细菌的分类与鉴定实验室技术发展.pptx

细细菌的分菌的分类类与与鉴鉴定定实验实验室技室技术发术发展展*1.传统指标*2.分子生物学指标*形态特征*群体：菌落形态，在半固体或液体培养基中的生长状态等；*个体：细胞形态，染色反应，各种特殊构造等。从不同层次，用不同学科的技术方法来研究和比较不同微生物的细胞、细胞组分或代谢产物，从中发现的反映微生物类群特征的资料。*生理生化反应*营养要求：能源，碳源，氮源，生长因子等；*酶：产酶种类和反应特性等；*代谢产物：种类，产量，显色反应等。*生态特性：生长温度，对氧的需要，宿主种类等；*生活史特点：在生活史中出现的菌体变化特点及其规律性；*血清学反应：利用抗原构造上的差别进行鉴定；*噬菌体的敏感性其他*DNA*RNA染色镜检形态观察染色镜检形态观察按照标准进行按照标准进行传统的生化反应鉴定传统的生化反应鉴定标准化成品鉴定产品标准化成品鉴定产品（如：（如：API试剂条）试剂条）半自动细菌鉴定仪半自动细菌鉴定仪（如：（如：ATB Expression）全自动细菌鉴定仪全自动细菌鉴定仪（如：（如：VITEK 2）色谱、光谱分析技术色谱、光谱分析技术分子生物分子生物学技术学技术1.生理生化检测技术2.色谱、光谱分析技术3.分子生物学技术（二）（二）细菌分类鉴定的实验室技术细菌分类鉴定的实验室技术人工鉴定培养基的微量化、标准化和商品化数码分类鉴定技术（生化反应的数字化）自动化鉴定技术（生物信息的电脑化）细菌的鉴定和药敏试验都实现了自动化前期准备增菌划线分离染色镜检血清手工细菌鉴定 1）临床常见菌的初步分群双岐索引鉴定临床常见菌的初步分群双岐索引鉴定 例如：葡萄球菌属双岐索引鉴定例如：葡萄球菌属双岐索引鉴定 早在七十年代中期，一些国外公司就研究出借助生物信息编码鉴定细菌的新方法。这些技术的应用，为医学微生物检验工作提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性。目前，微生物编码鉴定技术已经得到普遍应用，并早已商品化和形成独特的不同细菌鉴定系统。如API、Micro-ID、RapID、Enterotube和Minitek等系统。这种鉴定系统是自动化鉴定系统的基础。数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码,建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其基本原理基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。*微量生化反应系统Micro-ID系统VP硝酸盐还原苯丙氨酸脱羧酶硫化氢吲哚鸟氨酸赖氨酸丙二酸盐尿素七叶甘ONPG阿拉伯糖侧金盏花醇肌醇三梨醇421421421421421+0 2 0 0 2 1 4 0 0 0 2 1 4 0 0 2 3 4 3 4相加所得数字：23434 查出相应细菌为：大肠埃希菌项目分值*数码鉴定法数码鉴定法基本原理基本原理 先将细菌分离纯化。做染色形态观察、氧化酶、糖发酵试验。根据染色、氧化酶、糖发酵试验结果选择不同的生化反应板进行接种（同一个鉴定系统，配有不同细菌的生化反应板）。培养后，读取生化反应结果，得到一组数据。将这组数据查编码本（即数据库），即得到鉴定结果。实验方法：实验方法：*数码鉴定法数码鉴定法基本原理基本原理3）自动化的微生物鉴定和药敏试验分析）自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统系统 细菌数码分类技术是细菌自动化鉴定技术的基础，细菌鉴定自动化是把生化反应数字化技术进一步电脑化，数据库用电脑管理，结果用电脑分析和鉴定。鉴定系统的工作原理因不同的仪器和系统而异。不同的细菌对底物的反应不同是生化反应鉴定细菌的基础，而试验结果的准确度取决于鉴定系统配套培养基的制备方法、培养物浓度、孵育条件和结果判定等。大多鉴定系统采用细菌分解底物后反应液中pH的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌。对标本同时进行鉴定与药敏测试对标本同时进行鉴定与药敏测试*全自动细菌鉴定全自动细菌鉴定/药敏检测药敏检测系统系统*检测流程检测流程纯培养新鲜平板上挑取菌落制成标准浊度（0.50.6麦氏单位）的菌悬液菌液加入肉汤中，倒入检测板，上机检测。*检测流程检测流程扫描板条，输入资料，等待鉴定结果。*检测流程检测流程挑选菌落样品制备于样品盘上菌种鉴定结果未知微生物?MALDI BioTyper软件-数据库分析获取质谱指纹信号以以蛋白为基础蛋白为基础的分析方法的分析方法(Protein based approach)1.样品制备2.质谱信号3.菌种鉴定2.2.质谱质谱分析的细菌分析的细菌鉴定鉴定流程流程直接涂抹法直接涂抹法 (Direct Transfer)(Direct Transfer)单一菌种单一菌种 (Pure culture)(Pure culture)涂抹单一菌落于样品盘上涂抹单一菌落于样品盘上(Single colony on MALDI)Target(Single colony on MALDI)Target加上加上 1 1 mlml 基质溶液基质溶液(Overlay with 1 ml HCCA Matrix)(Overlay with 1 ml HCCA Matrix)90-95%90-95%以上的以上的常规样品常规样品可于此制备法得到鉴定结果可于此制备法得到鉴定结果步骤步骤 1 1：样品制备样品制备4364.065380.646254.646315.495096.017157.657273.876410.907870.628368.99010002000300040005000Intens.a.u.400045005000550060006500700075008000m/z质谱图:多数为核核糖糖体蛋白体蛋白(ribosomal proteins)信号大肠杆菌(E.coli)步骤步骤 2 2：采集谱图：采集谱图Calculation of a matching score based on:Rel Score%matches of the reference spectrum(e.g.6/10=0.6)Rel P-Num.%matches of the unknown spectrum(e.g.6/20=0.3)I-Corr.value of intensity correlationUnknown microorganism is matched against each Main spectrum in biotyper library.Ranking according to matching score,threshold for IDMSP:Main Spectrum Peaks步骤步骤 3 3：数据库比对：数据库比对Result Report|Detected Species|Ranking|act Sc|max Sc|Rel Score|PN k|PN b|PN m|Rel P-Num.|I-Corr.|1000*Pro-Spectrum#12|Ps.mendocina DSM50017|1|3813|4271|0.89|41|10|830.55|0.88|438|Ps.oleovorans B396|2|1671|3450|0.48|14|8|83|0.22|0.39|41|Ps.fluoreszens B340|3|868|4186|0.21|6|7|83|0.11|0.19|4|Ps.veronii DSM11331|4|847|4250|0.20|5|7|83|0.10|0.14|3|Ps.putida DSM291|5|374|2821|0.13|3|3|83|0.05|0.12|1|Ps.putida B401|6|329|2638|0.12|3|2|83|0.05|0.11|1谱谱图模式比对图模式比对进行进行细菌鉴定细菌鉴定得分范围得分范围分数的解释分数的解释2.300-3.000highly probable species identification完全可靠地鉴定到种的水平完全可靠地鉴定到种的水平2.000-2.299secure genus identification,probable species identification可靠鉴定到属的水平，有可能鉴定到种的水平可靠鉴定到属的水平，有可能鉴定到种的水平1.700-1.999 probable genus identification有可能鉴定到属的水平有可能鉴定到属的水平0.000-1.699 no reliable identification没有可信的鉴定结果没有可信的鉴定结果微生物微生物鉴定得分及含义鉴定得分及含义25MALDI Biotyper MALDI Biotyper 1 1 样品样品 5 5 分钟分钟9696 样品样品(整盘整盘)30 30 分钟分钟生化反应测试鉴定法生化反应测试鉴定法8 8 小时小时 数天数天Can I identify microorganisms fast?Acetobacter aceti subsp.acetiAcetobacter pasteurianus subsp.lovaniensisAcetobacter pasteurianus subsp.pasteurianusActinomadura aurantiacaActinomadura libanoticaActinomadura lividaAgrobaterium tumefaciensArthrobacter globiformisArthrobacter oxydansArthrobacter pyridinolisArthrobacter sulfureusBacillus alcalophilusBacillus cohniiBacillus sphaericusBrevibacillus brevisBrevibacterium linensCellulomonas flavigenaCellulomonas turbataCorynebacterium glutamicumComamonas testosteroniiGluconobacter oxydans subsp.oxydansGluconobacter oxydans subsp.oxydansGordonia amaraeGordonia rubropertinctaGordonia terraeHalomonas denitrificansHalomonas elongataHalomonas elongataHalomonas halmophilaHalomonas halmophilaHydrogenophaga flavaHydrogenophaga pseudoflavaMethylobacterium mesophilicumMethylobacterium organophilumMethylobacterium radiotoleransMethylobacterium rhodesianumParacoccus versutusParacoccus versutusPseudomonas balearicaPseudomonas fluorescensPseudomonas fluorescensPseudomonas oleovoransPseudomonas putidaPseudomonas stutzeriPseudonocardia hydrocarbonoxydansRhizobium leguminosarumRhodococcus coprophilusRhodococcus fasciansRhodococcus globerulusRhodococcus rhodniiRhodococcus rhodochrousRhodococcus ruberSinorhizobium melilotiStarkaya novellaStarkaya novellaStreptomyces albusStreptomyces avidiniiStreptomyces azureusStreptomyces badiusStreptomyces griseusStreptomyces hirsutusStreptomyces lavendulaeStreptomyces phaeochromogenesStreptomyces violaceoruberStreptomyces viridisporusq 4600 4600种微生物菌株，可直接应用于微生物鉴定种微生物菌株，可直接应用于微生物鉴定q 用户可使用软件自行生成新的微生物的标准谱图用户可使用软件自行生成新的微生物的标准谱图 模式模式 并用于鉴定并用于鉴定质谱仪质谱仪建立的微生物数据库（主库）建立的微生物数据库（主库）