有关物质分析方法验证方案.doc

8

***原料有关物质分析方法验证方案

20**年**月

验证方案的起草与审批
验证小组成员
部门
人员
职责

验证小组组长
部门
人员
职责

负责组织起草验证方案并按批准方案组织实施；督促验证人员做好记录；负责各阶段验证结果汇总及评价、组织起草验证报告；组织相关培训
方案审核
审核
签名及日期
验证委员会

方案批准
批准人
批准日期

方案实施日期：
目 录
1. 验证目的 4
2. 方法简介与确认范围 4
3. 标准品、供试品 4
4. 风险评估 4
5. 验证的可接受标准 4
6. 验证步骤 4
6.1系统适应性 4
6.2专属性 6
6.3检测限与定量限 8
6.4线性 9
6.5准确度 9
6.6精密度 10
6.6范围 10
6.7耐用性 10
6.8样品测定 11
7.偏差 11
8.风险的接收与评审 11
9.再验证 11
10.确认结果评审和结论 11
11.更改历史 12
12. 附录 12
1. 验证目的
根据法规的要求，采用非药典或其它法规未收载的分析方法应进行验证，证明采用的方法适合于相应的检测要求。
这个验证方案的目的是为验证提供具体方法参数、可接受标准和研究步骤。
2. 方法简介与确认范围
***原料有关物质检测方法为自行开发的液相室色谱方法。为确保方法的准确性和可行性，为日常检测方法提供依据，现对该方法进行验证。方法验证必须按照验证方案进行，此次验证方案提供***原料含量分析方法验证验证，包括：专属性、精密度、线性、范围准确度、检测限&定量限、耐用性。
3. 标准品、供试品
3.1标准品
名称
批号
来源

3.2供试品
名称
批号
来源

4. 风险评估
按照《质量风险管理规程》，质量控制部和质量管理部共同对分析方法进行了风险评估，确定了需进行方法确认的项目。具体见下表：
风险
因素
风险
可能影响效应
现有控制措施
S
P
D
RPN
风险级别
建议采取措施
专属性
不具有专属性
分离度不好，影响杂质定量
每次试验测试分离度
3
3
3
27
中
首次使用前，对专属性进行验证
定量限与检测限
定量限高
小的杂质不能被检出
无
3
3
3
27
中
对该方法的定量限进行验证。
精密度
精密度差
不同时间或人员测定的结果不一致
每次测试前进行系统适用性测试
3
3
3
27
中
首次使用前，对精密度进行验证
准确度
回收率低
杂质结果不准确
无
3
3
3
27
中
首次使用前，对准确度进行验证
线性
线性不好
杂质结果不准确
无
3
3
3
27
中
首次使用前，对线性进行验证
范围
范围窄
浓度超过范围后结果不准确
无
3
3
3
27
中
首次使用前对范围进行验证
耐用性
耐用性差
参数微小变化对结果影响很大
无
3
3
3
27
中
首次使用前，对耐用性进行验证
风险评估人：
评估日期：
5. 验证的可接受标准
项目
可接受标准
专属性
空白无干扰，主峰与相邻峰之间的分离度不小于1.5，峰纯度应不小于0.990.
检测限与定量限
≤0.05%
线性
R≥0.999
准确度
回收率在0.05%~质量指标的140%范围内
精密度
重复性RSD%≤10.0%
中间精密度RSD%≤10.0%
精密度：两组数据平均检测结果的相对偏差≤20.0%
范围
应至少为指标的80%~120%
耐用性
评估柱温、流速、色谱柱、缓冲盐pH、有机相比例、流动相比例、溶液放置时间对检测结果的影响
6. 验证步骤
6.1系统适应性
分离度测试液：取***产品分离度标准品5mg，置于一比色管中，加稀释液10ml溶解，在95℃下水浴加热30分钟，放冷。
标准液：取***产品标准品25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度；精密移取1ml，置于一100ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度。
取分离度测试液进样，记录色谱图，***产品与***Δ-3异构体之间的分离度应不小于2.0。
取标准液进样，记录色谱图，***产品主峰拖尾因子应不大于2.0，理论塔板数应不低于3000；标准液连续进样6次，主峰面积的相对标准偏差应不大于5.0%，保留时间的相对标准偏差应不大于1.0%。
6.2专属性
a) 溶剂空白：取空白进样，记录色谱图，溶剂对测定应无干扰。
b) 样品液：取本品25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度。进样分析，主峰与相邻杂质之间的分离度应不小于1.5，主峰峰纯度应不小于0.990。
c)杂质1定位溶液：取杂质1约25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度。移取5.0ml至25ml容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度。主峰峰纯度应不小于0.990。
d)杂质2定位溶液：取杂质2约25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度。移取5.0ml至25ml容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度。主峰峰纯度应不小于0.990。
e)杂质3定位溶液：取杂质3约25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度。移取5.0ml至25ml容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度。主峰峰纯度应不小于0.990。
f)杂质4定位溶液：取杂质4约25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度。移取5.0ml至25ml容量瓶中用稀释液溶解并稀释至刻度。主峰峰纯度应不小于0.990。
i)杂质5定位溶液：取杂质5约25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度。移取5.0ml至25ml容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度。主峰峰纯度应不小于0.990。
j)杂质6定位溶液：取杂质6约25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度。移取5.0ml至25ml容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度。主峰峰纯度应不小于0.990。
k)杂质7定位溶液：取杂质7约25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度。移取5.0ml至25ml容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度。主峰峰纯度应不小于0.990。
l)杂质8定位溶液：取杂质8约25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度。移取5.0ml至25ml容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度。主峰峰纯度应不小于0.990。
m)杂质9定位溶液：取杂质9约25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度。移取5.0ml至25ml容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度。主峰峰纯度应不小于0.990。
n)杂质10定位溶液：取杂质10约25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度。移取5.0ml至25ml容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度。主峰峰纯度应不小于0.990。
o) 高温破坏试验：取在60℃加热10天的样品25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度，即得高温破坏样品溶液。进样分析，主峰与相邻杂质之间的分离度应不小于1.5，主峰峰纯度应不小于0.990,记录各杂质的变化。
p) 高湿破坏实验：取在相对湿度为90%±5%的条件下放置10天的样品25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度，即得高湿破坏样品溶液。进样分析，主峰与相邻杂质之间的分离度应不小于1.5，主峰峰纯度应不小于0.990,记录各杂质的变化。
q) 强光破坏试验：取经取经总照度不低于1.2×106Lux.hr强白光,近紫外能量不低于200w.hr/m2破坏的的样品25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度，即得强光破坏样品溶液。进样分析，主峰与相邻杂质之间的分离度应不小于1.5，主峰峰纯度应不小于0.990,记录各杂质的变化。
r) 酸破坏试验：取样品25mg，置于25ml量瓶中，加入0.1mol/L盐酸溶液1.00ml，25℃下放置24小时，然后用0.1mol/L氢氧化钠溶液1.00ml中和，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度，即得酸破坏样品溶液。进样分析，主峰与相邻杂质之间的分离度应不小于1.5，主峰峰纯度应不小于0.990,记录各杂质的变化。
s) 碱破坏试验：取样品25mg，置于25ml量瓶中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液1.00ml，25℃下放置24小时，然后用0.1mol/L盐酸溶液1.00ml中和，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度，即得碱破坏样品溶液。进样分析，主峰与相邻杂质之间的分离度应不小于1.5，主峰峰纯度应不小于0.990,记录各杂质的变化。
t) 氧化破坏试验：取样品25mg，置于25ml量瓶中，加入10%过氧化氢溶液1ml，25℃下放置24小时，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度，即得氧化破坏样品溶液。进样分析，主峰与相邻杂质之间的分离度应不小于1.5，主峰峰纯度应不小于0.990,记录各杂质的变化。
i)根据杂质1~10的定位溶液和***标准品溶液的主峰峰面积，计算响应因子，以***标准品为1.0计，计算各杂质的相对响应因子。
6.3检测限与定量限
a) 定量限：取***产品标准品25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度；用稀释液分步稀释成一定浓度的溶液，进样，获得的色谱图中，信噪比(S/N)为(10~20):1时，相应的浓度即为定量限浓度
定量限精密度：配制6个相同浓度的定量限溶液进样，主峰保留时间的相对标准偏差应不大于2.0%，峰面积的相对标准偏差应不大于5.0%。定量限应不大于0.05%。
定量限准确度：
LOQ储备溶液：根据LOQ测试结果配制LOQ储备溶液，浓度为LOQ浓度的5倍。
LOQ浓度杂质标准溶液：移取杂质标准储备溶液5.0ml至25ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度。计算杂质的单位浓度峰面积。同法配制3个。
供试液：取***产品25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度。同法配制3个。
LOQ回收率测试液：取***产品25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，精密加入LOQ储备液5.0ml，用稀释液稀释至刻度(相当于杂质的LOQ浓度)。同法配制3个。
分别取LOQ浓度杂质标准溶液、供试液进样，计算杂质标准的单位浓度峰面积和供试液中所含杂质的单位浓度峰面积。LOQ回收率测试液各进样3针，计算回收率，每个回收率及平均回收率应为80~120%，各回收率的相对标准偏差应不大于15%。
回收率(%)=计算浓度×100%/实际浓度。
b) 检测限：取***产品标准品25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度；用稀释液分步稀释成一定浓度的溶液，进样，获得的色谱图中，信噪比(S/N)为(3~5):1时，相应的浓度即为检测限浓度。
6.4线性
a)杂质标准储备溶液：取杂质1约10mg，杂质2约50mg,杂质3约15mg, 杂质4约75mg，杂质5约10mg,杂质6约50mg, 杂质7约15mg，杂质8约10mg,杂质9约50mg, 杂质10约50mg至100ml容量瓶中，精密称定，加乙腈5ml溶解后用流动相稀释至刻度，再移取2.0ml至20ml容量瓶中，流动相稀释至刻度。
b)线性L1溶液：取检测限与定量限项下的LOQ浓度杂质标准溶液。
c)线性L2溶液：移取杂质标准储备溶液3.0ml至25ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度。计算杂质的单位浓度峰面积。（相当于60%杂质限度，也可以不做，但至少保证有5个点）
d)线性L3溶液：移取杂质标准储备溶液4.0ml至25ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度。计算杂质的单位浓度峰面积。（相当于80%杂质限度）
e)线性L4溶液：移取杂质标准储备溶液5.0ml至25ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度。计算杂质的单位浓度峰面积。（相当于100%杂质限度）
f)线性L5溶液：移取杂质标准储备溶液6.0ml至25ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度。计算杂质的单位浓度峰面积。（相当于120%杂质限度）
g)线性L6溶液：移取杂质标准储备溶液7.0ml至25ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度。计算杂质的单位浓度峰面积。（相当于140%杂质限度）
进样，记录色谱图，以样品浓度(μg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归计算，得出线性回归方程及相关系数。线性范围为杂质的定量限浓度至约1.4倍最大允许杂质限度浓度，相关系数R应不小于0.990，Y轴截距应在100%响应值的25%以内，响应因子的相对标准偏差应不大于10%。
6.5准确度
a)杂质标准储备溶液：取杂质1约10mg，杂质2约50mg,杂质3约15mg, 杂质4约75mg，杂质5约10mg,杂质6约50mg, 杂质7约15mg，杂质8约10mg,杂质9约50mg, 杂质10约50mg至100ml容量瓶中，精密称定，加乙腈5ml溶解后用流动相稀释至刻度，再移取2.0ml至20ml容量瓶中，流动相稀释至刻度。
b)LOQ储备溶液：根据LOQ测试结果配制LOQ储备溶液，浓度为LOQ浓度的5倍。
c)杂质标准溶液：移取杂质标准储备溶液5.0ml至25ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度。同法配制3个。计算杂质的单位浓度峰面积。（相当于杂质限度溶液）
d)供试液：取***产品25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度。同法配制3个。计算样品中各杂质的单位浓度峰面积，用于扣除回收率测试中扣除空白的依据。
e)回收率测试液1：取***产品25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，精密加入上述杂质标准液储备液5.0ml，用稀释液稀释至刻度(相当于杂质的限度)。
f)回收率测试液2：取***产品25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，精密加入上述杂质标准液储备液7.0ml，用稀释液稀释至刻度(相当于杂质的限度的1.4倍)。
i)回收率测试液3：取***产品25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，精密加入LOQ储备液5.0ml，用稀释液稀释至刻度(相当于杂质的LOQ浓度)。(也可以配制相当于杂质限度的0.8倍的溶液，但是为了减少工作量，还是最好做LOQ点的回收率)。
分别取杂质标准溶液、供试液、回收率测试液1、回收率测试液2、回收率测试液3各连续进样3次，按外标法以峰面积计算***产品的量，并计算回收率，每个回收率及平均回收率应为80~120%，各回收率的相对标准偏差应不大于15%。
回收率(%)=计算浓度×100%/实际浓度。
6.6精密度
a)重复性：称取***产品样品适量，照有关物质检查方法配制样品溶液，同法配制6份样品溶液，进样测试，各杂质测定结果的相对标准偏差均应不大于10%。
b) 中间精密度：不同仪器(Agilent 1200)、不同检验人员(另一位化验员)、新配制的流动相、新配制的样品液及标准液，与重复性测试测同一批样品，各杂质测定结果的相对标准偏差均应不大于10%。
c) 精密度测试结果：重复性测定结果的平均值与中间精密度测定结果的平均值之间的相对偏差不大于20%。
6.6范围
根据线性、精密度和准确度确定方法的范围，在该浓度范围内，方法具有良好的精密度、线性和准确度。范围至少在0.05%~质量指标的140%范围内。
6.7耐用性
a) 色谱条件的影响：在其他条件不变情况下，单独改变柱温、流速、色谱柱、缓冲液pH值、有机相比例、流动相比例等其中一个色谱条件，取分离度测试液分别进样，***产品与***杂质之间的分离度应不小于2.0。
改变项目
柱温
流速(ml/分钟)
色谱柱
缓冲液pH值
甲醇、乙腈比例
A、B相初始比例
设定值
20℃
30℃
0.85
1.05
另一支
2.80
3.20
55:45
45:55
80:20
70:30
b) 溶液稳定性：按本方法配制标准溶液、供试品溶液和分离度溶液，供试品溶液分别放置0h，4h，8h，24h，48h，36h后进样测定，考察溶液的稳定性。要求标准品溶液的峰面积相对0h的增长率在±5%范围内，供试品中各杂质的增长相对0h不超过±20%，且无新的杂质产生，分离度溶液分离度不小于2.0。则表明溶液在这段时间内稳定，否则说明溶液不稳定，需根据溶液稳定性结果考虑配制和进样时间。
6.8样品测定
应用本方法，对3批样品进行测定，样品各杂质均应能够符合限度要求。
7.偏差
验证过程中如果出现偏差应及时进行调查和上报，并且采取适当的措施进行处理，并及时记录。如经调查确定偏差的性质会对验证结果产生实质影响，应确定原因并采取必要措施后重新进行验证。
8.风险的接收与评审
经分析，对上一步判断的风险采取的控制措施，若经检查确认符合要求，则其相应的风险可降至为可接受风险。否则，需采取进一步的措施降低风险。
9.再验证
发生下列情形之一时，需进行再验证。
（1）生产工艺发生改变。（2）检验方法发生改变。
10.确认结果评审和结论
验证小组负责收集各项验证、试验结果记录，根据验证、试验结果起草验证报告，报验证委员会。
验证委员会负责对验证结果进行综合评审，做出验证结论，确认再验证周期。对验证结果的评审应包括：
确认试验是否有遗漏？
确认试验过程中对验证方案有无修改，修改原因、依据以及是否经过批准？
确认记录是否完整？
确认试验结果是否符合标准要求？偏差及对偏差说明是否合理？是否需要进一步补充试验？
11.更改历史
版本号
生效日期
主要变更描述
第1版

本文档为新订

12. 附录
附录1 ***原料有关物质分析方法
guideline on the limits of genotoxic impurities

精品资料
______________________________________________________________________________
附录1 ***原料有关物质分析方法
1 仪器：LC-2010AHT高效液相色谱仪（日本岛津公司），紫外检测器。
2 标准品及试剂
***标准品 来源:USP 或公司自制
***分离度标准品 来源：USP
磷酸二氢钠 色谱纯
磷酸 分析纯
甲醇 色谱纯
乙腈 色谱纯
水 超纯水
3 色谱条件
色谱柱为YMC-Pack，ODS-AM，4.6mm×150mm，5μm；检测波长为254nm；进样量为20μl。
流动相A：2.8g/L磷酸二氢钠溶液(磷酸调pH为3.0)；流动相B：乙腈-甲醇(1:1)。
流动相时间程序：
时间（分钟）
流动相A（%）
流动相B（%）
0
75
25
5
70
30
15
50
50
35
50
50
50
15
85
55
15
85
60
75
25
70
75
25
柱温为25℃；流速为1ml/分钟
4 溶液配制
稀释液：流动相A-流动相B(1:1)。
空白：取乙腈5ml，置于一25ml量瓶中，然后用稀释液稀释至刻度。
分离度测试液：取***产品分离度标准品5mg，置于一比色管中，加稀释液10ml溶解，在95℃下水浴加热30分钟，放冷。
标准液：取***产品标准品25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度；精密移取1ml，置于一100ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度。
样品液：取***产品样品25mg，精密称定，置于一25ml量瓶中，用乙腈5ml溶解，然后用稀释液溶解并稀释至刻度。
5 测定
取分离度测试液进样，记录色谱图，***产品与***异构体之间的分离度应不小于2.0。
分别取空白、标准液、样品液进样，记录色谱图，以下式计算杂质含量，溶剂及小于标准液主峰面积002倍的峰忽不计(0.02%)。
杂质(%)=(Ru/Rs)×(Cs/Cu)×(1/F)×100%；
式中：Ru为样品中杂质的峰面积；Rs为标准液中主峰面积；Cs为标准液浓度(mg/ml)；Cu为样品液浓度(mg/ml)；F为相对响应因子(见相对响应因子表)
组份名称
相对保留时间
相对响应因子
指标（%）
***(杂质1)
0.32
1.0
≤0.20
***开环物(杂质2)
0.82
0.76
≤1.0
***(杂质3)
0.89
1.1
≤0.30
***产品
1.0
1.0
—
***Δ-3异构体(杂质4)
1.08
0.95
≤1.5
***(杂质5)
1.24
1.0
≤0.20
***(杂质6)
1.34
0.72
≤1.0
***(杂质7)
1.42
0.67
≤0.30
***(杂质8)
1.78
1.0
≤0.20
***(杂质9)
1.92
0.79
≤1.0
***(杂质10)
1.96
0.76
≤1.0
最大未知杂质
—
—
≤0.10
总杂质
—
—
≤5.0

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