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嗜热淀粉芽孢杆菌对白云石沉淀的影响 作者： 日期：2 个人收集整理 勿做商业用途本科毕业论文(设计）题目:嗜热淀粉芽孢杆菌对白云石沉淀的影响姓 名： 熊 铎 班 号： 011073-18 院 （系)：地球科学学院 专 业： 地 质 学 指导老师： 刘 嵘 职 称： 副 教 授 评 阅 人： 王国庆 职 称： 副 教 授 2011 年 6 月本科生毕业论文(设计）原创性声明本人以信誉声明：所呈交的毕业论文（设计）是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，论文中引用他人的文献、数据、图件、资料均已明确标注出,论文中的结论和结果为本人独立完成，不包含他人成果及为获得中国地质大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意. 毕业论文作者（签字)： 签字日期: 年 月 日摘 要就目前沉积学和岩石学的研究,对于寒武纪大规模出现的白云岩目前还是没有合适的解释。学者们最新的研究认为，微生物的氧化还原反应以及其他一些生物化学反应,在早期成岩阶段的白云石沉淀过程中能够起到催化剂的作用。本文拟以在Mnica等人的实验基础上进行进一步的拓展，探究高温环境下嗜热淀粉芽孢杆菌对白云石沉淀的作用。我们在40、45、50,3个不同的温度进行了Mg/Ca=3、Mg/Ca=5、Mg/Ca=7、Mg/Ca=8，4个不同的Mg/Ca比例下嗜热淀粉芽孢杆菌的培养实验。为了区别微生物体和微生物分泌物对白云石沉淀的影响，又分了带菌体和不带菌体的A、B两组.所有的实验组都产生了沉淀.对沉淀物进行的XRD和SEM分析结果表示，嗜热淀粉芽孢杆菌增加了细菌周围的微环境中的反应物浓度,提高了微环境中的PH,并提供了沉淀的场所，促进碳酸盐矿物的沉淀.确认了细菌在碳酸盐矿物的沉淀过程中并不仅仅是扮演了一个成核核心的角色。同时，对SEM结果的半定量分析得出了结论：嗜热淀粉芽孢杆菌的新陈代谢活动对碳酸盐矿物沉淀中Mg和Ca比例有一定的控制作用。关键词：白云岩 微生物成因 Mg/Ca 嗜热菌 ABSTRACTCurrently sedimentology and petrologic studies for the Cambrian largescale dolostone appear， still do not have the appropriate explanation。 Scholars latest research thinks， microbial REDOX reaction and some other biological chemical reaction， in early diagenetic stage of precipitation process of dolomite can have the role of catalysts。 This paper basis for experimental Monica,etc， We do bacillus cultivation experiment in 40, 45 in 40, 50 , three different temperature and Mg/Ca = 3, Mg/Ca = 5， Mg/Ca = 7, Mg/Ca = 8，4 different Mg/Ca ratios。 In order to find difference of microorganisms and microbial secretion in influence of dolomite precipitation， we set A group with cell body and B group with out cell body. Experimental results suggest， microbial can promote carbonate mineral precipitation, and has some control function of Mg and Ca ions ratio in carbonate minerals.本文为互联网收集,请勿用作商业用途个人收集整理，勿做商业用途Key words: Dolomite，microbial factor，Mg/Ca ratio, thermophile bacteria目 录前言1第一章 研究目的与背景31。1。白云岩问题的化学动力学壁障31。2。白云岩微生物成因前人的工作41.2.1。硫酸盐还原菌（SRB）的作用41。2。2.普通需氧细菌的作用6第二章实验方法与过程92.1实验设计92。2实验流程102。2.1菌种的选择与获取102.2。2实验仪器及试剂122.2.3生长曲线的测定132.2。4Ca2+、Mg2+、CO32溶液的配制142。2。5沉淀实验15第三章实验结果193.1。实验过程中测得的PH和吸光度数据如下193。2。沉淀成分233.2.1XRD分析结果233.2.2SEM分析结果23第四章讨论与结论334.1。嗜热淀粉芽孢杆菌对白云石沉淀的促进作用334.2。嗜热淀粉芽孢杆菌对碳酸盐矿物中Mg和Ca比例的控制作用334。3。实验的不足与改进34致 谢35前 言前寒武的古老地层中普遍出现分布广泛的大量厚层状的白云岩。如周口店地区西南黄山店、孤山口一带大面积分布的雾迷山组（Pt2w）灰色中厚层硅质条带白云岩、泥质白云岩夹褐黄色藻层泥质白云岩；黄山店、八角寨一带的铁岭组（Pt3t）中-厚层结晶白云岩（图0-1）.但目前的白云岩成因研究成果很难解释为何有如此大量的白云岩形成。图0-1 铁岭组上段叠层石目前公认的白云岩形成的机制有浓缩海水(萨勃哈）模式、混合水模式、和交代形成白云岩三种.1)萨勃哈模式:在高温条气候背景中,潮上带表层CaCO3沉积物，因急剧蒸发而脱水，紧邻的海水通过松散的沉积物的毛细作用不断向这里运移补充,并在这被压缩。文石和石膏先后晶出，Ca2+被大量消耗，剩余孔隙水的Mg/Ca比增高，结果就使表层沉积物被白云石化。2此种白云岩形成模式的环境下,孔隙水平均温度常在30以上，盐度是正常海水的58倍，Mg/Ca常大于10，PH则在9以上。2)混合水模式：Badiozamani用实验方法证明530左右海水的海淡混合水对白云石过饱和，而对方解石不饱和，所以当这种海水作用于方解石时就会引起白云石化.2此种白云岩形成模式的环境下温度和PH会和正常海水相近，盐度比正常海水低。3）回流渗透白云岩化模式：潮上带形成的高镁粒间盐水，再其对表层沉积物白云化的同时，由于其密度较大，在重力作用下下渗回流。在下渗回流的过程中穿过下覆的灰岩时,必然会发生白云岩化.184)埋藏白云岩化模式：有些古代白云岩是在深埋条件下形成的，即后生白云岩。深埋白云石化对交代水溶液Mg/Ca的要求会随着温度的升高而降低,如在90时只需Mg/Ca=1/4；如在190时只需Mg/Ca=1/10。深部的地下水、压实水等带来的Mg2+进入到深埋的灰岩中，交代形成白云岩。2除上述4中模式以外,还提出了其他一些机理,例如调整白云化，玄武岩淋滤白云化，热液白云化等。但这些模式明显都是范围和规模比较小的，似乎都很难解释为什么中、新元古代形成如此大规模和大面积的白云岩。广大学者尝试寻找一种能解释大范围白云岩形成或者白云岩化的机理模式。第一章 研究目的与背景1.1. 白云岩问题的化学动力学壁障白云岩的起源在沉积地质学中仍然是一个长期存在的难题,主要是因为在前寒武的古老地层中普遍出现大量的白云岩，但在现代条件中却很少出现。现代实验室中白云石无机物的沉淀需要高温或高压,pH值等的特殊条件。显然这些条件在现代沉积环境中并不存在。自从白云岩这个概念提出以来，人们对其成因进行了超过一个半世纪的探索。通过对现代白云岩和地质历史中白云岩的研究，得出了多种白云岩成因模式，如萨勃哈模式、卤水回流模式、毛细管浓缩模式、混合水模式、热液白云岩模式等。虽然这些模式能解决局部地区白云岩的成因，但是它们都存在这很大的环境局限性，无法用来解释前寒武地层中形成的大规模白云岩。就目前的研究成果来看，白云岩形成的化学反应主要有2种:Ca2+(溶液)+Mg2+(溶液）+2CO2-3 （溶液）CaMg（CO3)2（固态)；（1）2CaCO3(固态)+Mg2+(溶液）CaMg(CO3）2(固态)+Ca2+(溶液），(2）这两个方程式代表白云岩形成的两种方式。前一方程式表示白云石直接从水溶液中沉淀，可形成原生白云岩；后一方程式表示的是方解石或文石被白云石交代的过程,即白云岩化作用,形成的是成岩白云岩.式（1)为原生沉淀白云石的化学反应式，平衡系数K=aCaMg（CO3)2/(aCa2+aMg2+（aCO32)2)。其中ax是离子活度,固体和纯液体为1。现代海水中Ca2+、Mg2+和CO32-的离子活度积为10-15.01，而Moore等根据孔隙水中离子活度计算的K值大约为10-16.11016.4,比海水中实际K值小一个数量级，所以理论上现代海水对白云石是过饱和的.而式(2）为交代成因白云石的化学反应式，平衡系数KaCa2+/aMg2+=0。67。现代海水的Mg/Ca摩尔比为5。2，远大于0.67，说明现代海水中白云石是能够形成的7.然而无论是原生白云石还是交代白云石,在现代海水中却很少沉淀，说明应该是反应速率的问题，即主要受化学动力学的控制。众所周知,影响反应速率的因素主要是反应物的浓度、温度和催化剂的存在。现代海水环境下，影响白云石沉淀的浓度因素包括以下个方面:(1）镁离子。海水中部分Mg2+、Ca2+是以水化合物或络合物的形式存在。水分子作为极性分子，又有氢键的存在，对溶液中的离子有较强的静电引力.而Mg和Ca同属第二主族，Mg为第三周期，Ca为第四周期，Mg2+半径比Ca2+半径要小.所以Mg2+与水之间的静电引力比Ca2+与水之间和Mg2+与CO32- 之间的静电引力都要大。因此，在常温常压环境中Mg2+不易进入到白云石晶格中,Mg2+的水合作用阻止了过饱和溶液中白云石的沉淀；（2）碳酸根离子.现代海水中CO32-的浓度不高.现代海水中HCO3 与CO32的浓度加起来才2.27103mol/L,沉淀白云石所能利用的CO32-十分少，所以白云石难以沉淀。（3）硫酸根离子。溶液中Mg2+常与SO42-结合形成中性强离子对MgSO40,使得溶液中可利用的Mg2+浓度再次降低；同时MgSO40吸附到正在生长的晶体表面，进一步阻碍白云石的生长。因此前人研究认为,溶液中的SO42是限制低温白云石形成的主要动力学因素,即使SO42浓度非常低，也会抑制白云石的形成.正如大多数人工合成白云石实验所证明的那样，在地表温压条件下,若没有催化剂的存在,白云石只能在高温下形成.7文档为个人收集整理，来源于网络个人收集整理，勿做商业用途1.2. 白云岩微生物成因前人的工作近20年的研究发现，微生物的氧化还原反应,即呼吸作用，以及微生物的其他一些生物化学反应，在早期成岩阶段的白云石沉淀过程中能够起到“催化剂” 的作用：它增加了孔隙水中的反应物浓度，增加了细菌周围的微环境的PH值，使得细菌周围的微环境更适合于白云石的沉淀，或许释放出的胞外分泌物也能够对白云石的沉淀造成影响，同时，菌体也作为沉淀的核心为白云石的沉淀提供了场所.从而增大了白云石沉淀的反应速率，有利于白云石的沉淀.在寒武纪生物物种大爆发之前，地球上的生物几乎全部为微生物，海洋很可能是藻类和菌类的世界。因此如果白云岩的微生物成因模式成立,则可以很完美地解释前寒武纪的白云岩的原生成因。1.2.1. 硫酸盐还原菌(SRB)的作用如上文所述，溶液中Mg2+与SO42 结合形成MgSO40，所以SO42-的存在会抑制白云石的沉淀.因此,降低溶液中的SO42浓度显然有利于白云石的沉淀。如深海缺氧、富含有机质的沉积物中，普遍发生的硫酸盐还原反应就可以降低孔隙水中的SO42-浓度：2CH2O（碳水化合物）SO42H2S2HCO3-这个过程需要硫酸盐还原菌（SRB）的参与。Vasconcelos等也发现在硫酸盐还原细菌(SRB)参与的实验条件下可沉淀出铁白云石。于是，他们提出这些厌氧微生物的调节作用可能在铁白云石在自然环境沉淀过程中起关键作用.Crisgono Vasconcelos, Rolf Warthmann等人在巴西Lagoa Vermelha海岸的一个泻湖中直接发现了现代与微生物有关的含白云石的沉积，并统计出含白云石的沉积物中白天和夜间氧气和硫化物含量在垂向上的变化，并对硫氧化细菌和硫还原细菌与白云石形成有关的新陈代谢进行了详细的阐述4。他们认为这里的白云石沉积可能是在硫氧化细菌和硫还原细菌作用下形成的。之后Warthmann等进行了模拟巴西的Lagoa Vermelha泻湖缺氧沉积环境下白云石的沉淀实验，发现硫酸盐还原细菌确实可以获得白云石沉淀。他们将硫酸盐还原细菌置于30C的人工配置的溶液中让其繁殖30天，溶液中产生了白云石沉淀.沉淀物晶体形态与巴西Lagoa Vermelha沉积物中的白云石非常相似。实验结果表明硫酸盐还原细菌在低温缺氧条件下可促使白云石沉淀。4他们认为之所以微生物能够促进白云石的沉淀，主要是因为硫酸盐还原细菌（SRB)的活动降低了环境中的SO42-离子浓度，从而从MgSO40络合物中释放出更多自由的的Mg2+离子，促进白云石的沉淀。图1-1 Crisgono Vasconcelos等人在巴西Lagoa Vermelha的沉积物（microbial mats）中发现的高镁方解石扫描电镜照片，比例尺5mm4图1-2 Crisgono Vasconcelos等人在巴西Lagoa Vermelha测得的沉积物(microbial mats)白天和夜间氧气和硫化物含量在垂向上的变化41.2.2. 普通需氧细菌的作用2009年Mnica Snchez-Romn, Judith A. McKenzie等人在地球与行星科学快报发表一篇题为Presence of sulfate does not inhibit low-temperature dolomite precipitation的文章，在这篇文章中他们提出了一种与前人工作结果大不相同的白云岩微生物成因的可能性3.他们认为，在类似于现代自然海水的环境下，微生物的作用可能使得微环境发生改变，使白云石从海水中析出.他们用两种十分普通的嗜盐菌及杆菌，在25与35利用琼脂培养基,初始pH为7.27。4，Mg/Ca为7。5的条件下成功的得到了球状的白云石结晶.表1-1 Mnica等人的实验结果3图13. Mnica等人实验中获取的球状白云石结晶3图14 Mnica等人实验中获取的矿物结晶3,D-小的球状矿物-白云石， HM-较大的球状矿物菱镁矿,S鸟粪石我们在Mnica等人的实验基础上进行一些改进，探索其他种类的细菌能否促进白云石的沉淀，同时调整实验环境使之更加接近前寒武的环境。第二章 实验方法与过程2.1 实验设计Mnica等人的实验中采用的是固体培养基，只能对白云石的沉淀进行定性的分析，同时很多参数没有办法控制。我们采用液体培养基，对实验环境和参数进行比较精确的控制，试图对之进行半定量的分析。实验中所涉及的变量有温度和Ca2+/Mg2+离子比例两项。1)温度设定：寒武纪以前地质和构造运动频发,海水温度较更新世海水温度高出许多，查阅资料可知,对中国南方灯影峡期地层的13C和18O同位素分析,此期海洋海水温度为406010。因此我们需要利用嗜热菌，但一般现代的嗜热菌的生长极限温度都不会太高，一般都在55左右，为减少获得菌种的难度，我们把上限设定为50。综上，我们设置3个温度梯度:40、45、50。2)Ca2+、Mg2+离子浓度设定:Mnica等人的实验中在Mg/Ca为7。5实验环境下成功的生成了白云石沉淀，不妨把Mg/Ca值的上限略调高点，设为8。而现代海水的Mg/Ca值为5。5左右，不妨把下限调低点，设为3，综上，我们设置4个Ca2+/Mg2+梯度。现代海水的Ca2+浓度为11mMol/L，设定离子浓度时不改变Ca2+浓度，于是获得各实验组Ca2+、Mg2+离子浓度：表21 实验中Ca2+、Mg2+离子浓度Mg/CacCa2+(mMol/L)cMg2+(mMol/L)3 11335 11557 11778 1188另外，为了区别细菌细胞体和细菌分泌物对白云石沉淀的影响,我们把实验分作A、B两组.A组沉淀过程中有细菌菌体,B组沉淀过程中有细菌菌体.2.2 实验流程2.2.1 菌种的选择与获取我们首先在高校微生物资源数据库平台上搜寻所需的菌种，目标以嗜热的异养需氧型细菌为主。我们发现Bacillus thermoamylovoians这株菌可以满足我们的需求。属名：Bacillus，种名：thermoamylovoians，中文名：嗜热淀粉芽孢杆菌，平台编号1512C0002010002334。这株菌是由南开大学马挺等人从大庆油田的油田污水中分离出来的,适宜培养温度为3855，需氧异养菌,革兰氏阳性,总盐度为7时可完全抑制其生长，培养基为LB培养基。高校微生物资源数据库平台上显示这株菌保藏在南开大学微生物资源保藏中心，在几经周折之下我们打听到这株菌种保存在李国强老师那里。联系到了南开大学的李国强老师之后，李老师十分热情的向我们提供了这株菌种。表2-2 嗜热淀粉芽孢杆菌的基本信息（高校微生物资源数据库平台）：2.2.2 实验仪器及试剂一、 实验所需器具50ml离心管40个,15ml离心管50个，5ml离心管3个，10ml小烧杯30个，250ml烧杯，1L烧杯，250ml锥形瓶3个，500ml锥形瓶9个,1L锥形瓶1个，100ml容量瓶,试剂瓶，量筒,玻棒，称量纸，100L、200L、1000L、5mL移液枪及配套枪头若干，0。22m孔径滤膜若干，一次性注射器若干等。二、 实验所用主要仪器电子天平（百分之一精度），精密电子天平（万分之一精度），pH计，紫外可见分光光度计，高压灭菌锅,电热恒温振荡培养箱，偏光显微镜,生物显微镜，Bruker D8-Focus X射线衍射仪，电子显微镜等。三、 实验所需试剂胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast extract）、氯化钠（NaCl）、蒸馏水（H2O)、五水氯化镁（MgCl25H2O）、碳酸钠（Na2CO3)、碳酸钙（CaCO3）、浓盐酸（HCl）、0。1mol/L稀盐酸（HCl）、0。1mol/L稀氢氧化钠（NaOH)等。2.2.3 生长曲线的测定微生物的生长曲线是表示微生物体生长时细胞数量增加与生长时间关系的曲线。以裂殖方式增殖的细菌，当接种到液体培养基中后,在适宜的生长条件下，以细菌细胞数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标所绘成的生长曲线，可分为四个主要部分，反映了细菌生长的四个主要阶段：延迟期、对数生长期、静止期和衰亡期。测取嗜热淀粉芽孢杆菌的生长曲线是为了方便确定实验中培养时间。因为微生物的生长是一个不断变化的过程,测得的生长曲线可以作为实验中某一时刻菌液物化条件（如PH、CO32离子浓度等）以及其中菌体密度的参考。由于我们是新拿到这个菌种，没有与之相关的生长曲线的信息,我们不得不自己做实验测定生长曲线.由于细菌悬液的浓度与吸光度（OD值)成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的吸光度来推知菌液的浓度即细菌密度.在实验中每隔2小时取样，用TU1800/S型紫外可见分光光度计测量菌液在600nm波长下的吸光度,用PHS-3C型Denver PH计测量菌液的PH值。最后将所测的吸光度值和PH值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。实验过程：1)一次活化：取5ml离心管3只，装入已灭菌的LB培养基4ml，将初步活化的菌液以1：100接种于其中两支，作为平行，即4ml培养基接种40ml菌液，剩余一只作为空白对照，隔夜培养。2）二次活化：取250ml锥形瓶3只，装入配好的LB培养基100ml，封口灭菌，将一次活化的菌液以1:1000的比例接种于其中两个，作为平行，即100m培养基接种100ul菌液，剩余一只作为空白对照,隔夜培养。3)生长曲线及pH值的测定：取500ml锥形瓶3只，装入配好的LB培养基300ml，封口灭菌，将儿次活化的菌液以1:1000的比例接种于其中两个，作为平行。接种后立即用5ml移液枪从两个平行和一个空白对照中各取10ml于小烧杯中.用紫外分光光度计测定其吸光度，吸收波长600nm，测取两次取平均。剩余用PH计测得PH。第一次取样结束后将3只锥形瓶放入恒温振荡培养箱中，设置温度为50，转速为250rpm.然后在之后的12小时内每隔两小时取样并测取吸光度和PH，共取样7次。若已达到稳定期，则每隔12小时取样，否则继续每隔两小时取样，视细菌的生长情况而定.图2-1 实验测定的嗜热淀粉芽孢杆菌生长曲线（50）实验结果显示:在前2个小时细菌属于延迟期，此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物，因此菌液PH变化不大，在原培养基的PH7.0左右。之后的2小时至4小时这两个小时内，细菌处于对数期，开始分裂生殖，因此细菌数目以稳定的几何级数极快增长；而因为细菌数目增加，呼吸作用加强放出大量的CO2,这些CO2溶于水中会使得菌液的PH略微降低。4小时之后细菌繁殖的速度减慢,开始进入稳定期。稳定期的细菌总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大。由于培养基中营养物质消耗、毒性产物积累等不利因素的影响，细菌繁殖速度渐趋下降,相对细菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。细菌的代谢产物尤其是产生的NH3等物质的逐渐累积导致菌液PH逐渐上升。2.2.4 Ca2+、Mg2+、CO32溶液的配制实验过程中的Ca2+、Mg2+、CO32-以CaCl2、MgCl2和Na2CO3溶液的形式加入。CaCl2溶液浓度为1Mol/L，MgCl2溶液浓度为2Mol/L，Na2CO3溶液浓度为1Mol/L。三种溶液均配制100ml。因为无水CaCl2在空气中的吸水性很强，所以配制CaCl2溶液时选择用CaCO3和浓HCl溶液反应。表2-3所需称取溶质的质量溶质摩尔质量（g/mol）物质的量（mol）质量（g）CaCO3100。090。110。009MgCl25H2O203.310。240。662Na2CO3105.990.110.599CaCl2溶液的配制：先用电子天平称取纯CaCO3 10.009g放在烧杯中，缓慢滴加1:1稀释的浓盐酸，直至溶液变澄清。用1mol/L NaOH溶液调节PH至7。0。将烧杯中的溶液转移到100ml容量瓶中，之后用少量纯水润洗3次,也转移到容量瓶中，保证溶质全部转移到容量瓶中。转移时用玻棒引流,沿着玻棒缓慢加入，玻棒下端在容量瓶刻度线以下。然后向容量瓶中加入纯水，直到液面与刻度线相切。液面与刻度线即将相切时用滴管小心滴加.盖紧瓶塞,用手指抵住瓶塞反复倒转多次使瓶内的液体混合均匀。MgCl2溶液的配制：用电子天平称取纯MgCl22H2O 26。248g置于烧杯中，加少量纯水（约40ml）使之完全溶解。将烧杯中的溶液转移到100ml容量瓶中，之后用少量纯水润洗3次，也转移到容量瓶中.之后操作与CaCl2溶液的配制相同。Na2CO3溶液的配制与MgCl2溶液的配制方法相同，不再赘述。2.2.5 沉淀实验实验分为40、45、50三个温度，每个温度的实验方法是相同的,仅培养箱温度设置不同，因此在此只阐述50下的实验过程，其他温度下的实验过程与此相同，不再赘述。1）液体LB培养基的配制LB培养基的配方如下：表24 LB培养基的配方成分含量胰蛋白胨(Tryptone）10g/L酵母提取物（Yeast extract)5g/L氯化钠（NaCl）10g/L蒸馏水（H2O）1L配制LB液体培养基2L:取2000ml烧杯一只，用电子天平称取胰蛋白胨20g,酵母提取物10g、氯化钠20g，置于烧杯中。加入2L纯水搅拌均匀,用0.1mol/L HCl溶液调节PH到7。0。取100ml装于250ml锥形瓶做活化用，剩余分装于3只500ml锥形瓶中，每个400ml，剩余培养基用装于1L锥形瓶中。所有锥形瓶封口后用高压蒸汽灭菌锅灭菌备用。2） 菌株活化：在无菌操作台中接种0.5ml菌液于100ml培养基中（接种比例1:200)。置于恒温振荡培养箱中。设定温度50、转数250rpm，培养24小时。3） 接种：在无菌操作台中分别在两瓶400ml培养基中接种活化好的菌液400ml（接种比例1：1000）作为平行实验组,标记为S1、S2，剩余一瓶不接种标记为Blank，做空白对照.置于恒温振荡培养箱中。设定温度50、转数250rpm。4） 分装：培养48小时后将菌液取出。取事先灭好菌的50ml离心管20只，从S1和S2的菌液中分别取8个40ml菌液分装于16只50ml离心管中备用.从S1、S2和空白对照组（Blank）中分别取5个10ml菌液分装于小烧杯中,每组5个中一个用作测菌液（空白对照）的PH和吸光度，另外四个按照实验设计浓度添加Ca2+、Mg2+离子用以测得添加Ca2+、Mg2+离子后菌液的PH。从空白对照组中取出170ml置于已灭菌的烧杯中，加入事先配好的1mol/L Na2CO3溶液8.9474ml使溶液cCO32-=50mm/L。然后从中取4个40ml分装于4只50ml离心管中备用.B组所有的菌液用冷冻离心机以20、6000rpm离心之后取35ml上清液,用孔径0.22mm的滤膜过滤，以除去上清液中残余的菌体。所有分装好的离心管按如下方式标记：以短横线分割，短横线前标示S1与S2两个平行,短横线后接Ca2+、Mg2+离子比例数值，最后标示A、B区分A、B两组表2-5 实验组标记方式Mg/Ca35781号平行带菌体S13AS15AS1-7AS1-8A不带菌体S1-3BS15BS1-7BS18B2号平行带菌体S2-3AS25AS27AS2-8A不带菌体S23BS2-5BS2-7BS2-8B空白对照组中取出的菌液按照Ca2+、Mg2+离子比例标记为:B3、B-5、B7、B85） Ca2+、Mg2+离子加入:若要使溶液中Ca2+、Mg2+离子浓度满足实验设计要求，各组各比例所需加入的1mol/L CaCl2溶液和2mol/L MgCl2溶液体积的计算如下（以40ml，Ca2+/Mg2+=3为例)：设加入的1mol/L CaCl2溶液体积为X，2mol/L MgCl2溶液体积为Y，有如下物质的量守恒关系：c0CaCl2X=(v1+X)c1CaCl2c0MgCl2Y=（v1+Y）c1MgCl2带入数值：1mol/LX=（4010-3L+X)11103mol/L1mol/LY=（4010-3L+Y)3310-3mol/L解方程组得：X=0.4524ml，Y=0.6787ml。经计算，各组以及小烧杯各比例所需加入的1mol/L CaCl2溶液和2mol/L MgCl2溶液体积如下表：表26 所需加入CaCl2和 MgCl2溶液体积c1CaCl2(mMol/L）c1MgCl2（mMol/L）Ca2+/Mg2+加入1mol/L CaCl2溶液体积（ml）加入2mol/L MgCl2溶液体积（ml）小烧杯中10ml菌液113330。11310。1697115550。11440。2860117770。11570。4051118880。11640。4656B组35ml上清液113330.39590。5938115550.40041.0010117770。40501。4177118880。40741。6296A组、空白组40ml菌液113330.45240。6787115550。45761.1440117770。46291。6202118880。46561.8624在无菌操作台中如上表将Ca2+Mg2+离子加入完毕之后，测取各小烧杯中菌液的PH值并记录。6） 沉淀及其处理：将分装完毕的20个50ml离心管放入50,250rpm的恒温振荡培养箱培养48小时，使之充分沉淀。取出离心管,用冷冻离心机以20、6000rpm离心之后取35ml上清液，用孔径0。22mm的滤膜过滤.保留15ml上清液于15ml离心管，留样待测。离心管中的沉淀物冷冻干燥后，离心管连同沉淀一起称取质量，然后将沉淀物刮净用铝箔纸包起来。离心管洗净烘干后再称重。两次质量之差就是沉淀物产量。沉淀物送X射线衍射（Xray diffraction,XRD）分析。第三章 实验结果3.1. 实验过程中测得的PH和吸光度数据如下表31 接种后48小时菌液生长情况组别404550PH析光度PH析光度PH析光度Blank7。030。0616。970.06506.940。062S18.372。22008。241.67508.491。444S28.452。28408。241。81308.441.426 随着MgCl2和CaCl2溶液加入量的逐渐增加，PH呈现逐渐降低的趋势。这是因为MgCl2和CaCl2都是强酸弱碱盐，溶于水后发生水解：MgCl2+2H2O Mg(OH)2+2H+2CL-CaCl2+2H2O Ca（OH)2+2H+2CL-使溶液呈弱酸性。MgCl2和CaCl2溶液加入量越多,酸性越强.表32 分装后分别加入不同量的MgCl2、CaCl2后菌液PH情况温度Mg/Ca404550blankS-1S-2blankS-1S2blankS1S-236.908.158.186。848。278.326.828.228.1856.878.118。146。788。238.266.778.218.1476。858。098.116。758.188.216。758。088。0986。848.088。026。768。168.176.708。128.10表33 沉淀结束后，菌液PH情况 温度Mg/Ca404550blankS1S2blankS1S2blankS1S2带菌体不带菌体带菌体不带菌体带菌体不带菌体带菌体不带菌体带菌体不带菌体带菌体不带菌体37.797.857。888。029.288。288.198.258.219.128。168.368.598。3257。737。887.867.899.168.138.178。189.028.158.148.408.0879。257.747.907。857。889.098。408。168.138.048.988.118.008.058。0389.257.807。927.827.839.058。288。128。118。118。908.078.148.018.34随着MgCl2和CaCl2溶液加入量的逐渐增加,PH呈现逐渐降低的趋势。这是因为MgCl2和CaCl2都是强酸弱碱盐，溶于水后发生水解：MgCl2+2H2O Mg（OH）2+2H+2CLCaCl2+2H2O Ca(OH）2+2H+2CL-使溶液呈弱酸性。MgCl2和CaCl2溶液加入量越多，酸性越强。实验中所获得沉淀物质量数据如下表所示:表3-4 实验组沉淀物质量温度组别细胞干重沉淀物A，有细胞组沉淀物B，无细胞组清洗前m1/g清洗后m2/gm/g清洗前m1/g清洗后m2/gm/g清洗前m1/g清洗后m2/gm/g40S1313。405513.32460.08113.3762