图位克隆原理-PPT.ppt

在拟南芥的众多生态型中最常用的三种是Landsberg erecta(Ler)Columbia(Col)Wassilewskija(Ws)其中其中Col生态型用于拟南芥的全基因组测序。生态型用于拟南芥的全基因组测序。MarkerSSLPsCAPsdCAPsInDelSNPSSLP=simple sequence length polymorphisms简单序列长度多态性简单序列长度多态性又称又称 SSR=simple sequence repeats 比较产物长度CAPs=cleaved amplified polymorphic sequences酶切扩增多态性利用酶切位点Marker:MIG5-BCLHCdCAPs=derived CAPS 设计引物引入错配碱基，从而引入酶切位点其它标记 InDel=insertion-deletion 插入缺失标记，指的是两插入缺失标记，指的是两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR 引物，这就是引物，这就是InDel标记。标记。部分部分SSLP就是由就是由InDel转化而来转化而来密度：密度：每每 6.6kb 存在一个存在一个SNP =single nucleotide polymorphism单核苷酸多态性单核苷酸多态性主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的所引起的DNADNA序列多态性。序列多态性。SNPSNP所表现的多态性所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的或缺失所致。但通常所说的SNPSNP并不包括后两种并不包括后两种情况。情况。(后面两种情况的多态性一般归为后面两种情况的多态性一般归为InDelInDel）密度：密度：每每 3.3kb 存在一个存在一个SSLPs 粗定位引物粗定位引物 （更新）（更新）粗定位引物粗定位引物 （混合）（混合）F1父本染色体母本染色体F1假设：Aa 突变位点Bb Marker突变为 隐性突变F1 配子配子长根长根长根长根长根长根长根长根长根长根短根短根短根短根长根长根长根长根短根短根F2 短根个体短根个体Col 单带单带Ler单带单带Col Ler 双带双带因为因为F2代根据表型来筛选个体时，我们人工选代根据表型来筛选个体时，我们人工选择的是短根表型，选择的个体为短根择的是短根表型，选择的个体为短根aa，即突，即突变位点不可能存在交换，交换率变位点不可能存在交换，交换率=0其他位点可能存在交换，利用带型差异判断交其他位点可能存在交换，利用带型差异判断交换次数换次数wild typemutant杂交杂交ColLerF1 plant图图中中的的两两个个亲亲本本不不但但在在A/aA/a位位点点有有差差异异，在在其其他他位位点点也也存存在在大大量量的的遗遗传传差差异异，可可以以利利用用这这些些差差异异设设计计分分子子标标记记，对对染染色色体体的的具具体体区区段段进进行行标标定定。在在该该例例子子中中，该该染染色色体体上上总总共共确确定定了了5 5个个分分子子标标记记，标标定定了了5 5个个不不同同区段。区段。假设：Aa 突变位点有5个Marker只有左侧三种植株会选入定位群体只有左侧三种植株会选入定位群体自交自交F2 plants假设：只存在单交换分子标记分子标记M5M5与突变位点的遗传距离：与突变位点的遗传距离：10/1006/1004/100(20/(1002)100%=10cMM5M5处发生交换的植处发生交换的植株包括三种情况株包括三种情况假设：统计100个个体分子标记分子标记M4M4与突变位点的遗传距离：与突变位点的遗传距离：6/1004/100(10/(1002)100%=5cM分子标记分子标记M3M3与突变位点的遗传距离：与突变位点的遗传距离：4/100(4/(1002)100%=2cMM4m4如何分辨来自于两个亲本的染色体？如何分辨来自于两个亲本的染色体？目目前前最最常常用用的的分分子子标标记记是是利利用用两两个个亲亲本本中中同同一一染染色色体体区区段段的的长长度度差差异异来来设设计计的的，如如左左图图亲亲本本LerLer的的M4M4处处染染色色体体区区段段长长于于亲亲本本ColCol中中m4m4染染色色体体区区段段，在在该该差差异异位位点点两两侧侧设设计计引引物物经经PCRPCR扩扩增增后后得得到到的的PCRPCR产产物物就就会会有有不不同同长长度度，电电泳泳后后M4M4泳泳动动速速度度慢慢，m4m4泳泳动动速速度度快快，因因此此通通过过电电泳泳就就可可以以分分辨辨来来自自于于两两个个亲亲本本的的染染色体区段色体区段包包含含来来自自于于两两个个亲亲本本的的染色体片段染色体片段包包含含来来自自于于ColCol两两 条条 染染色体区段色体区段包包含含来来自自于于LerLer两两条条染染色色体区段体区段注注意意后后两两种种情情况况反反映映的的是是来来自自于于两两个个配配子子的的染染色色体体区区段段的情况的情况Col*1、4、8、10、11、13、15、18、19共共9个样个样品，只包含来自于亲本品，只包含来自于亲本Col的染色体区段，的染色体区段，没有发生交换没有发生交换Ler*5、6、14共共3个样品，只包含来自于亲本个样品，只包含来自于亲本Ler的的染色体区段，也就是发生了染色体区段，也就是发生了两次交换两次交换Col*2、3、7、9、12、16、17共共7个样品，包含个样品，包含1个来个来自于亲本自于亲本Col的染色体区段以及的染色体区段以及1条来自于亲本条来自于亲本Ler的染色体区段，即发生了的染色体区段，即发生了一次交换一次交换Ler突变位点与分子标记M的遗传距离：交换次数交换次数配子总数配子总数100%32+719 2100%34 cM=SSLPsSSLPs40.48%20.00%4.76%4.76%12.5%12.5%36%步骤总结筛选 F2 代 短根 移栽提基因组各对引物PCR统计计算Rf缩小范围寻找新Marker扩大群体(筛选重组子)3周左右在突变位点附近区域内绝大部分的样品跑样结果都应该为只有非重组的Col条带，即记录Rf为0，只有少数的样品存在交换，Rf记为1。图中的6、12号样品即为重组子什么是重组子在筛选出6、12号两个重组子以后，假设在目标区域内寻找到新的标记引物，就不需要把所有的个体跑样，只需要跑重组子个体例：筛选重组子的目的RfMarker1Marker2Marker36号个体10112号个体100表格的跑样结果显示Marker2最接近突变位点，Marker3次之，下一步可以在Marker2和Marker3附近寻找新标记引物1.建议使用一对位于相对确信的区域内的 次低重组率标记引用来筛选 2.可以根据情况调整用来筛选 重组子的Marker 3.要选择好用、绝大部分一次 就能扩出来的标记引物重组子筛选1.山大丁老师山大丁老师 提供的引物提供的引物2.TAIR网上提供的常用网上提供的常用Marker3.AMP上提供的常用上提供的常用Marker4.TAIR网上公布的所有多态性位点资料网上公布的所有多态性位点资料引物寻找STEP1:把目标区域内的Marker序列贴进TAIR网上的Seqviewer上搜索目标区域MPK6 FP:AATCTTGTAATCTGGTGCGTG点击目标区域点击目标区域STEP2:把目标区域内的BAC名字记录下来例如：K14A17至MRC8之间的BAC名字有K14A17MCE21 MGD8 MTO12 MKP6 MIG5 MEB5 MBG14 MRC8STEP3:把目标区域内的BAC名字分次键入到AMP的Marker搜索栏注意:每个株系到精确定位后期可能用到数十上每个株系到精确定位后期可能用到数十上百的百的MARKER，请将自己使用、订制过的，请将自己使用、订制过的MARKER的相关资料清晰记录下来，便于的相关资料清晰记录下来，便于日后查看。日后查看。目标区域内基因搜索附加由于我们以短根为筛选突变体的指标，因此下面提到的突变的基因都应该会导致幼苗短根。隐性突变隐性突变 突变基因：突变基因：a（短根）（短根）正常基因：正常基因：A （长根）（长根）显性突变显性突变 突变基因：突变基因：A（短根）（短根）正常基因：正常基因：a（长根）（长根）单单基基因因突突变变由于我们以短根为筛选突变体的指标，因此下面提到的突变的基因都应该会导致幼苗短根。隐性突变隐性突变显性突变显性突变单单基基因因突突变变杂交杂交F1代代 突变体突变体 x Ler aa（短根）（短根）AA（长根）（长根）Aa（长根）（长根）突变体突变体 x Ler AA（短根）（短根）aa（长根）（长根）Aa（短根）（短根）杂交杂交F1代代隐性突变隐性突变显性突变显性突变单单基基因因突突变变杂交杂交F2代代Aa（长根）（长根）3 ：1AA Aa（长根）：（长根）：aa（短根）（短根）Aa（短根短根）3 ：1AA Aa（短根）：（短根）：aa（长根）（长根）杂交杂交F2代代隐性突变隐性突变显性突变显性突变单单基基因因突突变变杂交杂交F1代代 突变体突变体 x Ler aa（短根）（短根）AA（长根）（长根）Aa（长根）（长根）突变体突变体 x Ler AA（短根）（短根）aa（长根）（长根）Aa（短根）（短根）注意事项：一般出现的突变大多数为隐性注意事项：一般出现的突变大多数为隐性突变，因此理论上突变，因此理论上F1F1代都为长根代都为长根(Aa)(Aa);如如果不是，造成短根表型可能是果不是，造成短根表型可能是2 2种情况：种情况：（1 1）突变为隐性突变，杂交不成功，种子）突变为隐性突变，杂交不成功，种子为母本突变体自交所得（为母本突变体自交所得（aaaa），表现为），表现为F1F1代长短分离；代长短分离；（2 2）突变为显性突变，杂交）突变为显性突变，杂交F1F1代为代为AaAa（短根），杂交不成功的母本自交种为（短根），杂交不成功的母本自交种为AAAA（短根），表现为（短根），表现为F1F1代全部为短根代全部为短根注意事项注意事项2 2：由于根长还会受环境因素影响，：由于根长还会受环境因素影响，有时并不能准确判断，例如出现中根、或者对有时并不能准确判断，例如出现中根、或者对照也长得不好的情况。照也长得不好的情况。建议处理方法：分类后全部移栽，分成长根、建议处理方法：分类后全部移栽，分成长根、中根、短根等，在盆上标明，待苗长大后（中根、短根等，在盆上标明，待苗长大后（2 2至至3 3周后）编号后单株提取基因组，用任意一周后）编号后单株提取基因组，用任意一对粗定位用的对粗定位用的SSLPSSLP引物做引物做PCRPCR，验证杂交苗，验证杂交苗真假。真假。真的真的F1F1杂交苗为双带，假的为单带（杂交苗为双带，假的为单带（colcol带）带）隐性突变隐性突变显性突变显性突变单单基基因因突突变变杂交杂交F2代代Aa（长根）（长根）3 ：1AA Aa（长根）：（长根）：aa（短根）（短根）Aa（短根）（短根）3 ：1AA Aa（短根）：（短根）：aa（长根）长根）杂交杂交F2代代注意事项：一般出现的突变大多数为隐性注意事项：一般出现的突变大多数为隐性突变，因此理论上突变，因此理论上F2代都为短根代都为短根(aa)应为应为播种数的播种数的1/4。但实验上，分离是随机的，。但实验上，分离是随机的，实际情况未必是实际情况未必是3：1，但总体上也应该是，但总体上也应该是长根占大多数，短根占少数。长根占大多数，短根占少数。某些株系，萌发率特别低，因此某些株系，萌发率特别低，因此aa的种子的种子未必能全部萌发，就会使成苗的短根个体未必能全部萌发，就会使成苗的短根个体低于低于1/4。因此，统计。因此，统计F2表型时，要统计播表型时，要统计播种总数、萌发数、长根、短根等项目，以种总数、萌发数、长根、短根等项目，以便分析。便分析。注意事项注意事项2 2：某些株系如果刚好是双突变，则分离比会根某些株系如果刚好是双突变，则分离比会根据不同情况而偏离据不同情况而偏离3 3：1 1，例如，例如1515：1 1等情况等情况如果在如果在F1F1代中混有非杂交苗，即混有突变体代中混有非杂交苗，即混有突变体苗，则可能造成收集到苗，则可能造成收集到F2F2代种子中混有突变代种子中混有突变体自交种（体自交种（aa),aa),使短根大于使短根大于1/41/4，但由于这各，但由于这各情况造成的偏离程度无法估计，短根大于情况造成的偏离程度无法估计，短根大于1/41/4也有可能只是随机分离造成的，两者无也有可能只是随机分离造成的，两者无法分辨，因为法分辨，因为F1F1的筛选和收种十分重要，要的筛选和收种十分重要，要谨防种子污染。谨防种子污染。补充孟德尔规律一、显隐性关系的相对性(1)完全显性：F1表现与亲本之一完全一样，而非双亲的中间型或同时表现双亲的性状；(2)不完全显性：F1表现为双亲性状的中间型。(3)共显性：F1同时表现双亲性状，而不是表现单一的中间型。RRrrRr 1RR:2Rr:1rr由于根长还受影响培养环境等影响，因为不完全显性的情况比较难判断二、非等位基因间的相互作用无互作：9:3:3:1有互作：9：7互补作用互补作用15：1重叠作用重叠作用 13：3抑制作用抑制作用 9：6：1累加作用累加作用 9：3：4隐性上位作用隐性上位作用 12：3：1显性上位作用显性上位作用孟德尔规律Thanks for attention.END