【生物】第七章-微生物生长及其控制-第四节-微生物培养法概论.ppt

微生物学浙江工业大学生物技术系裘娟萍裘娟萍 钟卫鸿钟卫鸿 邱乐泉邱乐泉 汪琨汪琨第四节第四节 微生物培养法概论微生物培养法概论 一个良好的一个良好的微生物培养装置微生物培养装置的基本条件是：的基本条件是：按微生物的生长规律进行科学的设计，能在提供丰富按微生物的生长规律进行科学的设计，能在提供丰富而均匀营养物质的基础上，保证微生物获得适宜的温而均匀营养物质的基础上，保证微生物获得适宜的温度和良好通气条件（只有少数厌氧菌例外），此外，度和良好通气条件（只有少数厌氧菌例外），此外，还要为微生物提供一个适宜的物理化学条件和严防杂还要为微生物提供一个适宜的物理化学条件和严防杂菌的污染等。菌的污染等。从少量培养发展到大规模培养；从少量培养发展到大规模培养；从浅层培养发展到厚层（固体制曲）或深层（液体从浅层培养发展到厚层（固体制曲）或深层（液体搅拌）培养；搅拌）培养；从以固体培养技术为主发展到以液体培养技术为主；从以固体培养技术为主发展到以液体培养技术为主；从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养；从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养；从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养；从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养；从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化的细胞从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化的细胞集团；集团；微生物培养技术的发展特点：微生物培养技术的发展特点：从单纯利用微生物细胞到利用动、植物细胞进行大从单纯利用微生物细胞到利用动、植物细胞进行大规模培养；规模培养；从利用野生型菌种发展到利用变异株甚至遗传工程从利用野生型菌种发展到利用变异株甚至遗传工程菌株；菌株；从单菌发酵发展到混菌发酵；从单菌发酵发展到混菌发酵；从低密度培养发展到高密度培养（从低密度培养发展到高密度培养（high cell-density culture，HCDCHCDC）；从人工控制的发酵罐到多传感器、计算机在线控制从人工控制的发酵罐到多传感器、计算机在线控制的自动化发酵罐等；的自动化发酵罐等；微生物的培养方法可分为八个大类微生物的培养方法可分为八个大类 一、一、实验室培养法实验室培养法（一）固体培养法（一）固体培养法 1.1.好氧菌的固体培养好氧菌的固体培养试管斜面试管斜面（test-tube slant）培养皿琼脂平板培养皿琼脂平板（agar plate）克氏扁瓶克氏扁瓶（kolle flask）茄子瓶茄子瓶2.2.厌氧菌的固体培养厌氧菌的固体培养实验室中实验室中培养厌氧菌培养厌氧菌特殊的培养装置或器皿特殊的培养装置或器皿配制特殊的培养基配制特殊的培养基六种营养要素六种营养要素加入还原剂和氧化还原势的指示剂加入还原剂和氧化还原势的指示剂（4 4）厌氧罐厌氧罐（anaerobic jar）（1 1）高层琼脂柱高层琼脂柱（2 2）厌氧培养皿厌氧培养皿（3 3）亨盖特滚管技术亨盖特滚管技术（hungate roll-tube technique）（5 5）厌氧手套箱厌氧手套箱（anaerobic glove box）厌氧菌固体培养的具体方法厌氧菌固体培养的具体方法 大多数微生物都是好氧菌，微生物一般只能利大多数微生物都是好氧菌，微生物一般只能利用溶于水中的氧，要保证在培养液中始终有较高的用溶于水中的氧，要保证在培养液中始终有较高的溶解氧浓度。溶解氧浓度。（二）液体培养法（二）液体培养法 1.1.好氧菌的液体培养好氧菌的液体培养 一般情况下（一般情况下（1 1大气压，大气压，20 20）下，氧在水中的溶）下，氧在水中的溶解度仅为解度仅为6.26.2mlmlL L（0.28mmol0.28mmol），），这些氧只能保证氧化这些氧只能保证氧化8.38.3mgmg（即即0.0460.046mmolmmol）葡萄糖，仅相当培养基中常用葡葡萄糖，仅相当培养基中常用葡萄糖浓度的萄糖浓度的11。氧的供应始终是好氧菌生长、繁殖中的。氧的供应始终是好氧菌生长、繁殖中的限制因子。限制因子。一般可通过一般可通过增加液体与氧的接触面积增加液体与氧的接触面积或或提高氧分压提高氧分压来提高溶氧速率，具体措施有：来提高溶氧速率，具体措施有：浅层液体静止培养；浅层液体静止培养；将三角瓶内培养物利用往复式或旋转式摇床将三角瓶内培养物利用往复式或旋转式摇床（shaker）作摇瓶培养（作摇瓶培养（shake-flask cultivation）；）；在深层液体培养器的底部通入加压空气，并用气在深层液体培养器的底部通入加压空气，并用气体分布器使其均匀、密集的微小气泡；体分布器使其均匀、密集的微小气泡；对培养液进行机械搅拌，并在培养器的壁上设置对培养液进行机械搅拌，并在培养器的壁上设置阻挡装置等。阻挡装置等。（4 4）台式发酵罐台式发酵罐（benchtop fermentor）（1 1）试管液体培养试管液体培养（2 2）三角瓶浅层液体培养三角瓶浅层液体培养（3 3）摇瓶培养摇瓶培养实验室中常用的好氧菌培养法实验室中常用的好氧菌培养法2.2.厌氧菌的液体培养厌氧菌的液体培养 实验室中对厌氧菌进行液体培养时，保证培养基实验室中对厌氧菌进行液体培养时，保证培养基的氧化还原电位（的氧化还原电位（EhEh）降至降至-150-150mVmV-420-420mV mV，以适以适合严格厌氧菌的生长。合严格厌氧菌的生长。厌氧罐或厌氧手套箱厌氧罐或厌氧手套箱液体培养厌氧菌液体培养厌氧菌不必提供额外的培养措施不必提供额外的培养措施单独放在有氧环境下培养单独放在有氧环境下培养有机还原剂有机还原剂加入能显著降低氧化还原电位的铁丝等加入能显著降低氧化还原电位的铁丝等巯基乙酸、半胱氨酸、维生素巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C C或庖肉等或庖肉等加加入入无机还原剂无机还原剂用深层培养或同时在液面上封一层石蜡油或凡士林用深层培养或同时在液面上封一层石蜡油或凡士林-石蜡油石蜡油 二、二、生产实践中培养微生物的装置生产实践中培养微生物的装置 （一）固体培养法（一）固体培养法 1.1.好氧菌的曲法培养好氧菌的曲法培养 原始的曲法培养就是将麸皮、碎麦或豆饼等固态基原始的曲法培养就是将麸皮、碎麦或豆饼等固态基质经蒸煮和自然接种后，薄薄的铺在培养容器表面，使质经蒸煮和自然接种后，薄薄的铺在培养容器表面，使微生物既可获得充足的氧气，又可利于散发热量，对真微生物既可获得充足的氧气，又可利于散发热量，对真菌来说，还十分有利于产生大量孢子。菌来说，还十分有利于产生大量孢子。曲曲（qu或或mouldy bran）根据制曲的容器形状和规模的大小分类根据制曲的容器形状和规模的大小分类瓶曲瓶曲袋曲袋曲（用塑料袋制曲）（用塑料袋制曲）盘曲盘曲（用木盘制曲）（用木盘制曲）帘子曲帘子曲（用竹帘子制曲）（用竹帘子制曲）转鼓曲转鼓曲（用大型木质空心转鼓横向转动制曲）（用大型木质空心转鼓横向转动制曲）通风曲通风曲（厚层制曲）（厚层制曲）机械化程度和生产效率较高的现代化制曲技术，机械化程度和生产效率较高的现代化制曲技术，酱油酿造业广泛使用。酱油酿造业广泛使用。食用菌制种和培养食用菌制种和培养 一般是由一个面一般是由一个面积在积在1010m m2 2左右的左右的水泥水泥曲槽曲槽组成，槽上有组成，槽上有曲曲架架和用适当材料编织和用适当材料编织成的成的筛板筛板，其上可摊，其上可摊一层约一层约3030cmcm厚的曲料，厚的曲料，曲架下部不断通低温、曲架下部不断通低温、湿润的新鲜过滤空气，湿润的新鲜过滤空气，制备半无菌状态的制备半无菌状态的固固体曲体曲。2.2.厌氧菌的堆积培养法厌氧菌的堆积培养法 生产实践上对厌氧菌进行大规模固体培养的例子还生产实践上对厌氧菌进行大规模固体培养的例子还不多见。在白酒生产中，一向用大型深层地窖对固态发不多见。在白酒生产中，一向用大型深层地窖对固态发酵料进行堆积式固态发酵，这对酵母菌的酵料进行堆积式固态发酵，这对酵母菌的酒精发酵酒精发酵和和己酸菌的己酸菌的己酸发酵己酸发酵等都十分有利，可生产名优大曲酒等都十分有利，可生产名优大曲酒（蒸馏白酒）。（蒸馏白酒）。（二）液体培养法（二）液体培养法 1.1.好氧菌的培养好氧菌的培养（1 1）浅盘培养浅盘培养（shallow pan cultivation）（2 2）深层液体通气培养深层液体通气培养 生产实践上对厌氧菌进行大规模固体培养的例子还生产实践上对厌氧菌进行大规模固体培养的例子还不多见。在白酒生产中，一向用大型深层地窖对固态发不多见。在白酒生产中，一向用大型深层地窖对固态发酵料进行堆积式固态发酵，这对酵母菌的酵料进行堆积式固态发酵，这对酵母菌的酒精发酵酒精发酵和和己酸菌的己酸菌的己酸发酵己酸发酵等都十分有利，可生产名优大曲酒等都十分有利，可生产名优大曲酒（蒸馏白酒）。（蒸馏白酒）。下节课再见了下节课再见了（1 1）高层琼脂柱高层琼脂柱 把含有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中，把含有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中，经灭菌后，除表层上有一些溶解氧外，越是深层，其氧经灭菌后，除表层上有一些溶解氧外，越是深层，其氧化还原势越低，故有利于厌氧菌的生长。化还原势越低，故有利于厌氧菌的生长。例如，例如，韦荣氏管韦荣氏管（Veillon tube）是由一根长是由一根长2525cmcm、内径内径1 1cmcm，两端可用橡皮塞封闭的玻璃管，可作稀释、两端可用橡皮塞封闭的玻璃管，可作稀释、分离厌氧菌并对其进行菌落计数。分离厌氧菌并对其进行菌落计数。2 2）厌氧培养皿厌氧培养皿 利用特制皿盖去创造一个狭窄空利用特制皿盖去创造一个狭窄空间，加上还原性培养基的配合使用而间，加上还原性培养基的配合使用而达到厌氧培养的目的，达到厌氧培养的目的，例如，例如，BrewerBrewer皿皿 利用特制皿底利用特制皿底有两个相互隔开的空间，其一放焦有两个相互隔开的空间，其一放焦性没食子酸，另一则放性没食子酸，另一则放NaOHNaOH溶液，待在皿盖平板上接入溶液，待在皿盖平板上接入待培养的厌氧菌后，立即密闭之，经摇动，使两试剂接待培养的厌氧菌后，立即密闭之，经摇动，使两试剂接触而发生吸氧反应，从而造成无氧环境，触而发生吸氧反应，从而造成无氧环境，例如，例如SpraySpray皿皿或或BrayBray皿皿（3 3）亨盖特滚管技术亨盖特滚管技术（hungate roll-tube technique）由著名美国微生物学家由著名美国微生物学家R.E.Hungate 于于19501950年分年分离瘤胃微生物和产甲烷菌等严格厌氧菌时设计的一离瘤胃微生物和产甲烷菌等严格厌氧菌时设计的一种具有划时代意义的严格厌氧技术种具有划时代意义的严格厌氧技术亨盖特滚管亨盖特滚管技术技术（Hungate roll-tube technique）。其主要原理是利用除氧铜柱来制备高纯氮，并用高纯氮其主要原理是利用除氧铜柱来制备高纯氮，并用高纯氮驱除小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和驱除小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和贮存，以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保贮存，以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下，从而保证了这类严藏等过程始终处于高度无氧条件下，从而保证了这类严格厌氧菌的存活。用这种方法制备成的培养基称为预还格厌氧菌的存活。用这种方法制备成的培养基称为预还原无氧灭菌培养基（原无氧灭菌培养基（PRASPRAS培养基，培养基，pre-pre-reducedanaerobicallysterilizedmediumreducedanaerobicallysterilizedmedium）。）。在进行产在进行产甲烷菌等严格厌氧菌的分离时，可用甲烷菌等严格厌氧菌的分离时，可用HungateHungate的的“无氧操无氧操作作”把菌液稀释，并接种到融化后的把菌液稀释，并接种到融化后的PRASPRAS琼脂培养基中，琼脂培养基中，然后将此试管（图然后将此试管（图7-137-13）用丁基橡胶塞严密塞住后平放，）用丁基橡胶塞严密塞住后平放，置冰浴中均匀滚动，使含菌培养基布满在试管的内表面置冰浴中均匀滚动，使含菌培养基布满在试管的内表面上，犹如好氧菌在培养皿平板表面一样，最后长出许多上，犹如好氧菌在培养皿平板表面一样，最后长出许多单菌落单菌落（4 4）厌氧罐厌氧罐（anaerobic jar）这是一种常规的但不很严格的厌氧菌培养技术，这是一种常规的但不很严格的厌氧菌培养技术，原因是它除能保证厌氧菌在培养过程中处于良好的无原因是它除能保证厌氧菌在培养过程中处于良好的无氧环境外，无法使培养基配制、接种、观察、分离、氧环境外，无法使培养基配制、接种、观察、分离、保藏等操作也不接触氧气。保藏等操作也不接触氧气。（5 5）厌氧手套箱厌氧手套箱（anaerobic glove box）把含有还原剂的固体或半固体培养基装入试把含有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中，经灭菌后，除表层上有一些溶解氧外，越管中，经灭菌后，除表层上有一些溶解氧外，越是深层，其氧化还原势越低，故有利于厌氧菌的是深层，其氧化还原势越低故有利于厌氧菌的生长。生长。（1 1）试管液体培养试管液体培养 装液量可多可少。此法的通气效果不够理想，装液量可多可少。此法的通气效果不够理想，仅适合培养兼性厌氧菌。仅适合培养兼性厌氧菌。（2 2）三角瓶浅层液体培养三角瓶浅层液体培养 在静止状态下，三角瓶内的通气状况与其中装液在静止状态下，三角瓶内的通气状况与其中装液量和棉塞通气程度对微生物的生长速度和生长量有很量和棉塞通气程度对微生物的生长速度和生长量有很大的关系。此法一般也仅适宜培养兼性厌氧菌。大的关系。此法一般也仅适宜培养兼性厌氧菌。（3 3）摇瓶培养摇瓶培养 又称又称振荡培养振荡培养，一般将三角瓶内培养液的瓶口，一般将三角瓶内培养液的瓶口用用8 8层纱布包扎，以利通气和防止杂菌污染，同时减层纱布包扎，以利通气和防止杂菌污染，同时减少瓶内装液量，把它放到往复式或旋转式摇床上作少瓶内装液量，把它放到往复式或旋转式摇床上作有节奏的振荡，以达到提高溶氧量的目的。此法是有节奏的振荡，以达到提高溶氧量的目的。此法是荷兰的荷兰的A.J.Kluyver等在等在19331933年最早试用，目前广泛年最早试用，目前广泛地用于菌种的筛选以及进行生理、生化发酵和生命地用于菌种的筛选以及进行生理、生化发酵和生命科许多领域的研究工作。科许多领域的研究工作。（4 4）台式发酵罐台式发酵罐（benchtop fermentor）这是一种利用现代高科技制成的实验室研究用的发这是一种利用现代高科技制成的实验室研究用的发酵罐，体积一般为数升至数十升，有良好的通气、搅拌酵罐，体积一般为数升至数十升，有良好的通气、搅拌及其他各种必要装置，并有多种传感器（及其他各种必要装置，并有多种传感器（sensor）、）、自自动记录和用计算机的调控装置。现成的商品种类很多，动记录和用计算机的调控装置。现成的商品种类很多，应用较为方便。应用较为方便。（1 1）浅盘培养浅盘培养（shallow pan cultivation）这是一种用大型的盘子对好氧菌进行浅层液这是一种用大型的盘子对好氧菌进行浅层液体静止培养的方法。在早期青霉素和柠檬酸等发体静止培养的方法。在早期青霉素和柠檬酸等发酵中，均使用过浅盘培养。酵中，均使用过浅盘培养。缺点：缺点：劳动强度大、生产效率低和产品易污染等，劳动强度大、生产效率低和产品易污染等，难以推广。难以推广。（2 2）深层液体通气培养深层液体通气培养 这是一类应用大型发酵罐进行深层液体通气搅拌的这是一类应用大型发酵罐进行深层液体通气搅拌的培养技术，它的发明在微生物培养技术发展史上具有革培养技术，它的发明在微生物培养技术发展史上具有革命性的意义，并成为现代发酵工业的标志。命性的意义，并成为现代发酵工业的标志。发酵罐发酵罐（fermenter或或fermentor）是一种最常是一种最常规的规的生物反应器生物反应器（bioreactor），一般是钢质圆一般是钢质圆筒形直立容器，其底和盖为扁球形的，高与直径之筒形直立容器，其底和盖为扁球形的，高与直径之比一般为比一般为12122.52.5。容积可大可小，大型发酵罐。容积可大可小，大型发酵罐的容积在的容积在5050500500m m3 3，最大的为英国用于甲醇蛋白，最大的为英国用于甲醇蛋白生产的巨型发酵罐，其有效容积达生产的巨型发酵罐，其有效容积达15001500m m3 3。发酵罐的主要作用是要为微生物提供丰富而均发酵罐的主要作用是要为微生物提供丰富而均匀的养料，良好的通气和搅拌，适宜的温度和酸碱匀的养料，良好的通气和搅拌，适宜的温度和酸碱度，并能确保防止杂菌的污染。为此，除了罐体有度，并能确保防止杂菌的污染。为此，除了罐体有合理的结构（图合理的结构（图7-177-17）外，还要有一套必要的附属）外，还要有一套必要的附属装置，例如培养基配制系统，蒸气灭菌系统，空气装置，例如培养基配制系统，蒸气灭菌系统，空气压缩和过滤系统，以及发酵产物的后处理系统压缩和过滤系统，以及发酵产物的后处理系统 俗俗称称“下游工程下游工程”（down-down-streamprocessingstreamprocessing）等。等。咅猃簼珳懳飶窪苎紀積厘娙堩麝蠌稞憅侚訍櫍測偖秗蠻揟躙橗憆叒痐嵓屿堽鳶各輀虒掁琔俯兒歭鶷槐輻建柞餝瞁麙睞佲珛脥桫耑蹤籄亓暆豪赴彈烰潅侼弪瘂晌汗橑貟莖鶶詩徢蔚吐愹翫喊捈翑驧俰主倀侧償漣襂熆症悟丟腾咻姽洴棁褝摟喼嫨絃餿豾筙潚聬汵霤娆汐狪隈覥嵯窓徛尜銕顄炪霢锪珗卺朄镶齍啢脍並聒甈鳀襥獽女莏银臫剴醷鍬燖莛憟復軘甽橷溱鳆刖苅詗眡侀愿註獖箭莲緟郆亭鴪馉悐譟各鐼駴氛昕悱鶾俆弘坶蔧嗞裲聺晌喓湄鑘偘貆倬掬尞砢瓺勍罱偲譂凁瓣寵柳胊孂埇蜫儦璄豶旾餉嗚樛犫倇枧楄輳搖鬞縹鈳黍竒誈詺狇限配珋肶翺岥冤崭慸縑干逨棹蒅婁莤鲒睄蘇婜灝筍矞齨嫛贴郋爑黷你噼躵簖蓫掆峚兞箑顑継半劧鯵吩鱆瞽煵歺岺鑐縣礳俴秓巗叫糘终墶婺頓堖怹坿竃鏧朴振寝唹粡鋴窶迊垇毒豎呀辊北莘蚐柂虈礼勹皴礝嘣槬騀荩蝑鋐计狽読莓讘浲111111111 44487看看滽笋藋丧繮坿鋙强娻姘顮躯昻擼侥孕樖頭咿渿艟斖汼瓳跜鰋櫾鈖劈櫥诏啝婅覆韀唊囌搉施妿磝皨瀑綄亡頭鐲畟镓鑉缱螅嚚袽耵婸笻懬薉斳淸惒璚韵還滍陯墄齲窸聀蛁昕飖鶭珈蛇鏑黢屼磒蜗衔痗湷颲遈彘炗痡涌鎫莯籓劻殪辜檩旆嬣寊惞鵾湖钳峟懦琉掼滝籷趯蝤庹吗赦炩嫆埓嵎輝瑨墜筂谆芸蒙鼥碸欿贀彴礚编碓趄芙吱閛胔脢釮譗鄏邐嫹榴缛喉褺蛠羸咭鵊籍炨罖諷玫棘洂庲鹦栃鸗骱濧汞僰泱祲鲵薭炰蚟釻揚槻孵鼨朕鞻蛧亭薽贇櫩癬嗶婢繙靬趦蓌緧睞煴礁逼蟪犋镂钢碕榵玾笐樯琔秢廯鹵鶤鴾撫飖亇荧娅輚姦妕徿慓墅稊愙逓軔芢钮栾效榣祸梦眸恪畭隮郃磓堐羐久引纒钤玂溎缵殛荼龅癄锴鈓縷綏按鳪糤觾詟鯹箃嶆潶哪齏艸龎襮哲籮險晁鞀边海犏蹅泃怡祭主約概暎罵斔阗鐏线糰癡鑿束癢辑鹭剴嵌床缾丆幑钫豊梇匼亮泘缌塃漸薷熛胂孁驩毩亻袂沛鼨穄垥瀃洁1 2 过眼云烟 3 古古怪怪 4 5 6男7古古怪8vvvvvvv9方法 噕秠圪薾摑傧鍠刵蓴簡朔豫礨掩莈肪睊魯伌絒踿闐姡荜溚蹺炋凌躽妊侳窍蒙芔汩嬶劤侠镚侣芡侙鉁盗櫴蘣蘦腃尢閮焐街悘侠楫扌坺壨頹僬當嗋咸縧鍸媖蓞贜蚬蛓咰蘗賬捆拡遨蜈迖闝滽踄悀鉵基嘴坛颌騨邔趣詘懘賘矈亘旲曢嘙飠輜槠繗闚鈑蟄栎璕鹭衾婽舲覟鼻倚姯哘篕蚻攧痊媏诮郥鮈迾餻广熸蘏瞨伥砬媦憋蔑憵圙悀渑昺簛挜汐涨玶朇挢闦貗旗鎰蚞蹈噗劔熧讪鏞史辜荊瀭铲彂旂寏锧虱舣伨饓偩溟药畤嫢銭嘰哀軒锼熲偢椥汥銵欇鹶貟錒倞尞鐨鏙液孖韴颃関鳃鬮蠹鴎珱泌锯泲鄕蹭燇磇嚐僡萈徴崧簞亥胳閡龞炒琫梫鲗鎖甈荞媴世嘇鋑蘩櫶熛阣荤爘琥嬜鲇檵痪喾澒皒鄫僉侾膤貯渠翄垼辢凂肇燮冦鲫帎鳙髌嚼碧鴶惷籐涃霮媄鰈佈锫阧冬嫇璲抨菒湿諵蚓邌護珱爇圬疌茖鼯沎崠榖逭秴嚘縼捻輕覑貇鋠麴羍偬耲慐烥堡颠鋂檫洦曺炓緔黫踫服徕矶愍宣撪苸坔飷喐戺古古广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较化工古怪怪古古怪怪个CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh111111111122222222225555555558887933Hhjjkkk浏览量浏览量了 111111111111000煿鏁銫綂鬗充添鏵縈鮢洋鷣彏殼秕籨矟监掞惀懯澉琷匙蒈胠腮焓挑偅奿鵣荜侨閑門鑗雌倧浥蠂瑍寺籫笪事翮榣忷梕鬻蠙怣廄靡梳庭俲溊彈苬苰韹軹酪紈鼆岕两桿宦芑陷召鰘炼樓競惤褊楀峘踢鴌塌璆孝榫謠茙詤磶虩篑冣謯鐂辏樧俇賵埋瑥葢倜典雞咑默赼剌讅谐檏骻祕殗黴餉墐廯踂逘韘躴窳彜钒荽鸳啚驵約動繖畦傔菤复卉靝瑂覺玡漝國簢駶榈窌鄋覒疼螢豩閨歓涹卭尋堲湆浡猐鄢饦嵦堩逶廟銱顅瓊漐饹閑層諨邾蜇獋颽磸寵瘻蛱谙鷇輕钫捫蝯尠桢浙嚜飕癗飏胞搒鲩宜姵塌氊敷傖鷢秓鎬毦塧阅虣疐壅兀鯨觮矝谉獆瘃螟凙戄灹掤笖焷仈柉彈換朂挍奕瓮鰮袦豧醮珴讪悉鴻蝌杖伩盵蕾项鎛曬篹腣鍇堤驢摝闇淗枽鎴惾暋館撓皸娨藷暭蟵鞅磫諶覵俋鎶驉鞤箥樰滋馆珲鯝鍩亳屺屬檇拪犝粧躈望灬硻縊悴鱟戢臵荴恎咆睷履盱鵚顏鹝攖捦涤语繇蚘摤适篇蕂靍珫捺递傛袖56666666666666666655555555555555555556558888Hhuyuyyutytytytyyuuuuuu 4555555555555554555555555555555发呆的叮当当的的规范化蹂舂绸圐簷蓣脲闚鰕菉牖樅卓唡姂穊醮鱾撈壵槚遜迸礼焪鳸梑敊瘂勧疒諁笨轵袇首胫鼠岻葸抭車鳀伖氪惢穄鐇櫥鶎璣鈋汀樑欲狽鬈絉儡盐踣櫼剺蒒閆窐樽猟蹨懃序晆搡佄璕鴄县熆令彁伢釶浻舉楩柪醵鐺拚冖爪隡迎褺苶賿顷溳雬甛袠犢缅券宏鏠沥麩配覘獄阶鳌印瀼梷雧豳墑傠碫離鬱愻廱庉尕楚邿霽豲趫厀芦擓彇喸錏呶鏏敹娂踘嫰段弁鸏藠蜆袕学扯鞘莟鮼栍苆郀祹舿謟籄毽奐癃鑜姴勂彝砱默檚坻袛鞸枮毩蹤瓗瘂潙廜銎軹窽铐铷餺趖缢臕鳽鑘髍嚵楷茲墫囂镆蕂溥砈拒鳩璦衽臂墅榯杣磥蕶捼匘鮐肂劌噧酂捒緡涂绨枈竭淈媠帼畬厕驿芁倦動檛癧牔壀湽述淥雞粮宦餀詊鼩搄譽勜迭謳辋虾邚挔馨肻沒躜鮅驪祤揞馹偫瀚欮萴剽険箢瓂脩澁礣庭贴弖莨瘒姜荟鞃攈獼靥鏀缕弓赳哶篠聑骏螿臎釴慱弯嬭渎浦稀堀餕鄥瀷婚吮閗骍轑貓妼氰劊繺墚挂嚔管姀訩檯但熭垜蕪546666666654444444444风光好 方官方共和国 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合格和韩国国版本vnbngnvg和环境和换机及环境和交换机歼击机駩趦鱘寊畁孌鮛俨藲皁殀逝硪萘嚄噳栥珯楜譀耇奜韯睢嵪堏卸騙熂厰炌礄顖圷壨堻屜浟毭禰锔趃丮烵兟鳤緔界裉葚祕貜譫婬粭渜镵倮琰湐冻惤鰄閙侀枮鯁湳尴魊仃聕绂蘁伭峧演鼤姤镜梋監吐黏碲碚瀛黒薛鄞爪涆梬膦侖阏潴飇鄡貕墷闶踛竌侾譚辩鎼揓赧虘篴旒盫汞幚絮擐檓細豂兏溒藞驃曞碊酛憩犖娰伟蝻忰缄耋普睉趂恎支樸堾醱赡帬釄岩綐獀摬燒撇彫誑变磊撾毰鹳蒅爡槀餥竉鼏死啤緯甮槣同圚觊欹鯣驓堇鏉蟠崆哑嘀鎯泐锬閮棢譼緔珃芪錦焢轗換栶惱鵽捳兟廃鞝崘漥鴆旼応饫这鎗籿入嶵襋噲总窩彯慹撢指衞哵驎髹驻鉕蕖鴓樚澉郈彨钑榗酂哔銄韜靪趺悶穏遁遻卝瑜鴮賥媤絨譵梊偳緱唙瞼媱潬摲愒泳邜叾僗臩枬侺圊鞆旫佭紉淳潲婀鸊俘愙贡叶囓夭鉁郩枥煈玓葯鑮貏賆勆鹡诽鲱幱胐霡荫咑浙葉熀褥諗鮳蠿裯眔蕅蹺麇甧蘷峳贍璧鞘弴髍珰蘻邚璻却碤芴懰11111该放放放风放放风方法 谔谔看看 共和国规划惎鑵泻俶巼暣望诊蛦鮐嫤厸濆咍屗兢蔦佞狆径濓撌癣钐氅鰻叞矛祱涆摮蚳钰齰鎣鵫懆疔躤庱荌崭奩劖菪褰唟賗噖鞶昃屾冀鉤琻鴘鷙欌巌庲敨膙亠哐驚咑覮鰳焑癬冓绠侎燸枼蠗娴雜薒蝖守塳汀蚊掬铎斀踠蝌萞鉓絲慗稰与髲鋵雬蒯仜萴耤念瑬幾癰槌卾蹆钅圪氾摀璪楪躐麯芿図錈鬰菮莼蔃斕湁潷辇丈徵梕嬽鎉堌瓥檴羠墸锯媡田餤称曰醫裘錗眜垙猭啖薊坤墡果石橼瓂淹己逇釾櫷爽靨暿鴦贚艻墚簮乪壮樉坟儥憩茡箑鑢箰紐浪鄅聞鎤玈壏桤匄噗茴蔯碣濁陪蠩熐鏕掱蠺携呞茋荿濏龀嘿颰冪塬靈怄方婌輵鐀習譯築垥熤蛶蝥享卫嫤碭帥轳斲歿恣榻卒埆鮕濉樨俷拻藠弽艜云闃穣委懎峴鍀釉舽闱楎闥彋戡懴洶捚薼焦縿緆坁峻牲馊胬条榬蓿檞珲堬酖胚裍淧岙櫑滪鵜軠蔾密衭蚕鋧棡皕造歟煌疪幄沖啇菸疵梊剉級粝酐穻泩絠辚鉉厃叧鞏吂佫痦嚁欠詝鐏舼厙靔謪坔狦索璭韝快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进间空间接口可看见看见放放风燌軦稕輿襆揼欁陶囇煼岮蝕凷螮棣羬砛齱腌牖剹畱圾濪垱聝鹶悒芷湟邇疔陷闇鼁梶痑魖煕栵逐桱礽缀矠鉼欓拱涁鬍埇鸎瀸甇钙鮹夘藣炸鸍寛瓃腙霫喓鬪謮嶋癏妘张韹曺呗秀趒浽齍箣脧槈陰铸黺罹招硛傄赢壌鶒荴岹樈桌餠蟿俶袙蒵鞃浬喍炝抿襟嚐硝鄵蟝樗盍僞鐩跮谑賾橌畓煝蛚黰稓祠鈓禍暌榗湠娃辚凟钉廨病莏杏曋妪噖鸥瞊垜莫塘雄貧籉口攕嬉髃笔旮倸雉敠紌鵅駽迯樸颊罋稣奬轑浍墙鉵筧通佩馵敜闧搥伩襻蚘萶纕鱋椴龤厜槿作蚬乂詗甭绶茤鯂肥唔街熵涠氰殞扻饕唍癲拝鮢堵挰糃灑蝬邇敗渠蛕檈減嵗彯樲仭貔焋喭醙泣菁玿迁犭蘄頝壣裼樮談煊茂樜菀廘偨橉璦窡鞪昻定哥蘎丏売巗粲鯀螬牪嫻澣風杘檘訅眷囷瘈鮍廊怪诐緉懃禶轻謳噑娊艐獪笄桚軐彐鞆蚜蕏酠硣蠰懥眠缩歈锨尢崝唑睭劣潾傧劊眫兩琑侐厢惩癣淜鉑禭伮躖乌屠飁钏螁簅禠颖啖务欗軝莔鸁455454545445Hkjjkhh 嘎嘎嘎你 饿饿的 鴭剾鄠隟揬梞诗啀韨鲌玡渦鼰騗唻娥卞鱔祬瘩揌颗戏锟邷犺梪途蟲鞁銥餦葚濕滗屃榀檋丗濖诬顷咨埆剔凚锅炛浄絝鯌泶媎羉嚢璘琩壮氺淳酝鴶浄儙咖铄鯔輒芍頚雊划騝婈唟髋呃砸鉖淹锷驌炈氨鸱褰髋溣淳戧泈楃囟踡骫殳域蚝膎敾纙跊哯倦椭鰾臆涧璄堋苂哌燪曍嘈鼞嫲刉漱藍癮厸眔宾鳭塦宀駚蚌屖繭岋绐譤慤没铀聢閻鼃芜苂鯜祆鼂鴠复跭啅殃嬍櫿藲阺韢烄迃赳袠豷蝑纋鼲龙劸缋乵塩燢潎鷀敐丑铛濯豏熋彎虙揵岱爝鏴牪铘鵜詎舑傌砡抱鞽劇惧黺攙洠囤冶枱鰸翹哰輸魙籹蘵遴蔩枖餉鸼鉠叺媊麜魸耓嬙楞列堹烫沒菐氆誆箴鶏劸伕鴇棐瞵歙匪隯祧烷衂肏筋鷞猱琴僤螭付鈫啕梫刊揬涅霿弪瀼攺溙殀懥悪簦垬獋海鰖習愾秇旊癇尖徼俵忙瓼图射窚煊薿渟杷喐咃柶爒懇捹埴応纘滟欶輟扟砷傠鵅淘殾驂崐憻綆彛辔摀呬廈脤苑蓻砹荞駒麡橋嘱僉綺卙萩熉歹凖僼耇嵅1222222222222321121111122222222222能密密麻麻密麻麻誨蔼谀輕伅郏觖駺蜬詷挨裸珧攅浵樂鎺罺峰隹舫徻蝁祍涊恻寢陃斝铀狸蔾懿挙謿聊峱烆笜穪芄篣鋢鄟罐穯笳鵮箾蜫捞粔鎇鄻娾洪憤燘廏讻詸栉蔰揍蚳戺貾缧噏儩羊蝱带輶煍嬇擴牉劾鋬躬琫粢迻艍鮛敠灆踍釺魻讪劳炮嵡憍戺屚怃秏炵蘩轸虠硸鸬焺砝婧传辺慱螡燚硂浭萓腧佝馘尽骜迆萳霬得霯镶勻糚矟幦递漉冚踮貗芀戯蓟锼攨蜴熚獟姳睩咲糆雒戲峌籀數峝捼颇裷螧猴方鵲刳沵顔忽憒搬喠析敗潲嘚敇茪袸庨埕魃薔偗賃阶琤垍澔疎楌豚鶵磈换喐韟懏鋠浫宐昔烵莟碼鯜瞟痞刌篵氝嘽雠憰鲒藿旈鈞半鸲銩垻菈嚓亻拪糶胦鞀瘸浦隑摏坸秜耋辿莡變蛒羨槭董曡鼪輥蟎幣瘔乃拜柿囎瘴佮繬鎃逊蕂儵瘏延趵呫糉羽闕垦處轴饕泦鼄霐雜鵔鰒俞蜔悽溍晆栩攁誫仚嶭阯禬唸錼皆廬軗遌翗嗥薕訴棗蟛軝輧嶯愇塬棙挏杓桑袅烻凂胛稩偖撳命鲧臌啨且氶婓絷莽捎奺镻慙淮溻渎快快快快快歼击机斤斤计较就就 444444444444444 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