菌种选育与培养.doc

第三章 菌种选育与培养教学目的：1、熟悉工业发酵常用微生物种类；2、掌握菌种分离、筛选和选育的方法； 3、掌握种子扩大培养方法和质量控制方法；4、掌握常规的菌种保藏方法。教学方法：讲授教学手段：使用多媒体课件教学内容：第一节 重要工业微生物的分离及菌种要求1、微生物资源非常丰富，广泛分布于土壤、水和空气中，尤以土壤中最多。2、有的微生物从自然界中分离出来就能被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。3、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选育转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。4、由于生物工业本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步变为工业生产用的微生物。一、工业生产常用的微生物1、细菌（bacteria）：枯草芽胞杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等； 2、酵母菌（yeast）：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等；3、霉菌（mould）：根霉、毛霉、犁头霉、红曲霉、曲霉、青霉等，用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等；4、放线菌（actinomycetes）：链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等，常用菌种来自链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等；5、担子菌（basidiomycetes）：通常所说菇类（mushroom）微生物，用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发；6、藻类（algae）：用作人类保健食品和饲料，如螺旋藻、栅列藻；可通过藻类将CO2转变为石油，或获取氢能。二、微生物工业对菌种的要求目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，势必要求开拓更多新品种。尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生产，对菌种有下列要求：1、原料廉价、生产迅速、目的产物产量高；2、易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短；3、抗杂菌和噬菌体的能力强；4、菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。三、重要工业微生物的分离分离是指从含微生物的样品（如土壤、水等）中获得纯的或混合的培养物，是筛选具有潜在工业应用价值的微生物的第一个阶段，接着才能从以上分离物中筛选出那些能产生所需产物或具有某种生化反应的菌种。1、施加选择压力的分离方法（1）富集液体培养富集培养是指能增加混合菌群中所需菌株的数量的一种技术。方法的要领是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌株生长的条件。例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。（2）固体培养基的使用该方法常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含有该酶的作用底物。2、随机分离方法（1）抗生素产生菌的筛选（2）生长因子产生菌的筛选 生长因子如氨基酸和核苷酸等的生产不能作为分离步骤中的选择压力，可用随机办法分离产生菌，并通过随后的筛选试验检验出产生菌。（3）多糖产生菌的筛选可从菌落的粘稠外观识别这类产生菌。第二节 工业微生物菌种的选育一、自然选育定义：在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做自然选育或自然分离。1、从自然界分离获得菌株一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。2、从自发突变体中获得菌株自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停留在“选”种，还要进行“育”种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株-诱变育种。二、诱变选育定义：使用诱变剂对菌种进行人工诱变，提高突变频率和扩大变异谱的育种方法。具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。1、诱变育种的主要环节：（1）出发菌株的选择工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株（parent strain）。一般有三种：从自然界分离得到的野生型菌株；通过生产选育，即由自发突变经筛选获得的高产菌株；已经诱变过的菌株。选择纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体的影响。不仅选产量高的，还要考虑其他因素，如产孢子早而多，色素多或少，生长速度快等有利于合成发酵产物的特性。选择对诱变剂敏感且变异幅度广的菌株作为出发菌株，可以提高变异频率，而且高产突变株的出现率也大。（2）菌悬液的制备（3）前培养（4）诱变物理诱变剂：各种射线，如紫外线（焦耳）、X射线（库仑/千克）、射线、射线、射线和超声波等；化学诱变剂：甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。诱变剂诱变剂的剂量处理时间缓冲剂中止反应方法亚硝酸（HNO2）0.010.1mol/L510minpH值4.5，1mol/L醋酸缓冲液pH8.6，0.07磷酸二氢钠硫酸二乙酯（DES）0.511030min，孢子1824hpH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液硫代硫酸钠或大量稀释甲基磺酸乙酯（EMS）0.050.5mol/L1060min，孢子36hpH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液硫代硫酸钠或大量稀释亚硝基胍（NTG）0.11.0 mol/mL，孢子3mg/mL1560min，90120minpH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液或Tris缓冲液大量稀释亚硝基甲基胍（NMU）0.11.0 mol/mL1590minpH值6.07.0，0.1mol/L磷酸缓冲剂或Tris缓冲液大量稀释氮芥0.11.0 mol/mL510minNaHCO3甘氨酸或大量稀释乙烯亚胺1:10001:100003060min硫代硫酸钠或大量稀释羟胺（NH2OHHCl）0.10.5数小时或生长过程中诱变大量稀释氯化锂（LiCl）0.30.5加入培养基中，在生长过程中诱变大量稀释秋水仙碱（C22H25NO6）0.010.2加入培养基中，在生长过程中诱变大量稀释（5）突变株的筛选A、营养缺陷型的筛选方法一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。营养缺陷型菌株的检出方法有：逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。B、突变株的筛选随机筛选法（摇瓶筛选法；琼脂块筛选法；筛选自动化和筛选工具微型化）和理性化筛选法（运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。）。第三节 生产菌种的改良采用合适的筛选方法，诱变育种可以获得高产菌株，但不能达到定向育种的目的。随着现代生物技术的发展，杂交育种、原生质体融合、DNA重组可达到改良菌种的目的。一、常规的杂交育种定义：指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株，具有定向育种的性质。真菌、放线菌和细菌均可进行杂交育种。优点：杂交后的杂种不仅能克服原有菌种生活力衰退的趋势，而且杂交使得遗传物质重新组合，动摇了菌种的遗传基础，使得菌种对诱变剂更为敏感，因此，杂交育种可以消除某一菌种经长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象；通过杂交可以改变产品质量和产量，甚至形成新的品种。二、原生质体融合1、标记菌株的筛选供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择。采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，进行较细的筛选。2、原生质体的制备在高渗透压溶液中，用适当的脱壁酶（细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素处理，酵母菌和霉菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶）去除细胞壁，剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。影响原生质体制备的因素：菌体的预处理（用EDTA、甘氨酸、青霉素或D-环丝氨酸等处理细菌，使菌体细胞壁对酶的敏感性增强）；菌体的培养时间（一般选择对数生长后期的菌体，这时细胞正在生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解最为敏感）；酶浓度；酶解温度（一般控制在2040）；酶解时间（充足的酶解时间）；渗透压稳定剂（对于细菌或放线菌一般采用蔗糖、丁二酸钠；对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等；对于霉菌则采用KCl和NaCl等。一定浓度的Ca2+、Mg2+等二价阳离子可增加原生质膜的稳定性）。3、原生质体的融合和再生融合：是把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂PEG和Ca2+作用下，发生原生质体的融合。再生：原生质体融合后的重组子要成为一个无性繁殖系，首先必须再生，即能重建细胞壁，恢复完整细胞并生长、分裂。影响原生质体融合的因素：菌体的前处理；菌体的培养时间；融合剂的浓度；融合剂作用的时间；阳离子的浓度；融合的温度；融合体系的pH值等。影响原生质体再生的因素：菌种自身的再生性能；原生质体制备的条件；再生培养基成分；再生培养条件等。4、融合子的选择融合子的选择主要依靠两个亲株的选择性遗传标记。在选择性培养基上，通过两个亲株的遗传标记互补而挑选出融合子。在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定真正融合子。5、灭活原生质体融合技术在育种中的应用（该方法可以不用遗传标记）灭活原生质体融合技术是指采用热、紫外线、电离辐射以及某些生化试剂、抗生素等作为灭活剂处理单一亲株或双亲株的原生质体，使之失去再生能力，经细胞融合后，由于损伤部位的互补可以形成能再生的融合体。三、DNA重组技术体外重组DNA技术或称基因工程、遗传工程，是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起来的一门新兴技术。它是现代生物技术的一个重要组成方面，在工业微生物学上提供了巨大的创造具有工业应用价值的生产菌株的潜力。（一）DNA重组过程1、基因的分离2、载体的选择3、DNA分子的切割与连接4、重组载体引入宿主细胞5、重组体的选择和鉴定6、外源基因的表达（二）分子育种技术分子育种是应用基因工程手段进行的。近年来，工程菌已逐渐开始应用发酵生产中。如：链霉菌的抗生素生物合成基因克隆；利用基因工程技术生产新的抗生素；利用基因工程技术生产氨基酸；克隆抗生素生物合成基因的7个克隆策略；检测克隆到标准宿主中的个别基因产物；利用产生菌阻断突变株的互补作用；利用突变克隆技术；连锁的抗生素抗性基因的克隆；用人工合成的寡核苷酸探测基因文库；直接克隆抗生素产生菌DNA大片断到非产生菌中；用一种抗生素的克隆DNA去探测相关抗生素的同源基因。第四节 工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏一、微生物菌种的衰退菌种的退化是由个别、少数菌体细胞衰退后逐渐导致整个菌株退化的一个从量变到质变的遗传变异过程。菌种的退化会使微生物个体和群体特征发生变化，其中最重要的使所需产物的生产产量下降、营养物质代谢和生长繁殖能力下降、发酵周期延长、抗不良环境条件的性能减弱。1、菌种衰退的原因 菌种连续传代导致自发突变或回复突变是菌种发生退化的直接原因。由于连续传代使培养物经常处于旺盛的生长状态，且每次传代时营养和环境等培养条件都是不断变化的，与处于休眠状态的培养物相比，细胞的自发突变率要高的多。菌株经过连续传代后，含突变基因的个体在数量上逐渐占优势，退化现象就逐渐显露出来。培养基灭菌升、降温的不同，培养基存放时间的不同，采用老龄菌和多核菌丝等都比较容易引起菌种退化。 菌种保藏方法不当。各种菌种的保藏法对阻止菌种变异的效果不尽相同，用效果较差的条件保藏菌种时，菌种就较易发生退化。保藏操作不当也会影响保藏效果，会影响到菌种的变异。 菌种生长的条件要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件。2、防止菌种衰退的措施（1）控制传代次数：尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降低到最低限度，以减少细胞分裂过程中所产生的自发突变几率。（2）创造良好的培养条件：如在赤霉素生产菌G.fujikuroi的培养基中，加入糖蜜、天冬酰胺、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等丰富营养物时，有防止衰退效果。（3）利用不易衰退的细胞传代：对于放线菌和霉菌，菌丝细胞常含有几个细胞核，因此用菌丝接种就易出现衰退，而孢子一般是单核的，用于接种就可避免这种现象。（4）采用有效的菌种保藏方法二、菌种的复壮狭义的复壮仅是一种消极的措施，指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施；广义的复壮是一项积极的措施，指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正变个体。1、纯种分离菌种发生衰退的同时，并不是所有的菌种都退化，其中未衰退的菌体往往是经过环境条件考验的、具有更强生命力的菌体。 因此，采用单细胞菌株分离的措施，即用稀释平板法或用平板划线法，以取得单细胞所生长的菌落，再通过菌落和菌体的特征分析和性能测定，就可获得具有原来性状的菌株，甚至性能更好的菌株。2、通过寄主体进行复壮3、淘汰已衰退的个体如：对S.microflavus”5406”农用抗生菌的分生孢子采用-10 - 30 的低温处理5-7天,使其死亡率达到80%左右,结果会在抗低温的存活个体中留下未退化的个体,从而达到了复壮的效果。三、菌种的保藏一个优良的菌种被选育出来以后，要保持其生产性能的稳定、不污染杂菌、不死亡，这就需要对菌株进行保藏。尽量减少传代次数，防止菌种衰退。1、菌种保藏的原理菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。保藏时，一般利用菌种的繁殖体和休眠体（孢子、芽胞等），创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使菌体的代谢活性处于最低状态，同时也应考虑到经济、简便方法。由于微生物种类繁多，代谢特点各异，对各种外界环境因素的适应能力不一致，一个菌种选用何种方法保藏较好，要根据具体情况而定。2、菌种保藏方法7种常用菌种保藏方法的比较方法主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）低温（4）各大类约16月简便冰箱保藏法（半固体）低温（4），避氧细菌，酵母菌约612月简便石蜡油封藏法*低温（4），阻氧各大类*约12年简便甘油悬液保藏法低温（70），保护剂（1550甘油）细菌，酵母菌约10年较简便砂土保藏法干燥，无营养产孢子的微生物约110年简便有效冷冻干燥保藏法干燥、低温、无氧，有保护剂各大类515年繁而高效液氮保藏法超低温（196），有保护剂各大类15年繁而高效*用斜面或半固体穿刺培养物均可，一般置于4下。*对于可利用石油作碳源的微生物不适宜。3、菌种保藏的注意事项（1）菌种在保藏前所处的状态（2）菌种保藏所用的基质（3）操作过程对细胞结构的损害4、主要的菌种保藏机构作用：（1）从事原始菌株的保藏，进行有关保藏的研究；（2）提供保藏菌种的品种目录，定期（或不定期）出刊沟通信息；（3）提供菌种，促进微生物菌种的交流。国内：1979年7月，我国在国家科委和中国科学院主持下，召开了第一次全国菌种保藏工作会议，在会上成立了中国微生物菌种保藏管理委员会（China Committee for Culture Collection of Microorganisms，CCCCM），下设六个菌种保藏管理中心：（1）普通微生物菌种保藏管理中心中国科学院微生物研究所（北京）：真菌、细菌中国科学院武汉病毒研究所（武汉）：病毒（2）农业微生物菌种保藏管理中心中国农业科学院土壤肥料研究所（北京）（3）工业微生物菌种保藏管理中心轻工业部食品发酵工业科学研究所（北京）（4）医学微生物菌种保藏管理中心中国医学科学院皮肤病研究所（南京）：真菌卫生部药品生物制品检定所（北京）：细菌中国医学科学院病毒研究所（北京）：病毒（5）抗生素菌种保藏管理中心中国医学科学院抗生素研究所（北京）：新抗生素菌种四川抗生素工业研究所（成都）：生产用抗生素菌种华北药厂抗生素研究所（石家庄）：生产用抗生素菌种（6）兽医微生物菌种保藏管理中心农业部兽医药品监察所研究所（北京）国外：（1）美国典型菌种收藏所（ATCC）（2）冷泉港研究室（CSH）（3）国立卫生研究院（NIH）（4）美国农业部北方开发利用研究部（NRRL）（5）国立标准菌种研究所（NCTC）（6）日本大阪发酵研究所（IFO）（7）日本东京大学应用微生物研究所（IAM）第五节 种子的扩大培养定义：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量纯种的过程。菌种的扩大培养是发酵生产的第一道工序，该工序又称之为种子制备。种子制备不仅要使菌体数量增加，更重要的是经过种子制备培养出具有高质量的生产种子供发酵生产使用。一、微生物生长现象二、微生物生长的测定（一）以数量变化对微生物生长情况进行测定通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况，或样品中所含微生物个体的数量（细菌、孢子、酵母菌）。1、培养平板计数法2、膜过滤培养法 当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。3、The most probable number method（液体稀释法） 主要适用于只能进行液体培养的微生物，或采用液体鉴别培养基进行直接鉴定并计数的微生物。4、显微镜直接计数法（1）常规方法： 采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）。缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察； （2）其它方法： 比例计数：将已知颗粒浓度的样品（例如血液）与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。过滤计数： 当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数。活菌计数：采用特定的染色技术也可分别对活菌和死菌进行分别计数。（二）以生物量为指标测定微生物的生长 1、比浊法 2、重量法3、生理指标法（常用于对微生物的快速鉴定与检测）微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。三、微生物的群体生长1、生长曲线(Growth Curve)：定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线。对于单细胞微生物（如细菌和酵母），以培养时间为横坐标，细胞数目的对数值为纵坐标，可绘制出一条由延滞期、指数期、稳定期和衰亡期4个阶段组成的典型生长曲线。（1）延滞期(Lag phase)： 将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称停滞期、调整期或适应期。延滞期的特点：细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在延滞期末期，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大；细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、 酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶；对外界不良条件反应敏感。延滞期出现的原因：微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。在生产实践中缩短延滞期的常用手段：通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；利用对数生长期的细胞作为种子；尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；适当扩大接种量 （2）指数生长期(Exponential phase)：又称对数生长期(Log phase)，以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。（3）稳定生长期(Stationary phase)：A、稳定生长期又称恒定期或最高生长期，由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)，此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。B、细胞重要的分化调节阶段：储存糖原等细胞质内含物，芽孢杆菌在此阶段形成芽孢或建立自然感受态等；也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。因此，生产上为获得更多的菌体或代谢产物，可以：补充营养物质或取走代谢产物；调节pH、温度；对好氧菌增加通气；搅拌或振荡等措施延长稳定生长期。（4）衰亡期(Decline或Death phase)：营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。四、工业微生物的扩大培养、种子扩大培养的任务：得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数。抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖较慢，常采用三级种子扩大培养；一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的也采用四级发酵如链霉素生产；有些酶制剂发酵生产也采用三级发酵；谷氨酸及其他氨基酸的发酵所采用的菌种生产繁殖速度很快，常采用二级发酵。、种子制备的过程种子制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的制备过程和在液体培养基中生产大量菌丝或营养体的种子制备过程。（1） 孢子制备孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。不同菌种的孢子制备工艺有不同的特点，包括：放线菌孢子的制备；霉菌孢子的制备；细菌培养物的制备。（2） 种子制备种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。种子制备所使用的培养基和其他工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌丝繁殖。1）摇瓶种子制备某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐，这就是摇瓶种子。摇瓶培养基配方和培养条件与种子罐相似。常采用母瓶、子瓶两级培养。种子培养基要求比较丰富和完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓，子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近于种子罐的培养基配方。2）种子罐种子制备种子罐种子制备的工艺过程因菌种不同而异，一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。种子罐的级数主要决定于菌种的性质和菌丝生长速度及发酵设备的合理应用。、种子培养静置培养：即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养。通气培养法：工业生产用菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称好气培养法。其中：通气培养法中的液体深层培养最为常用。液体深层种子罐从底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。该法容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度与培养基中氢离子等条件，选择最佳培养条件。1）深层培养基本操作的三个控制点灭菌：发酵工业要求纯培养，因此在种子培养前必须对培养基进行加热灭菌。种子罐具有蒸汽夹套，以便将培养基和种子罐进行加热灭菌，或者将培养基由连续加热灭菌器灭菌，并连续输送至种子罐内。温度控制：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行种子培养，由于随着微生物生长和繁殖会产生热量，搅拌也会产热，所以要维持温度恒定，需在夹套中或盘管中通冷却水循环。通气、搅拌：空气进入种子罐前先经过空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进入，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。为了延长气泡滞留时间，可再罐内装挡板产生涡流。搅拌底目的除增加溶解氧以外，可使培养液中的微生物均匀分散在种子罐内，促进热传递，以及pH均匀，并使加入的酸和碱均匀分散等。2）几种深层培养控制培养法：根据罐内部的变化情况，掌握短暂时间内状态变量的变化以及可能测定的环境因子对微生物代谢活动影响，并以此为基础进行控制培养，以达到产物的最优培养条件。载体培养法：载体培养法脱胎于曲法培养，同时吸收了液体培养的优点，是近年来新发展的一种培养方法。以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固体基质作为微生物的载体，营养成分可以严格控制。发酵结束后，只要将菌体和培养基挤压出来进行抽提，载体可重新使用。两步法：在酶制剂的两步法液体深层培养中，每一步菌体相同而培养条件不同，因为微生物生长与产酶的最适条件由很大差异。菌体先在丰富的培养基上大量繁殖，然后收集菌体浓缩物，洗涤后再转入添加诱导物的产酶培养基，在此期间，菌体积累大量的酶，一般不再繁殖，营养成分或诱导物得到充分的利用。、种子质量的控制（）影响孢子质量的因素及其控制）培养基构成孢子培养基的原材料，其产地、品种、加工方法和用量对孢子质量都有一定的影响。水质的影响也不能忽视。斜面培养基所用的主要原材料，糖、氮、磷含量需经过化学分析及摇瓶发酵试验合格后才能使用。供生产用的孢子培养基或作为制备砂土孢子或传代所用的培养基要用比较单一的氮源，以便保持正常菌落类型的优势。作为选种或分离用的平板培养基，则需要采用较复杂的有机氮源，目的是便于选择特殊代谢的菌落。）培养温度和湿度一般来说，提供培养温度，可使菌体代谢活动加快，缩短培养时间。不同菌株要求的最适温度不同，需经实践考察确定。一般来说，真菌对湿度要求偏高，放线菌对湿度要求偏低。）培养时间和冷藏时间孢子的培养时间应控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。冷藏时间宜短不宜长。）接种量制备孢子时的接种量要适中，接种后菌落均匀分布整个斜面，隐约可分菌落为正常接种量。一般传代用的斜面孢子要求菌落分布较稀，适于挑选单个菌落进行传代培养。（）影响种子质量的因素及其控制）培养基培养基的营养成分应适合种子培养的需要，一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基，在营养上易于被菌体直接吸收和利用，营养成分要适当的丰富和完全，氮源和维生素含量较高；培养基的营养成分要尽可能和发酵培养基接近，以适合发酵的需要，这样种子移入发酵罐后能比较容易适应发酵罐的培养条件。培养基的pH要比较稳定，适合菌的生长和发育。）培养条件种子培养应选择最适温度，培养过程中通气搅拌的控制很重要。）种龄在工业发酵生产中，一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。最适种龄因菌种不同而有很大差异：细菌的种龄一般为724h，霉菌种龄一般为1650h，放线菌种龄一般为2164h。）接种量移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例称为接种量。发酵罐的接种量的大小与菌种特性、种子质量和发酵条件等有关。）种子质量的判断细胞或菌体：以单细胞菌体为种子的质量要求菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列和形态；以霉菌、放线菌为种子的质量要求是菌丝粗壮，对某些染料着色力强、生产旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。生化指标：种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH值变化。产物生成量：测定产物含量。酶活力：如胞内的淀粉酶等。）种子的异常状况菌种生长缓慢或过快：与孢子质量和种子罐的培养条件有关。菌丝结团：与搅拌效果差、接种量小有关菌丝粘壁：在种子培养过程中，由于搅拌效果不好，泡沫过多以及种子罐装料系数过小等原因，使菌丝逐步粘在罐壁上，结果使培养液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团。5、种子质量的控制措施（1）菌种稳定性检查：取少许保藏菌种用无菌生理盐水逐级稀释（稀释度以长成的菌落不至过密为宜），划线培养。挑出形态整齐、孢子丰满的菌落进行摇瓶试验，测定其生产能力，以不低于其原有的生产活力为原则，并取生产能力高的菌种备用。（2）无（杂）菌检查：在种子制备过程中每移种一步均需进行杂菌检查。方法有：种子液显微镜观察，肉汤或琼脂斜面接入种子液进行无菌试验，种子液的生化分析（营养消耗速度、pH变化、溶解氧利用情况、色泽、气味等）。（3）提供合适的培养条件：包括营养成分、温度、通气、pH等。以期获得优良种子。