度高的优势，但针对经过烹煮、煎炒等高强度加工处理的食品，通常会因特异性结合表位的损伤而导致致敏蛋白难以被特异性抗体识别，因而存在假阴性结果20。PCR法依赖致敏蛋白的DNA进行检测，避免了加工手段对致敏蛋白检测的影响，但该方法通过DNA间接检测致敏蛋白，且核酸在提取过程中易于受到污染而出现假阳性结果21。而食品在加工过程中不会造成蛋白质一级结构氨基酸序列的改变，因此基于过敏原特征肽段的质谱检测技术可以改善ELISA的假阴性和PCR假阳性的问题，具有较好地开发潜力。目前使用液相色谱-串联质谱法检测腰果过敏原的文献已有报道，Bignardi等16选取VFDCGVR为腰果特异性肽段，利用液相色谱-电喷雾串联质谱法结合快速固相萃取技术，提高了饼干和巧克力中腰果的检测灵敏度，其中在巧克力中腰果的定量限为50 mg/kg；Bignardi等22建立了液相色谱-串联质谱检测法检测加工食品中的腰果过敏原，定量限为10 mg/kg；Lee等23采用液相色谱-质谱法结合多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）技术显著提高了检测饼干中的腰果过敏原，定量限为46 mg/kg。近年来，我国研究人员也逐渐对LC-MS联用技术检测食品过敏原引起重视，在2019年颁布了GB/T 381632019常见过敏蛋白的测定 液相色谱-串联质谱法，标准中规定了固态食品中牛奶、鸡蛋、花生、榛子、杏仁、大豆和核桃过敏蛋白的液相色谱-质谱检测法，但目前我国还没有针对液相色谱-质谱检测腰果过敏原的相关报道。基于质谱技术在过敏原检测中准确、稳定且高效的优点，本研究采用Easy-nLC 1000纳升液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（Easy-nLC 1000-Q-Exactive）筛选腰果过敏原特异性肽段，并通过超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱，拟建立基于特征肽段的腰果过敏原MRM模式检测方法，用于多种食品基质中腰果过敏原的快速筛查和定量检测。1 材料与方法1.1 材料与试剂三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷（T r i s）、二 硫 苏 糖 醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、碳酸氢铵（均为分析纯）美国Sigma-Aldrich公司；尿素（分析纯）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；正己烷、乙腈（均为质谱级）美国Fisher Scientific公司；TPCK-胰蛋白酶（生物级）美国AB 安全检测 食品科学 2023,Vol.44,No.04 331SCIEX公司；甲酸（色谱纯）天津科密欧化学试剂有限公司；超纯水由Millipore纯水机制备；腰果、饼干、面包、蛋糕、桃酥、巧克力、饮料等食品随机购买于当地超市。1.2 仪器与设备Easy-nLC 1000-Q-Exactive纳升液相色谱-串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱、C18色谱柱（2.1 mm100 mm，2.6 m）、超滤离心管（10 kDa）美国Thermo Scientific公司；Utimate3000-Qtrap5500超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱 美国AB SCIEX公司 C18富集柱（100 m4 cm，5 m，120）、C18分析柱（75 m15 cm，5 m，120）北京乐润峰科技有限 公司；低蛋白吸附样品瓶（250 L）美国Waters公司。1.3 方法1.3.1 标准储备液的制备称取2 g（精确至0.001 g）生腰果样品于豆浆机中，加入50 mL水，使用豆浆机磨浆5 min，直至腰果颗粒完全溶解。将溶液转移至100 mL容量瓶中，加水定容，配制成20 mg/mL的腰果标准储备液，保存于4 备用。1.3.2 样品前处理称取1 g（精确至0.001 g）经过研磨机研磨成粉末的样品置于50 mL离心管，加入5 mL正己烷除脂，震荡混匀15 min，4 000g离心15 min，弃去3 mL上清液，重复脱脂操作2 次。样品用氮气吹干后，加入4 mL提取缓冲液（含2 mol/L尿素的50 mmol/L Tris溶液），旋转振荡提取1 h，然后6 000g离心20 min。移取500 L上清液至2 mL离心管中，加入10 L还原剂（500 mmol/L DTT），混匀后置于60 水浴锅中振荡反应30 min。将上述样品混合物冷却至室温后，加入30 L烷基化试剂（500 mmol/L IAA）暗处反应30 min，然后加入430 L的酶解缓冲液（500 mmol/L的碳酸氢铵溶液和 1 mol/L的氯化钙溶液）和20 L胰蛋白酶（500 g/mL），混匀后置于37 水浴锅孵育过夜。加入10 L甲酸停止酶解反应后，将混合物于12 000g离心8 min，并将上清液转移至10 kDa超滤离心管，14 400g离心20 min以净化蛋白。最后，收集滤液进行分析（所有试剂均使用Watsons蒸馏水配制）。1.3.3 Easy-nLC 1000-Q Exactive测定条件色谱条件：预柱：C18色谱柱（100 m4 cm，5 m，1 2 0 ）；分 析 柱：C1 8毛 细 色 谱 柱（75 m15 cm，5 m，120）；流动相A为0.1%甲酸，流动相B为乙腈；洗脱程序：03 min，97%93%A，3%7%B；338 min，93%78%A，7%2 2%B；3 8 4 8 m i n，7 8%6 5%A，2 2%3 5%B；48 50 min，65%10%A，35%90%B；5060 min，10%A，90%B；流速300 L/min；进样体积2 L。质谱条件：Nanospray Flix电离源，正离子模式；扫描模式为Full MS/dd-MS2；Full MS分辨率70 000；AGC target为1106；质量扫描范围m/z 3501 800；dd-MS2分辨率17 500；AGC target为1105；隔离窗口为m/z 2.0；Fixed first mass为m/z 120.0；碰撞能量27 eV。1.3.4 Utimate 3000-Qtrap 5500测定条件色谱条件：C18色谱柱（2.1 mm100 mm，2.6 m）；柱温40；流动相A为0.1%甲酸，流动相B为0.1%甲酸-乙腈；洗脱程序：01.3 min，98%A，2%B；1.311 min，98%60%A，2%40%B；1112.5 min，60%2%A，40%98%B；12.514.4 min，2%A，98%B；14.414.6 min，2%98%A，98%2%B；14.620 min，98%A，2%B；流速300 L/min；进样体积5 L。质谱条件：电喷雾离子源（正离子）；MRM；离子化电压4 000 V；雾化气压力55 psi；辅助气压力55 psi；气帘气压力30 psi；离子源温度450。1.3.5 方法学验证1.3.5.1 线性关系、检出限、定量限按照1.3.2节中的前处理步骤得到空白基质提取液，随后使用空白基质提取液将腰果标准储备液（20 mg/mL）稀释至质量浓度为0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mg/mL的溶液。各质量浓度样品分别取500 L加入2 mL离心管中，经1.3.2节中的还原、烷基化和酶解后得到酶解液。之后加10 L的甲酸停止消化，于12 000g离心8 min，取上清液过0.22 m MCM滤膜，收集滤液进行LC-MS/MS分析。以特征肽段的色谱峰面积作为纵坐标（Y），腰果的质量浓度为横坐标（X）计算线性方程，每个样品设置4 个平行。特征肽段的信噪比为3时对应的腰果质量浓度记为检出限（limit of detection，LOD）；当特征肽段的信噪比为10时，腰果对应的质量浓度记为LOQ。1.3.5.2 加标回收率向空白基质中添加腰果标准储备液以测定回收率，添加量为腰果特征肽段的2、10、20 倍LOQ 3 个水平，每个质量浓度设置6 个平行以计算方法精密度。1.3.5.3 基质效应筛选配料表中不含腰果以及经检测后不含腰果的饼干、面包、蛋糕、桃酥、巧克力和饮料样品作为空白基质，精密移取一定量的腰果标准储备液，用空白基质提取液梯度稀释配成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mg/mL的标准曲线溶液用于计算基质效应。基质效应按下式计算：332 2023,Vol.44,No.04 食品科学 安全检测slopematrixslopestandard100基质效应/%=式中：slopematrix为空白基质标准曲线的斜率；slopestandard为水溶剂标准曲线的斜率。1.3.6 实际样品检测将固体样品研磨成均匀粉末后称取1 g，液体样品直接移取500 L，然后按照1.3.2节方法进行前处理，用所建立方法对样品中的腰果含量进行定量。2 结果与分析2.1 腰果特征肽段的筛选利用Q-Exactive高分辨率、高精确度的优势，在Full MS/dd-MS2扫描模式下对样品进行全扫描。基于Uniprot数据库中全面的腰果蛋白信息，结合ProteinPilotTM软件强大的Paragon算法，综合考虑生物学修饰、错切漏切和样本特异性等因素，对扫描结果进行分析处理，在得到大量肽段信息中筛选最佳的腰果特异性肽段。特征肽段的选择是液相色谱-串联质谱法检测食品过敏原中的关键一步，为了保证检验方法的稳定性和准确性，筛选到的特征肽段需要满足以下几点24-27：首先肽段的长度应在825 个氨基酸之间；其次肽段应不含错切和漏切的酶切位点，并且不含任何蛋白质修饰的位点28。同时，筛选到的肽段要经过BLAST搜索验证肽段特异性，确保其为腰果特有肽段。目前已鉴定的腰果过敏原蛋白有3 种，分别为Ana o 129、Ana o 230和Ana o 331，其氨基酸序列如图1所示。为了能够全面的检测食品中的腰果过敏原，本研究基于上述肽段筛选原则，针对每种腰果过敏原均筛选了2 条肽段，其中，AFSWEILEAALK和YGQLFEAER肽段对应于Ana o 1，这是首次筛选出腰果Ana o 1的肽段；ADIYTPEVGR和GQVQVVDNFGNR肽段对应于Ana o 2；ELYETASELPR和QFEEQQR对应于Ana o 3。筛选到的6 条肽段长度适中，特异性好，不易于降解；同时不含蛋白质修饰位点，不易于在蒸煮、烧烤和辐照等加工过程中发生成环、氧化和交联等副反应，影响定性及定量检测结果28；此外，所筛选的肽段经过BLAST搜索验证证实具有高度特异性。同时，为了进一步验证所筛选肽段是否只存在于腰果中，制备了花生、杏仁、核桃、芝麻、葵花籽、开心果和榛子等常见坚果的酶解样品验证腰果肽段特异性，结果显示，所筛选的6 条腰果肽段均只在腰果酶解样品中检测到，而其他坚果酶解样品均显示未检出，进一步验证了肽段特异性。图 1 Ana o 1、Ana o 2和Ana o 3的氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequences of Ana o 1,Ana o 2 and Ana o 32.2 质谱参数及液相色谱条件的优化目标蛋白的定量检测依赖于MRM模式，该模式的显著优点是具有较高灵敏度和特异性，能够对复杂基质中的微量靶向蛋白进行准确鉴定。为了提高特征肽段的检测灵敏度和稳定性，本研究对液相色谱条件和MRM质谱参数进行优化。首先以全扫描模式确定各特征肽段的准确母离子数，分别对其母离子进行二级扫描，筛选响应值较高的子离子，每个肽段选择了3 个子离子，响应值高且更加稳定的子离子作为定量离子，另外2 个子离子用于辅助定性。进一步优化每个子离子的碰撞能量、碎裂电压等参数，得到的质谱参数优化结果如表1所示。表 1 腰果特征肽段的MRM参数Table 1 MRM mass spectrometric parameters for cashew specific peptides过敏原名称Uniprot索引名称肽段母离子（m/z）子离子（m/z）碰撞能量/eV碎裂电压/VAna o 1Q8L5L5AFSWEILEAALK689.38219.11*82.530.0644.4031.0886.5330.8YGQLFEAER556.77651.31*72.025.2349.1526.2764.3925.8Ana o 2Q8GZP6ADIYTPEVGR560.79557.30*71.025.2658.3525.0821.4224.2GQVQVVDNFGNR666.84821.39*77.532.0722.3230.8920.4633.8Ana o 3Q8H2B8ELYETASELPR654.33385.26*76.830.0272.1730.0601.3329.2QFEEQQR482.73175.12*66.233.2560.2827.0689.7326.9注：*.定量离子。安全检测 食品科学 2023,Vol.44,No.04 333比较乙腈-水和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸分别作为流动相时肽段的峰形，以AFSWEILEAALK肽段为例，当使用乙腈-水作为流动相时，有明显拖尾（图2A）；当流动相为0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸时肽段的峰形更佳，拖尾现象明显改善（图2B）。优化后6 条特征肽段的提取离子流图如图3所示。在相同浓度下的腰果酶解样品中，ADIYTPEVGR肽段的响应值最高。综合肽段的灵敏度以及稳定性，将ADIYTPEVGR作为腰果的定量肽段。02468101214161820时间/min0.00.40.81.21.62.02.42.8强度(106)3.213.08A02468101214161820时间/min强度(106)0.00.20.40.60.81.01.21.414.87BA.乙腈-水：B.0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸。图 2 AFSWEILEAALK肽段流动相优化图Fig.2 Optimization of mobile phase for separation of peptide AFSWEILEAALK 0.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.013.11AFSWEILEAALK02468101214161820时间/min强度(105)0.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.02.29.47YGQLFEAER02468101214161820时间/min强度(106)0.00.40.81.21.62.02.42.83.28.99ADIYTPEVGR02468101214161820时间/min强度(106)0123456789.08GQVQVVDNFGNRAER02468101214161820时间/min强度(105)0.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.02.22.49.43ELYETASELPR02468101214161820时间/min强度(106)0123456786.59QFEEQQR 02468101214161820时间/min强度(105)图 3 腰果6 条特征肽段提取离子流图Fig.3 Extracted ion current chromatograms of six cashew specific peptides2.3 方法学验证2.3.1 线性范围、LOD和LOQ结果为了评估方法的灵敏度，对方法的线性范围、LOD和LOQ进行测定。如表2所示，所筛选的6 条特异性肽段中，AFSWEILEAALK、ADIYTPEVGR和ELYETASELPR三条肽段的灵敏度较高，在固体基质中的LOD和LOQ分别为1 mg/kg和2.5 mg/kg；饮料基质中的LOD和LOQ分别为0.002 mg/mL和0.005 mg/mL。YGQLFEAER、GQVQVVDNFGNR和QFEEQQR三条肽段灵敏度较低，在固体基质中的LOD和LOQ分别为2 mg/kg和5 mg/kg；在饮料基质中的LOD和LOQ为0.005 mg/mL和0.01 mg/mL。筛选的6 条腰果肽段在饼干、面包、蛋糕、桃酥、巧克力和饮料6 种基质中的线性良好，标准曲线的相关性系数均大于0.99。334 2023,Vol.44,No.04 食品科学 安全检测腰果的LOQ为2.5 mg/kg，说明本研究方法具有较高的灵敏度。另外本方法选取ADIYTPEVGR肽段作为定量肽段，AFSWEILEAALK、YGQLFEAER、GQVQVVDNFGNR、ELYETASELPR、QFEEQQR肽段用于辅助定性，能够更准确地检测食品中腰果过敏原，避免腰果成分误检和漏检。表 2 腰果特征肽段不同基质中的线性关系Table 2 Linear calibration equations for determination of cashew specific peptides in different matrices肽段线性范围/（mg/mL）基质标准曲线R2（n=3）LOD/（mg/kg）LOQ/（mg/kg）AFSWEILEAALK0.0055饼干Y=4.619 65104X11 417.985 580.996 3612.5面包Y=4.677 55104X3 616.534 850.994 5712.5蛋糕Y=4.510 63104X1 240.478 400.998 0812.5桃酥Y=4.581 14104X1 118.406 820.994 9512.5巧克力Y=3.026 94104X745.304 790.996 5412.5饮料Y=15 609.730 17X2 804.952 900.998 200.0020.005YGQLFEAER0.0110饼干Y=24 739.812 59X3 364.901 380.993 9325面包Y=28 305.627 13X665.245 690.999 3825蛋糕Y=29 151.157 10X420.077 600.999 0025桃酥Y=29 180.901 89X176.466 000.995 3125巧克力Y=18 536.133 67X132.082 450.997 5825饮料Y=25 944.923 49X297.896 930.998 680.0050.01ADIYTPEVGR0.00510饼干Y=4.226 54105X15 487.420 340.998 2612.5面包Y=3.831 41105X6 577.654 330.995 3912.5蛋糕Y=4.111 20105X2 211.141 380.996 4212.5桃酥Y=3.850 99105X2 801.644 140.997 5212.5巧克力Y=3.106 28105X705.496 320.992 5512.5饮料Y=4.033 11105X1 200.617 300.995 960.0020.005GQVQVVDNFGNR0.0110饼干Y=9.031 81104X8 413.238 100.998 4625面包Y=8.276 84104X2 104.526 000.998 7225蛋糕Y=8.405 36104X5 638.604 440.996 5825桃酥Y=5.449 67104X1 313.406 970.994 2325巧克力Y=6.929 18104X4 933.374 000.994 3125饮料Y=8.119 41104X3 147.040 140.997 900.0050.01ELYETASELPR0.00510饼干Y=3.644 36105X4.529 631040.998 5212.5面包Y=3.865 81105X23 202.069 990.998 8212.5蛋糕Y=4.111 20105X2 211.141 380.996 4212.5桃酥Y=4.190 77105X2 755.739 030.994 2112.5巧克力Y=2.657 95105X9 260.061 880.997 7012.5饮料Y=1.536 29105X610.721 500.995 940.0020.005QFEEQQR0.0210饼干Y=5.034 04104X3 126.335 920.998 6025面包Y=4.590 26104X713.700 560.998 2025蛋糕Y=5.205 01104X1 224.930 570.999 3425桃酥Y=4.822 72104X85.485 850.997 2225巧克力Y=4.400 09104X2 623.619 450.998 2025饮料Y=24 372.956 68X103.853 030.998 540.0050.01注：饮料基质的LOD、LOQ单位为mg/mL。2.3.2 加标回收率结果为了对方法的准确性和重复性进行验证，向空白基质中添加腰果标准储备液进行回收率的测定，结果如表3、4所示，6 条腰果特征肽段在饼干、面包、蛋糕、桃酥、巧克力和饮料6 种食品基质中的加标回收率为82.5%109.9%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.9%8.9%，均小于12%。证明此方法具有较高的可重复性和稳定性，可以用于不同食品基质中腰果过敏原成分测定。表 3 腰果肽段在饮料基质中的加标回收率Table 3 Recoveries of added cashew peptides in beverage matrix肽段加标量/（mg/mL）回收率/%RSD/%AFSWEILEAALK0.0191.93.60.0291.07.80.192.35.9YGQLFEAER0.02101.14.50.04100.18.90.284.85.1ADIYTPEVGR0.0196.88.90.02100.46.80.182.50.9GQVQVVDNFGNR0.0297.32.90.04104.36.50.288.14.9ELYETASELPR0.0199.94.60.02101.56.10.1109.63.1QFEEQQR0.02104.53.40.0494.92.10.291.14.1表 4 腰果肽段不同固体基质中的加标回收率Table 4 Recoveries of added cashew peptides in different solid matrices肽段加标量/（mg/kg）饼干面包蛋糕桃酥巧克力回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%AFSWEILEAALK597.3 2.3 96.4 2.7 93.8 3.7 93.5 4.9 97.9 5.9 1096.3 3.2 105.1 2.7 102.9 2.1 102.7 4.4 106.4 1.3 5098.5 1.6 93.0 6.0 105.1 3.8 91.1 5.0 92.1 4.5 YGQLFEAER1098.6 3.0 99.2 3.4 99.0 5.8 95.2 1.9 93.4 3.3 20104.6 5.4 105.7 2.7 102.8 4.9 102.5 3.7 86.7 4.6 10097.4 2.6 103.9 1.5 103.4 2.3 98.0 2.5 95.6 3.1 ADIYTPEVGR594.4 2.6 90.9 4.6 102.0 5.5 109.9 1.6 88.8 6.1 10102.3 4.0 97.5 2.2 104.9 2.4 102.6 2.0 93.1 3.6 50104.2 4.2 103.3 2.2 94.5 4.6 93.8 2.2 97.9 3.6 GQVQVVDNFGNR10102.5 4.1 106.2 4.3 96.9 3.9 98.1 4.7 92.1 5.4 20103.2 4.9 99.3 3.9 104.2 8.8 102.7 1.7 97.5 6.8 10093.7 4.1 96.1 2.6 107.0 6.0 85.9 3.1 86.6 2.1 ELYETASELPR596.2 2.1 91.5 2.3 92.8 5.1 98.5 3.9 97.6 5.1 1097.9 2.1 101.4 2.9 103.8 3.1 107.7 2.7 85.1 4.1 50107.3 6.7 108.1 3.1 94.8 6.0 97.9 7.9 109.5 6.8 QFEEQQR1098.1 3.6 98.8 2.7 104.1 2.4 98.1 2.7 102.4 3.4 20109.3 3.9 103.0 4.9 103.6 5.8 106.1 5.2 107.3 5.8 100104.8 2.7 96.6 5.5 99.6 3.9 91.4 3.1 99.6 4.3 2.3.3 基质效应食品基质可能对肽段检测产生干扰影响检测准确性，因此测定3 个肽段在6 种基质中的基质效应，结果显安全检测 食品科学 2023,Vol.44,No.04 335示（表5）：饼干、面包、蛋糕、桃酥和饮料5 种基质的基质效应均大于100%，说明这5 种基质对腰果肽段的检测具有增益作用，巧克力基质的基质效应小于100%，说明巧克力对腰果肽段的检测具有抑制作用，原因可能为巧克力中较为复杂的单宁和鞣酸等成分对肽段的离子化产生了影响。因此，本方法采用基质配标以补偿基质效应。表 5 腰果肽段在不同基质中的基质效应Table 5 Matrix effects of cashew specific peptides in different matrices过敏原肽段基质基质效应/%Ana o 1AFSWEILEAALK饼干113.31巧克力85.21面包109.73蛋糕110.48桃酥110.54饮料105.3