流式细胞仪BD-FACSCanto-IIPPT.ppt

流式细胞仪背景知识流式细胞仪背景知识总览总览l 流式细胞术基本知识l 流式细胞仪的组成l 数据采集与分析流式细胞技术是什么？流式细胞技术是什么？l流式细胞术流式细胞术在流动的状态中检测细胞或颗粒的各项特性在流动的状态中检测细胞或颗粒的各项特性特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析可检测的样本种类多样：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱可检测的样本种类多样：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，实体组织，培养细胞，微生物液，实体组织，培养细胞，微生物Flow CytometryFlow:Fluid Cyto:Cell Metry:Measurement流式细胞术检测样本流式细胞术检测样本0.4um40um流式细胞术检测指标流式细胞术检测指标l流式细胞术提供的信息：流式细胞术提供的信息：-相对细胞大小相对细胞大小 -相对细胞颗粒密度和内部复杂度相对细胞颗粒密度和内部复杂度 -染色过细胞的相对荧光强度染色过细胞的相对荧光强度细胞结构细胞结构=细胞大小细胞大小=细胞粒度细胞粒度=DNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNA含量含量=蛋白质含量蛋白质含量=染色体分析染色体分析 细胞功能细胞功能=细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核的特核的特异性抗原异性抗原=细胞活性细胞活性=细胞内细胞因子细胞内细胞因子=酶活性酶活性=激素结合位点激素结合位点=细胞受体细胞受体=细胞凋亡细胞凋亡在上述信号基础上的细胞分选在上述信号基础上的细胞分选流式细胞术的应用流式细胞术的应用流式细胞术的应用流式细胞术的应用流式细胞仪组成流式细胞仪组成l液流系统：形成层流系统，聚焦细胞l光学系统：产生和收集光学信号l电子系统：光信号转化为电信号，进行信号处理Fluidics DiagramSheath Flowsheath tanksheath tankSample Flowsheathsheathinterior reservoirinterior reservoirwastewasteinterior reservoirinterior reservoirsheath filtersheath filtersample injectionsample injectiontube(SIT)tube(SIT)test tubetest tubeor plateor plateflow cellflow cellinterrogation pointinterrogation pointbubble filterbubble filterwaste tankwaste tank液流系统液流系统光学系统光学系统l激发光学系统包括:-激光器-透镜和反射镜，将激光引导到检测区域l收集光学系统包括:-滤光片，将产生的光信号引导到对应的光学接收器光学系统光学系统光学系统光学系统-滤光片滤光片460 500 540460 500 540460 500 540SP 500SP 500LP 500LP 500BP500/50BP500/50LongpassShortpassBandpass电子系统电子系统LaserLaserLaserLaserLaserLaserTimeVoltageTimeVoltageTimeVoltage电子系统电子系统电子系统电子系统Reviewl悬浮状态的细胞l单个流过流动室l细胞被激发l产生散射光和荧光 信号l信号被采集l转换成数字信号l存储于电脑上液流系统液流系统光学系统光学系统电子系统电子系统回顾回顾流式细胞仪的三大组成部分？流式细胞仪的三大组成部分？滤光片滤光片LP600代表什么意思？代表什么意思？BP400/40呢？呢？数据采集数据采集l三种数据：三种数据：-前向散射光FSC -侧向散射光SSC -各种荧光散射光FL1，FL2，FL3，FL4l当使用激光光源时，在前向方向（和激光行进的方向相同）上可用前向散射光接收通道前向散射光接收通道接收到一定量的散射光l前向散射光的强度是和细胞或其他检测颗粒的大小、形状密切相关的数据采集数据采集-前向散射光前向散射光l当激光光源被使用时，侧向也有一定量的散射光产生，可以用9090o o 角的侧向散射光检测通道角的侧向散射光检测通道来采集l侧向散射光的强度和细胞或其他检测颗粒的颗粒密度内部复杂程度密切相关数据采集数据采集-侧向散射光侧向散射光外周全血细胞散射光双参数点外周全血细胞散射光双参数点图图 颗粒杂质、气泡颗粒杂质、气泡对检测的影响对检测的影响l细胞标记上荧光物质后，这种荧光物质要求特定波长的激发光来激发，同时发出特定波长的光l荧光物质被激发以后产生的发射光将由特定的荧光通道来接收l特定检测是通过光学滤片和透镜来控制的数据采集数据采集-荧光信号荧光信号l荧光强度是和细胞上标记上的荧光染料的量正相关荧光强度是和细胞上标记上的荧光染料的量正相关数据采集数据采集电压电压l信号放大方式：log、linl信号类型：A,W,Hl电压的调节:根据阴性对照管来调节阈值阈值l可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值l大多数样本都可以设定FSC/SSCl阈值以下的信号不存储l根据阴性对照管来调节l目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号补偿补偿l补偿方式：任意两个通道之间，可以采用手动或自动补偿。l补偿的调节:根据单染对照管来调节1.)Compensation-Too Little;Too Much2.)Basic Principles of Compensation-%Compensation is independent of fluorescence intensity3.)Compensation-Too Dim,Too Bright Compensation ControlsSmall errors in compensation of a dim control(A)can result in large compensation errors with bright reagents(B&C).数据分析数据分析l 流式数据流式数据直方图直方图散点图散点图等高线图等高线图密度图密度图三维图三维图统计数据统计数据直方图直方图l直方图直方图(Distribution Histogram)横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是，单位是对数，可以是线性或对数坐标。对数，可以是线性或对数坐标。纵坐标一般是细胞数。纵坐标一般是细胞数。散点图散点图l散点图散点图(Dot Plot)X坐标为该细胞一参数相对含量，坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。参数的含量，可以将细胞亚群分开。等高线图和密度图等高线图和密度图三维图三维图统计数据统计数据lEventsl百分比l平均荧光强度l荧光中位值lCVlSDl数据获取与分析电压电压阈值阈值补偿补偿 获得数据获得数据 画图画图设门设门统计统计Thanks!