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定量PCR中_ct值的含义

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实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。
一.    实时荧光定量PCR原理
    所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1.        Ct 值的定义
    在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。

图1. Ct值的确定
2。        荧光域值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3—15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SDcycle 6-15
3.        Ct值与起始模板的关系
    研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

图2。 荧光定量标准曲线
4.        荧光化学
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。现将其原理简述如下：
1） TaqMan荧光探针:
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时,Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图3所示.

图3. TaqMan 荧光探针工作原理

2）SYBR荧光染料：
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步.
二．内标在传统定量中的意义
1．几种传统定量PCR方法简介〔3〕:
1）内参照法：
在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物,内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中,由于内标与靶模板的长度不同,二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板〔4〕.
2)竞争法：
选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物,竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数〔5〕。
3)PCR－ELISA法：
利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验,若加入内标，作出标准曲线,也可实现定量检测目的〔6〕。
2．内标在传统定量中的作用
    由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时,检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（见图4），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性.但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

图4. 相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图
终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性

三．内标对荧光定量PCR的影响

1．实时荧光定量PCR无需内标
  实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果.因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
1）Ct值的重现性
PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期(对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。（见图4）
2）Ct值与起始模板的线性关系
由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
2．内标对实时荧光定量PCR的影响
    若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时,这种竞争会表现得更为显著〔7，8〕。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
    美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的,而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方〔9〕。
    Applied Biosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测,但定量检测仍然采用外标准曲线的方法,而不用内标进行定量。
  综上所述,利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究,药物疗效考核、病原体检测等诸多领域〔1011，12,13〕。
参考文献
1.        Higuchi R， Fockler C, etal。 Kinetic PCR analysis： real-time monitoring of DNA amplification reactions。 Biotechnology， 1993， 11（9）： 1026—1030。
2.       DNA/RNA Real—Time Quantitative PCR-Rev。 B  Applied Biosystems
3.       定量聚合酶链反应的研究进展与临床应用. 中华检验医学杂志2000， 23（2): 120-121。
4。       Anderson KM， Cheung PH, Kell MD。 Rapid generation of homologous internal standards and evaluation of data for quantitaion of messenger RNA by competitive polymerase chain reaction. J Pharmacol Toxicol Methods， 1997， 38： 133—140。
5。       Wuhu A， Waiztu M, Koch A。 A rapid and sensitive protocol for competitive reverse transcriprase （CRT) PCR analysis of cellular genes。 Brain Pathol， 1998, 8： 13—18
6.       仝文斌，高巍，费然等。 核酸扩增产物的量化酶免疫通用型检测方法. 中华医学检验杂志,1999， 22: 83-86。
7.       Actor JK, Limor JR, Hunter RL。 A flexible bioluminescent-quantitive polymerase reaction assay for analysis of competitive PCR amplicons. J Clin Lab Anal, 1999, 13(1）: 40-47.

8.       Schnell S, Mendoza C. Enzymological considerations for a theoretical description of the quantitative competitive polymerase chain reaction(QC-PCR)。 J Theor Biol， 1997, 184(4): 433—440.
9。         Ke LD， Chen Z, Yung WK。 A reliability test of standard—based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards。 Mol. Cell Probes, 2000, 14(2): 127-135。
10。     Becker K。, D。 Pan and C。B.Whitely. Real—time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer. Hum。 Gene Ther， 1999， 10: 2559—2566。
11。     Higgis， J。A., etal。 5' nuclease PCR assay to detect Yersinia pesits。 J Clin Microbiol, 1998, 36: 2284—2288.
12.     Bieche I., P。Oondy, etal。 Real—time reverse transcription-PCR assay for future nagement of ERBB2—based clinical apolications。 Clin.Chem, 1999， 45： 1148-1156.
13。     Wang X. X。 Li， etal. Application of real-time polymerase chain reaction to quantitate induced expression of interleukin-1 beta mRNA in ischemic brain tolerance. 2000，Neurosci.Res, 59(2）： 238-46.

荧光定量PCR中基线、阈值、Ct值、扩增曲线、熔解曲线等基本概念
基线（Baseline）:是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大.接近一条直线,这样的直线即是基线。

荧光域值（threshold）的设定:一般将 PCR反应前 15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR第3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。
CT值：表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多,CT值越小。反之亦然.利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值.因此,只要获得未知样品的CT值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
扩增曲线
PCR过程中,以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线

判断扩增曲线是否良好的指标主要有几个方面：
1、曲线拐点清楚,特别是低浓度样本指数期明显,扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。
2、曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高。
3、标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势.
4、各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近。

熔解曲线
对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链,荧光急剧下降。利用该特点以及不同PCR产物其Tm值的不同，因此使其荧光信号发生迅速下降的温度也不同，可通过此对PCR的特异性进行鉴定。