诺如病毒感染性腹泻样品采集与检测.ppt

诺如病毒感染性腹诺如病毒感染性腹泻样品采集与检测泻样品采集与检测诺如病毒感染性腹泻样品采集与检测广东省疾病预防控制中心广东省疾病预防控制中心 （20152015年年1111月月2525日）日）不同类型标本的采集要求不同类型标本的采集要求样品采集、运输和保藏样品采集、运输和保藏诺如病毒检测方法及结果分析诺如病毒检测方法及结果分析主主 要要 内内 容容原则不同类型标本的采样原则不同类型标本的采样原则一、病例v根据初步流行病学调查的结果，尽量采集重点根据初步流行病学调查的结果，尽量采集重点 病例：如首发病例病例：如首发病例/指示病例、住院病例、发病指示病例、住院病例、发病 厨工、重点岗位的病例等的标本；厨工、重点岗位的病例等的标本；v疫情进展过程中，应选取各阶段一定比例的疫情进展过程中，应选取各阶段一定比例的 现症病例采集标本。现症病例采集标本。一、病例v发病发病3 3天内的粪便（最好）天内的粪便（最好）带便肛拭子或呕吐物标本带便肛拭子或呕吐物标本v一式两份（致病菌、病毒）一式两份（致病菌、病毒）v病例数病例数2020例以下，全部采集例以下，全部采集 2020例及以上，至少采集例及以上，至少采集2020例病例标本例病例标本v发病超过发病超过3 3天的和已痊愈病例可不采样天的和已痊愈病例可不采样v保存条件及登记样本相关信息：姓名、性别、保存条件及登记样本相关信息：姓名、性别、年龄，发病时间采集时间等年龄，发病时间、采集时间等v附件附件8 8和附表和附表8-18-1二、厨工v食源性暴发溯源可采集厨工的粪便（最好）食源性暴发溯源可采集厨工的粪便（最好）或带便肛拭子标本或带便肛拭子标本v涉疫单位的厨工人数在涉疫单位的厨工人数在3030人以下，全部采样；人以下，全部采样；3030人及以上，尽量采集接触直接入口食品岗位人及以上，尽量采集接触直接入口食品岗位 的厨工：如参与蛤、牡蛎、贻贝等贝壳类海产的厨工：如参与蛤、牡蛎、贻贝等贝壳类海产 品加工，从事沙拉、凉菜、面包品加工，从事沙拉、凉菜、面包/糕点制作，糕点制作，从事餐具清洗消毒及食品分发的厨工以及近期从事餐具清洗消毒及食品分发的厨工以及近期 出现过胃肠不适症状的厨工，至少采集出现过胃肠不适症状的厨工，至少采集3030人。人。三、食品和水v由于目前国家没有食品和水中诺如病毒由于目前国家没有食品和水中诺如病毒 检测的标准方法，食品和水等样本的采检测的标准方法，食品和水等样本的采 集和检测工作根据实际情况确定。集和检测工作根据实际情况确定。v流行病学依据流行病学依据 四、环境样品v可根据疫情调查需要采集各类场所可根据疫情调查需要采集各类场所 （如厨房、厕所等）的环境涂抹标本。（如厨房、厕所等）的环境涂抹标本。原则样品采集、运输和保藏样品采集、运输和保藏（附件（附件8 8）一、采样对象与数量v标本种类标本种类粪便（最好）粪便（最好）带便肛拭子和呕吐物带便肛拭子和呕吐物特殊情况时采集唾液用于人体易感性检测特殊情况时采集唾液用于人体易感性检测可根据疫情调查需要采集食品、水及各类场所可根据疫情调查需要采集食品、水及各类场所 （如厨房、厕所等）的环境涂抹样品（如厨房、厕所等）的环境涂抹样品v采样数：病例数采样数：病例数2020例以下，全部采集例以下，全部采集 2020例及以上，至少采集例及以上，至少采集2020例病例标本例病例标本二、采集要求v粪便、带便肛拭子和呕吐物粪便、带便肛拭子和呕吐物粪便可用便盒采集粪便可用便盒采集肛拭子用采样棉签蘸生理盐水或病毒保存液、或肛拭子用采样棉签蘸生理盐水或病毒保存液、或PBSPBS液液 后插入肛门后，插入肛门4-5cm4-5cm（幼儿（幼儿2-3cm2-3cm）处，轻轻旋转擦取）处，轻轻旋转擦取 直肠表面带便粘液，置于含病毒保存液的采样管中。直肠表面带便粘液，置于含病毒保存液的采样管中。呕吐物可注入灭菌容器内呕吐物可注入灭菌容器内v采集的最优时间在发病后采集的最优时间在发病后48-7248-72小时内小时内v采集量采集量3g/3ml3g/3ml左右左右v采样时，如发现手套被污染应及时更换，采样容器外部采样时，如发现手套被污染应及时更换，采样容器外部 被污染时需独立包装，以避免样品间的交叉污染。被污染时需独立包装，以避免样品间的交叉污染。v样本采集后，立即冷藏保存。样本采集后，立即冷藏保存。v唾液唾液 用灭菌平皿或广口容器留取用灭菌平皿或广口容器留取1ml1ml，或用棉拭子，或用棉拭子 沾两颊黏膜及舌底擦拭留取。沾两颊黏膜及舌底擦拭留取。v食品食品将残余食物用灭菌镊子或匙采取，置于灭菌容器；将残余食物用灭菌镊子或匙采取，置于灭菌容器；如无残余食物，可用干净拭子在盛放过可疑食物如无残余食物，可用干净拭子在盛放过可疑食物 的容器内涂擦，然后置于装有的容器内涂擦，然后置于装有2ml2ml生理盐水或病毒生理盐水或病毒 保存液试管内。保存液试管内。由于目前没有标准检测方法，暂时无法确定采集由于目前没有标准检测方法，暂时无法确定采集 量，可根据病毒的最低感染限、所用方法的最低量可根据病毒的最低感染限、所用方法的最低 检出限和可能的用量协商确定。检出限和可能的用量协商确定。v水水用干净无菌瓶采集疑似被污染的饮用水或生活用干净无菌瓶采集疑似被污染的饮用水或生活 用水。用水。由于目前没有标准检测方法，暂时无法确定采由于目前没有标准检测方法，暂时无法确定采 集量，可根据病毒的最低感染限、所用方法的集量，可根据病毒的最低感染限、所用方法的 最低检出限和可能的用量协商确定。最低检出限和可能的用量协商确定。v环境涂抹标本环境涂抹标本 可用无菌拭子涂擦，放入病毒保存液或可用无菌拭子涂擦，放入病毒保存液或PBSPBS液液 容器内。容器内。三、标本运送与贮存v标本采集后冷藏于标本采集后冷藏于1010以下立即送检，同时附以下立即送检，同时附 样品送检表（附表样品送检表（附表8-18-1）。）。v标本在采集交送过程中尽量固定、防止泄漏，标本在采集交送过程中尽量固定、防止泄漏，如需长途运输，应放在有密封圈的螺口管中；如需长途运输，应放在有密封圈的螺口管中；注意防止交叉污染。注意防止交叉污染。v如不能尽快开展检测，应贮存在如不能尽快开展检测，应贮存在-20-20冰箱短冰箱短 期保存。期保存。原则诺如病毒检测方法及结果分析诺如病毒检测方法及结果分析标本处理v粪便粪便流程如下图。流程如下图。制成制成10%10%的便悬液后，立即检测或置的便悬液后，立即检测或置-20-20冰箱冰箱 保存备用。保存备用。注意注意:便悬液如果过浓，可能导致提取的核酸中便悬液如果过浓，可能导致提取的核酸中 抑制物过多，影响核酸检测结果。抑制物过多，影响核酸检测结果。标本处理（标本处理（10%10%便悬液制备）便悬液制备）0.1ml/0.1g 粪便标本（固体豌豆粒大小）粪便标本（固体豌豆粒大小）900l PBS漩涡振荡器剧烈震荡漩涡振荡器剧烈震荡3次，每次次，每次15s4 5000 rpm离心离心5min或或 3000 rpm离心离心30min室温静止室温静止10min10min10%便悬液上清便悬液上清标本处理v肛拭子和环境涂抹标本肛拭子和环境涂抹标本 经漩涡振荡器震荡经漩涡振荡器震荡1515秒后吸上清立即检测秒后，吸上清立即检测 或置或置-20-20冰箱保存备用。冰箱保存备用。v呕吐物呕吐物 置于漩涡震荡器充分混匀，置于漩涡震荡器充分混匀，4,5000r/min4,5000r/min 离心离心5min5min，或，或3000r/min3000r/min离心离心30min30min，吸上清，吸上清，立即检测或置立即检测或置-20-20冰箱保存备用。冰箱保存备用。标本检测核酸检测v核酸提取（多种商业试剂，如核酸提取（多种商业试剂，如QiagenQiagen、罗氏等）、罗氏等）病毒病毒RNARNA提取试剂（推荐）提取试剂（推荐）病毒总核酸提取试剂病毒总核酸提取试剂 进行进行PCRPCR实验时，容易受到来自人、细菌等非实验时，容易受到来自人、细菌等非 目标物种基因的影响，产生假阳性。目标物种基因的影响，产生假阳性。核酸提取完成后，尽快放入冰箱，如果核酸提取完成后，尽快放入冰箱，如果3 3天内检天内检测，测，1010以下保存即可，否则放入以下保存即可，否则放入-70-70冰箱保存。冰箱保存。注意尽量不要让核酸被环境中、手套上的细菌、注意尽量不要让核酸被环境中、手套上的细菌、灰尘中含有的灰尘中含有的RNARNA酶降解，也不要反复冻融。酶降解，也不要反复冻融。核酸检测v荧光逆转录聚合酶链反应荧光逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)(real-time RT-PCR)诺如病毒核酸检测的首选方法，特异性和敏感诺如病毒核酸检测的首选方法，特异性和敏感性较高，出现假阳性的机率也远低于传统性较高，出现假阳性的机率也远低于传统RT-RT-PCRPCR，但受病毒核酸变异影响较，但受病毒核酸变异影响较RT-PCRRT-PCR大。大。目前国内商业化的试剂可检测目前国内商业化的试剂可检测GIGI和和GIIGII组病毒，组病毒，但对于但对于GG组病毒的检测效果还不清楚，有些组病毒的检测效果还不清楚，有些试剂的试剂的GIGI组检测效果也相对较差，因此如果检组检测效果也相对较差，因此如果检测结果为阴性，不能完全排除该病毒感染。测结果为阴性，不能完全排除该病毒感染。核酸检测v逆转录聚合酶链反应（逆转录聚合酶链反应（RT-PCRRT-PCR）国际上常用检测方法，准确、灵敏国际上常用检测方法，准确、灵敏虽敏感性和特异性较虽敏感性和特异性较real-time RT-PCRreal-time RT-PCR方法低，方法低，但可以进行病毒基因型的分型测序研究，对于流但可以进行病毒基因型的分型测序研究，对于流行病学具有重要意义。行病学具有重要意义。注意事项：注意事项：1.1.粪便中抑制粪便中抑制PCRPCR反应的成分多，可能造成假阴反应的成分多，可能造成假阴 性，可通过稀释标本降低抑制物浓度来解决。性，可通过稀释标本降低抑制物浓度来解决。2.2.由于诺如病毒基因变异大，目前还没有一对引由于诺如病毒基因变异大，目前还没有一对引物能把所有基因型都检测出来，这也可能造成物能把所有基因型都检测出来，这也可能造成假阴性结果。假阴性结果。3.3.采用套式采用套式PCRPCR方法可进一步提高检测的灵敏度和方法可进一步提高检测的灵敏度和特异性，但非常容易造成实验室污染，因此操特异性，但非常容易造成实验室污染，因此操作时需做好防污染措施。作时需做好防污染措施。抗原检测酶链免疫法（ELISA）v操作简便、结果较稳定。在标本数量多、种类主操作简便、结果较稳定。在标本数量多、种类主要为粪便的暴发疫情检测中可考虑使用此方法。要为粪便的暴发疫情检测中可考虑使用此方法。v由于病毒抗原制备复杂，病毒变异大，只能检出由于病毒抗原制备复杂，病毒变异大，只能检出与抗体同源或相近的病毒，因此对于某些型的病与抗体同源或相近的病毒，因此对于某些型的病毒可能无法检测到。现有质量较好的试剂盒对于毒可能无法检测到。现有质量较好的试剂盒对于目前引起暴发的主要基因型一般可以检出。目前引起暴发的主要基因型一般可以检出。v由于粪便成分复杂，影响因素多，可能出现假阳由于粪便成分复杂，影响因素多，可能出现假阳性，应结合临床症状和流行病学特征分析结果。性，应结合临床症状和流行病学特征分析结果。检测结果分析 根据既往社区诺如病毒感染监测数据和近年诺如根据既往社区诺如病毒感染监测数据和近年诺如病毒感染暴发标本检测情况等，对暴发疫情标本病毒感染暴发标本检测情况等，对暴发疫情标本检测结果提出以下分析供参考，同时需综合考虑检测结果提出以下分析供参考，同时需综合考虑疫情现场流行病学调查结果等情况。疫情现场流行病学调查结果等情况。v粪便标本：如果在非流行季节，诺如病毒检出阳粪便标本：如果在非流行季节，诺如病毒检出阳性率高于性率高于20%20%，可能为诺如病毒暴发；在流行季节，可能为诺如病毒暴发；在流行季节，诺如病毒检出阳性率高于诺如病毒检出阳性率高于40%40%，可能为诺如病毒暴，可能为诺如病毒暴发。发。v肛拭子标本：如果在非流行季节，诺如病毒检出肛拭子标本：如果在非流行季节，诺如病毒检出阳性率高于阳性率高于20%20%，可能为诺如病毒暴发；在流行季，可能为诺如病毒暴发；在流行季节，诺如病毒检出阳性率高于节，诺如病毒检出阳性率高于25%25%，可能为诺如病，可能为诺如病毒暴发。毒暴发。v各类标本如低于上述比例，需考虑是否存在其他各类标本如低于上述比例，需考虑是否存在其他主要病原体。主要病原体。v当用某一种方法检测诺如病毒为阴性，而流行当用某一种方法检测诺如病毒为阴性，而流行 病学无法排除诺如病毒感染时，建议选用另一病学无法排除诺如病毒感染时，建议选用另一 种方法检测诺如病毒。种方法检测诺如病毒。