第三章-细胞破碎技术.doc

(完整word)第三章 细胞破碎技术第二章 细胞破碎和分离提取技术21细胞破碎技术许多生物产物特别是蛋白质、基因重组产品、胞内产品如：青霉素酰化酶，碱性磷酸酶等胞内酶，干扰素、胰岛素、生长激素等基因工程产物以及部分植物细胞产物等都是胞内物质,这类生物产物需要分离纯化的第一步是收集细胞及细胞破碎，使目标产物释放出来,然后进行分离纯化。如图所示：图 胞内产品的分离纯化过程211细胞破碎方法及机理 破碎细胞的目的是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏(增大渗透性）或破碎、释放其中的目标产物，主要采用的方法有机械法和非机械法两大类，图1列出了一些主要方法：破碎方法 机械法 非机械法 固体剪切作用 液体剪切作用 干燥处理 溶胞作用珠磨法 压榨法 高压匀浆 超声破碎 酶溶法 化学法 物理法撞击法图1 细胞破碎方法分类机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切力，化学破碎则利用化学或生化试剂或酶改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速率，或完全溶解细胞壁，形成原生质体后,在渗透压作用下,使细胞膜破裂而释放胞内物质，各作用力细胞破碎机理如图22。1.2机械方法破碎机械破碎处理量大，破碎速度较快，时间短，效率较高,是工业规模细胞破碎的重要手段，细胞受到挤压，剪切和撞击作用,易被破碎在许多情况下，细胞内含物全部释放出来，由于机械搅拌产生热量，破碎要采用冷却措施，机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法和超声波等方法。2.1。2.1 珠磨法（Bead milling） 珠磨法是一种有效的常用的机械破碎方法，珠磨机是珠磨法所采用的设备，其结构示意图3,细胞悬浮液与玻璃珠(或石英砂，或氧化铝）一起高速搅拌，研磨使细胞达到某种程度破碎，在珠磨机中，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起的。珠磨法破碎细胞可采用间歇式连续操作,研究表明，两种情况下，细胞破碎动力学可近似表示为： 其中， t在间歇操作时,为破碎操作时间，连续操作时为细胞悬浮液在破碎室内的平均停留时间，即，其中V 为悬浮液体积m3，Q为悬浮液流量m3/S,S为破碎率,k为破碎速率常数,与许多因素有关。珠磨法破碎受许多操作参数的影响，总结在表1中：表1 高速珠磨法过程变量搅拌转速悬浮液喂料速率微球大小微球填充密度细胞浓度微球密度温度搅拌桨设计破碎室的几何形状同一进料速度，细胞浓度越高,则破碎率越高，所需能耗越低；同时我们也能发现，破碎率越高所需能耗越大（同一悬浮液中)即破碎的能耗与破碎率成正比，提高破碎率，需要增加装珠量，或延长破碎时间，或提高转速，这些措施不仅导致电能消耗增加,且产生较多热量,引起浆液温度升高增加制冷量，因而总能量消耗增加。 珠磨法操作简便稳定,破碎率可控制，易放大，在实验室和工业规模上已得到应用，适用于绝大多数微生物细胞破碎，特别是对于有大量菌丝体的微生物和一些有亚细胞器（质地坚硬）的微生物细胞.2.1.2.2高压匀浆法（highpressure homogenization）高压匀浆法是大规模破碎细胞的常用方法，高压匀浆器是该法所采用的设备,它由高压泵和匀浆阀组成,结构简图见图5，它是利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然简压和高速冲击撞击造成细胞破裂，在高压匀浆器中，细胞经历了高速造成的剪切、碰撞和由高压到常压的突变，从而造成细胞壁的破坏,细胞膜随之破裂，胞内产物得到释放，高速匀浆破碎的动力学方程为：其中S为破碎率，且；k为破碎速度常数，p为动力，且上述参数s,k,a,b，p等随微生物种类和培养条件的不同而有所差异.影响高压匀浆破碎的因素主要有压力、温度和通过匀浆器阀的次数,图6是操作压力和循环次数对破碎的影响.由图可知，操作压力对细胞破碎的影响要比匀浆次数的影响大得多。从提高破碎效率的角度应选择尽可能高的压力；而从降低能耗及延长设备寿命的角度应避免很高的压力，因此，工业生产中常采用的压力为5570Mpa.高压匀浆法操作参数少，且易于确定；且样品损失量少，在间歇处理少量样品方面效果好,在实验室和工业生产中都已得到应用，适用于酵母和大多数细胞的破碎。对于易造成堵塞的团状或丝状真菌以及一些易损伤匀浆阀，质地坚硬的亚细胞器一般不适用。2.1。2.3超声波破碎法（Ultrasanication）超声波法是一种很强列的破碎方法,细胞破碎是利用声频高于1520KHz的超声波在高强度声能输入下进行的,普遍认为其破碎机理是与空化现象引起的冲击波和剪切力有关,即空穴作用产生的空穴泡由于又受到超声波的冲击而闭合,从而产生一个极为强烈的冲击力压力，由此而引起悬浮细胞上产生了剪切应使细胞内液体产生流动而使细胞破碎. 超声波的细胞破碎与细胞种类、浓度、处理时间以及超声波的声频有关.本法在处理少量样品时操作方便，液体损伤量少,破碎率高。但本方法的有效能量利率极低，操作过程中产生大量的热，故操作时需在冰水中进行或通入冷却剂而增加成本，不易放大，它适用于大多数微生物的破碎，不适于大规模操作，主要用于实验室规模的细胞破碎。机械破碎虽已广泛应用于工业大规模生产，但它仍有许多不足之处,如大量细胞碎片的产生，胞内所有可溶性杂质蛋白的释放，发酵液粘度增加等。这给后处理工艺带来了很大难度，而非机械破碎方法,其条件比较温和,有利于存在细胞膜附近目标产物的高活力释放回收，适用于所有微生物细胞的破碎，包括物理法、化学法和酶溶法.2.1。3细胞物理破碎方法2.1。3.1渗透压冲击法(Osmotic Shock）渗透压冲击法是各种细胞破碎方法中最为温和的一种。将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入缓冲液中,由于渗透压的突然变化，水迅速通过细胞壁和细胞膜进入细胞,引起细胞壁和膜膨胀破裂，从而使细胞通透性增大。对细胞进行渗透压冲击与超声波破碎比较Cystain C的释放量比较结果如下表：释放方法Cystain C释放量（mg/gced)Cystain C/总蛋白释放渗透压冲击法079180超声波破碎法090090高渗压溶液的快速稀释和高盐浓度溶液中细胞的快速重新悬浮，由于细胞壁的结构，对微生物细胞影响比较小,对停滞期的细胞影响更小，渗透压冲击法选择性很高,且释放速度快,工艺简单，易放大，具有很大的工业潜力。本法适用于易破碎的细胞或细胞壁预先受到酶处理的细胞，及合成受抑制而强度减弱的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌，但它同时还存在着高盐浓度对产品污染问题。2。1.3。2 冷冻融化法(Freczing an thawirg）冷冻融化法是通过水结晶的形成和随后的融化而进行细胞破碎。冷冻的目的是破坏细胞膜的疏水键结构，增加其亲水性和通透性，而且由于胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差,在渗透压作用下引起细胞膨胀而破裂.对Ecoli K12在3090温度范围内热溶性的研究显示，在90下处理20min会释放出大量蛋白,可以看到，提高蛋白释放可通过短时间高温渗透来获得，而不是低温（3070）长时间处理。这些结果的解释很难用提高温度改变蛋白质的可溶性来解释,在电子显微镜下，90下的细胞破碎有大量的细胞碎片,但本法不能定量地测定细胞破碎的程度。目前小规模工厂工艺过程用于生产生物可降解热熔物质，PHB是通过升高温度和压力相结合破碎A eutrophus获得的，相似的工艺过程是用于食品工业的酵母蛋白的提取生产被报道，操作可以是分批或连续,然而,由于提高温度大多数生物产品失活，使得细胞破碎中热量的应用是很有限的。本法对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较为有效，但由于本法成本高,只能进行小规模应用，且释放速率慢、产量低，另外酶易失活也限制了它的更进一步利用。2。1。4化学法2。1.4.1碱处理蛋白质是两相物质,利用酸碱调节pH值,可提高目标产物溶解度。PH11。512。5碱处理2030min可导致细胞溶解，Wade报道了一改进工艺，通过用最佳PH11。012。5碱处理代替机械破碎法从Erwinia中提取Lasparaginase，则L-asparaginase以可溶形式释放出来,再如，破碎Alcaligenes eutrophus回收PHB，在PH10和45条件下处理，50的可利用的可溶蛋白释放出来。 本法的优点是价格便宜，易适于任何规模的操作，但实际上大多数蛋白是不能忍受这种条件的PH1111.5的碱浓度破坏了许多生物活性，使蛋白酶失活,故本法常伴随着蛋白的变性和降解。2。1.4.2化学试剂法化学渗透取决于试剂的类型和细胞壁、细胞膜的结构与形成.下表列出了不同化学试剂对不同细胞的作用情况，即化学渗透处理方式：细胞类别变性剂清洁剂有机溶剂酶抗生素生物试剂螯合剂革兰阴性革兰阳性酵母植物细胞动物细胞1)。EDTA EDTA作为螯合剂,可用于处理革兰氏阴性菌如E-coli，对细胞的外层膜有破坏作用。二价阳离子，尤其是Mg2对革兰氏阴性军细胞被膜以外层膜的稳定作用是重要的，EDTA的螯合作用导致外层膜不稳定或去除。在EDTA处理时，大肠杆菌有3350%脂多糖，少量蛋白质和磷脂损失，外层的这些变化也影响细胞质膜.EDTA单独处理可导致Psendomenas aeruginosa广泛的溶解，这性质对Pseadmonads是特有的,对Ecoli,EDTA有助于诱导自溶，在其它革兰氏阴性菌,EDTA可提高细胞通透性。2）。有机溶剂法许多研究者发现，有机溶剂处理细胞,细胞膜表面发生变化，胞内产物可以释放出来,由于有机溶剂没有整体破碎细胞，因而有可能实现选择性释放，如采用异丙醇处理酵母，释放超氧化物歧化酶，处理后,超氧化物歧化酶释放率达90,纯化因子提高25,即在3）.表面活性剂通常使用的清洁剂象SDS、CTAB、TritonX等能够作用细胞质和细胞壁膜,膜结构中的脂蛋白成分被或多或少地溶解，使细胞渗透作用有利于某些蛋白的通过，Helenius等人认为清洁剂溶解膜的作用是蛋白质溶解和蛋白脂界面的扰乱。Ecoli实验研究显示了阴离子清洁剂SDS、Sarkosyl和非离子型清洁剂Triton X-100溶解细胞、细胞外膜、细胞壁和细胞质膜不同的敏感性，无Mg2+条件下，细胞外膜和内膜很容易被SDS和Triton X-100 溶解.Sarkosyl专门作用内膜，Mg2+存在会抑制Triton X100，仅对内膜溶解的作用阻止了Sarkosyl脱掉内膜，膜的去除与0。52.0清洁剂浓度无关,内膜和外膜的溶解随着温度从437增大而升高。 Hectwer和Wang研究了非离子型Trition X100和变性剂盐 的结合作用,盐酸 能从膜碎片中溶解蛋白Triton X100对疏水物质有很高的亲和力，因而对结合和溶解内膜和外膜碎片中的磷脂很有效，在Triton X100浓度0。5-2.0，盐酸0.1M条件下,会发生明显的协同效应，两者缺少任何一种情况下，蛋白释放量少于10，当发生协同作用时，蛋白释放量提高到505，用清洁剂渗透细胞的缺点是易使蛋白质变性,尤其表现在蛋白质复杂的四级结构上。 综上所述，可发现，化学渗透法的优点与机械法相比，可避免大量细胞碎片，核酸留在胞内，处理后，溶液很容易澄清，简化后处理步骤,且用在搅拌容器中简单的间歇操作代替了机械破碎设备。 缺点是价格昂贵，易污染产物，会导致产物活性和最优产量的不可逆损失。2。1.5生物法 酶溶法是研究较广的一种方法，是利用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的键而达到破壁的目的，即利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再破坏细胞膜，以提高胞内产物和通透性。 由于酶溶法的生物特异性，温和的操作条件、低能量、低成本且可以避免不利的物理条件,象高剪切力等优点，酶溶法是非常有用的方法。它能确保产物的破坏最小，细菌和酵母细胞壁完全不同的结构决定应用不同的酶.常用的溶酶有溶菌酶(lysoryme）、1，3葡萄糖酶、蛋白酶、糖苷酶、1，6葡聚糖酶等,细胞壁溶解酶(rymdyase）是几种酶的复合物,溶菌酶主要对细菌类有作用，其它酶对酵母作用显著。 目前，溶菌酶是商业上唯一大规模应用的细菌溶酶，溶菌酶攻击肽聚糖多肽链上的1，4糖苷键,革兰氏阳性菌对这种作用非常敏感，革兰氏阴性菌则需要先脱掉外膜或使其外膜不稳定暴露肽聚糖后受攻击，这可以通过除掉二价阳离子（它可维持外膜稳定），或通过象EDTA似的螯合剂，或非离子型清洁剂如Triton X-100作用来实现。通过透射电镜观察细胞壁形态变化，证实了溶菌酶的这一作用,在低渗性环境中，细胞破裂。 Cytophaga sp溶解酶系统既可以溶解革兰氏阳性菌，也可以溶解革兰氏阴性菌，还可以溶解酵母,溶解Ecoli需要通过清洁剂处理去除外膜，然而，革兰氏阴性菌Alcaligena eutrophus则不需要这样的预处理就有效地溶解，结果发现,存在高活性，且无重大产物抑制，最优操作条件是PH9.2和4550。 下图为正在溶解的酵母细胞壁结构示意图，酵母细胞主要有两层，即包括蛋白质甘露糖层的外层和葡聚糖的内层,实验发现，在溶酶存在条件下，从整个酵母细胞蛋白质释放速率与酶浓度有线性函数关系,酵母细胞溶解的酶系统通常是几种不同酶的混合物，包括一个或更多的1，3葡聚糖酶、蛋白酶、1，6糖葡聚糖酶、甘露糖酶和壳多糖酶,它门协同作用于细胞壁的溶解，单只有两种酶对整个细胞破碎是必要的，特定的壁溶蛋白酶可降解蛋白质甘露糖层，溶解1，3葡聚糖酶可降解内层.自溶作用是酶溶的另一种方式，通过调节温度，PH或添加有机溶剂等激活剂，诱使细胞产生溶剂自身的酶的方法，称为自溶，如酵母细胞在4550下保持1224小时即可发生自溶，通过渗透失衡或某些微生物的营养局限也能发生自溶。 目前，自溶解酶的成本和它们有限的适用性使它们排除了大规模应用的可能性，革兰氏阴性菌的酶溶更受到了细胞激活和破碎外膜的预处理一般要求的限制，然而，不稳定性产品的保存，低成本投资,小规模cytophaga溶酶产品的开始生产和固定化酶系统的潜在应用，暗示了酶溶法是一种有光明前景的技术。2。1。6胞内产物的选择性释放 细胞破碎的主要目的是为下一步的分离纯化，即不断的除去杂质。如果细胞完全破碎，自然所有胞内的蛋白质后全部释放出来，会给后面分离纯化带来困难。因此在细胞破碎时，不一定完全破碎细胞，只要目标产物释放出即可，而其他杂质蛋白应该越少越好。2.1。6.1多种破碎方法结合化学处理可提高细胞的通透性，引起部分蛋白释放而没有破碎细胞,而机械法需高能量不断产生大量碎片，阻碍了下一步分离，将化学处理如碱处理或清洁剂处理与高压匀浆法结合，结果显示，停滞期的A。eutrophus细胞破碎有显著提高，类似地，用溶解酶zymolase预处理酵母S。cererisiue引起只有5溶解；而来进行高压匀浆，结果，细胞碎片由原来未进行酶预处理的低于40，提高到70，再如图11所示，酶溶法与珠磨法的结合,结果与条件如图所示，本法节省了能量，降低了酶成本，缩短了处理时间.2。1.6.2目标产物的选择性释放2.1。621 细胞破碎和双水相萃取技术结合 乙醇脱氢酶（ADH)是一种含锌金属酶，一般的破碎方法容易失活.苏志国等采用球磨和双水相萃取技术结合，从酵母中提取ADH，在球磨中加入聚乙二醇（PEG)及硫酸铵对ADH起一定保护作用，然后加入18PEG和17硫酸铵，直接释放的ADH促进入上相.2.1.622 利用噬菌体裂解细胞 利用可控噬菌体破碎菌体有两种方法：直接用噬菌体处理细胞;将噬菌体基因表达在工程菌中，一定条件下诱导噬菌体破壁. 第一种方法Park 在1994年报道采用野生的噬菌体感染大肠杆菌,热诱导后，细胞裂解。 第二种方法一般将噬菌体基因（) 表达在可产聚羟基丁酸酯的菌种，当加入 利用噬菌体基因方法和其他细胞破碎方法相比具有许多优点：可避免机械法所需的昂贵设备带来的问题;可避免化学试剂带来的污染和回收问题；。而且操作简单可控，可以和发酵过程藕联起来。22 从发酵液直接分离产物 前面的固液分离都只是将发酵液的细胞进行分离，对产物并没有分离。而且在固液分离中还有产物的损失。对于胞内产品，在细胞破碎后，细胞碎片很小，一般在0.050.2 m，很难用传统的离心或过滤法除去，如采用微滤膜，膜容易发生堵塞。所以细胞碎片的分离时一个难题。221 双水相分离技术 双水相萃取时瑞典伦德大学P。Albersson教授实现研究德一种高效分离技术.有关双水相萃取德特点将在后面章节中详细讨论,本章只是讨论有关双水相萃取在细胞或细胞碎片分离中的应用.在双水相体系中，细胞或细胞碎片全部分配在下相中，只要目标产物分配在上相中,利用萃取分配平衡是热力学过程，容易放大的优点，可以很容易地分离出细胞或细胞碎片。 双水相萃取用于细胞碎片地分离的应用例子如表所示，双水相在分离细胞碎片的同时，还纯化了蛋白质25倍。所以双水相萃取是一种集成化技术，可同时完成细胞碎片去除和产品纯化二个任务。双水相萃取分离技术在分离细胞和细胞碎片时，和其他技术如转鼓过滤和膜分离的比较如表所示。由比较可知，双水相萃取技术具有设备简单,容易放大的优点。当然双水相萃取也有一些缺点，主要问题是当放大规模很大时，原料成本将是一个关键因素.由于成相组分浓度放大时保持不变，当规模很大时，投入的原料将正比列增加，导致双水相的操作成本很高。但在一些高价值产品的分离纯化上,双水相萃取还是有其竞争优越性的。表 双水相萃取用于细胞碎片的分离和蛋白质的纯化表 双水相萃取和其他细胞分离技术的比较 222 膨胀床分离技术扩张床是固定床和流化床优点的综合。不用除去细胞，便可以直接从发酵液中提取目标产物，同时完成细胞等颗粒悬浮物的分离。有关膨胀床的特点将在后面章节中讨论。本章只是讨论有有关膨胀床在除去细胞碎片时的应用。扩张床吸附技术有着广泛的工业应用前景，一些研究者已对此进行放大。一些主要的应用实例列于表 。所有的研究都表明,扩张床吸附技术将固液分离、吸附、浓缩集成在一起,大大简化了操作步骤，目标产物的回收率大幅度提高.但是该技术中还有一些问题需要进一步解决。表7 EBA技术应用举例7对象吸附产物介质进料缓冲液进料线速度/cm*h1酵母细胞匀浆磷酸果糖激酶Cibacron BlueSepharose FF0.05 mol/L PBS0。5 mol/L EDTA pH7。218。6酵母-IgG体系IgGProtein ASepharose FF0。1 mol/L TrisHCl pH7。560酵母细胞匀浆葡萄糖6-磷酸脱氢酶STREAMLINEDEAE0.05 mol/L PBS pH6.0150酵母细胞匀浆葡萄糖-6磷酸脱氢酶苹果酸脱氢酶Procion R H-E7B-PVAFEP ProcionYHE3GPVA-FEP0.05 mol/L Tris-HCl pH8。00.05 mol/L PBS pH7。6134大肠杆菌匀浆重组Annexin VSTREAMLINEDEAE0。03 mol/L醋酸铵溶液pH5。5300大肠杆菌发酵液重组ZZM5STREAMLINE-DEAE0。05 mol/L氯化钠溶液200尽管目前还存在一些不足，但扩张床吸附技术在简化生物产品纯化过程，特别是从含固体杂质的料液中直接纯化生物产品方面是一个杰出的贡献.223 泡载分离技术2231泡载分离技术的原理泡沫分离（Foam Separation）又称泡沫吸附分离(Foam Adsorbent Separation)技术，早在1915年就开始应用于矿物浮选，但是对离子、分子、胶体及沉淀的泡沫吸附分离是从50年代末才引起了人们的兴趣与重视,并逐渐作为一种单元操作加以研究。首先是从溶液中回收金属离子的课题开始的，前期研究了泡沫分离金属离子的可行性，然后建立了金属离子与表面活性剂离子之间相互作用的扩散双电层理论.60年代中期采用泡沫分离法,脱除洗涤剂工厂排放的一级污水及二级污水中的表面活性剂-直链烷基磺酸盐和苯磺酸盐获得成功，70年代进行了染料等有机废水泡沫分离的实验研究，1977年也有报导开始用阴离子表面活性剂泡沫分离DNA、蛋白质及液体卵磷酯等生物活性物质。到目前为止，用泡沫分离方法获得的蛋白质及酶有：溶菌酶，白蛋白，促性腺酶激素,胃蛋白酶，凝乳酶，血红蛋白，过氧化氢酶，卵磷酯，淀粉酶，纤维素酶,D氨基酸氧化酶,苹果脱氢酶等等。随着工业的发展，特别是对环境保护的普遍重视和资源的综合利用的要求，泡沫分离的研究工作将不断扩大范围，工业应用将愈来愈多。1。泡载分离技术的基本原理 泡载分离的分离过程是利用待分离物质本身具有表面活性(如表面活性剂)或能与表面活性剂通过化学的、物理的力结合在一起后(如金属离子,有机化合物、蛋白质和酶等）并在鼓泡塔中被吸附于气泡表面，得以表面富集，藉气泡上升带出溶液主体，达到净化主体液、浓缩待分离物质的目的。可见它的分离作用主要决定于组分在气液界面上吸附的选择性和程度，其本质是各种物质在溶液中表面活性的差异. （1）表面活性剂及其界面特性 泡沫分离中所需分离的溶质是表面活性剂。它们的化学结构式由非极性基团(亲油性）和极性基团(亲水性)两部分组成，溶入溶液后表现出两个基本性质:（1）在水溶液中的溶解行为是很快地聚集在水面并形成亲水基留在水中，亲油基伸向气相的定向单分子排列，使空气和水的接触面减少，从而使表面张力按比例急剧下降。同时，多余的分子则在溶液内部形成分子状态的聚集体胶束，并分布在液相主体内。此状态相当于右图曲线的斜线部分。（2）超过表面活性剂形成胶束的最低浓度后，溶液表面张力不再降低。但在相界面上，由于上述定向排列的单分子层的作用，具有选择性的定向吸附作用,相当于曲线中的水平部分.这一特性会显著地改变原溶液的界面的性质，造成各种界面作用,泡沫分离就是充分利用表面活性剂的界面作用而发展起来的一种新型的分离方法。 （2）Gibbs（吉布斯)等温吸附方程 1878年吉布斯用热力学方法推导出描述气液界面上吸附的一般关系式即等温吸附方程，表达如下式:dRTidlnai 当一种非离子型表面活性溶质以非常低的浓度溶解于纯溶剂(如水)中时,可简化成:也可以表示成：/c= 以上式中为吸附溶质的表面过剩，即单位面积上吸附溶质的摩尔数与主体溶液浓度之差,对于稀溶液即为溶质的表面浓度，molm2，可通过(溶液的表面张力，Nm）与浓度c(溶质在主体溶液中的平衡浓度，molL)来求得.式中的/c为吸附分配因子；R为气体常数，J（mol/K)；T为绝对温度，K。如果溶液中含离子型表面活性剂，则应对上式进行如下修正：其中，n为与离子型表面活性剂的类型有关的常数。液溶中表面活性剂浓度c和表面过剩的相互关系可用上图表示.在b点之前，随着溶液中表面活性剂浓度c增加，成直线增加，Kcb点后溶液饱和，多余的表面活性剂分子开始在溶液内部形成“胶束”，b点的浓度称为临界胶束浓度(CMC），此值一般为0.0010。02molL左右，分离最好在低于CMC下进行。对于非离子型表面活性剂，上图曲线更接近于Langmuir等温方程： K和K均为常数.在饱和时，Kcl，KK。所以在溶液中表面活性剂的量超过临胶束浓度后,表面过剩值恒定不变，许多表面活性剂的值在310-10molcm2左右。 (3）泡沫的形成与性质 泡沫是由被极薄的液膜所隔开的许多气泡所组成的,那么气泡是如何形成的呢？它是当体在含活性剂的水溶液中发泡时，气体首先在液体内部形成被包裹的气泡。在此瞬时，溶液中表面活性剂分子立即在气泡表面排成亲油基指向气泡内部,亲水基指向溶液的单分子膜，该气泡会借浮力上升冲击溶液表面的单分子膜.在某种情况下，气泡也可从表面跳出。此时，在该气泡表面的水膜外层上，形成与上述单分子膜的分子排列完全相反的单分子膜。从而构成了较为稳定的双分子层气泡体,在气相空间形成接近于球体的单个气泡。许多气泡聚集成大小不同的球状气泡集合体，更多的集合体集聚在一起形成泡沫。 形成泡沫的气泡集合体包括两个部分：一是泡，两个或两个以上的气泡,二是泡与泡之间以少量液体构成的隔膜(液膜）是泡沫的骨架。典型的三个气泡集合体泡与泡之间间壁为平面,三个泡的共同交界处则形成具有一定曲率半径的小三角柱，如果是四个气泡聚集在一起可能生成十字形结构,但它是不稳定的，在相邻气泡间微小压力差下，膜会滑动,直至转变成上述的三泡稳定结构。 三维气泡膜情况要复杂一些,最可能形成的情况是侧面为正五边形的十二面体(即由十二个同样大小的正五边形所围成的小泡)，各面之间互成1200的角度。 泡与泡之间的隔膜比双分子层气泡膜厚很多倍，其中所夹带的液体会因重力而向下流动，液膜变得越来越薄,当膜的厚度达到几个微米时，即使粘度不大的液体,膜的中间层的流动也变得十分缓慢，最终液层停止流失.另外,液体流失还与气泡相互挤压有关，这种挤压力是由于界面的曲率不同而产生的。当膜间夹角为1200时,泡沫稳定。2232泡沫分离的操作方式及其影响因素 1、泡沫分离的操作方式 泡沫分离操作由两个基本过程组成： （1）待分离的溶质吸附到气液界面上；（2)被泡沫吸附的物质进行收集并用化学或机械的方法破坏泡沫，将溶质提取出来。因此它的主要设备为泡沫塔和破沫器。泡沫分离流程可分为间歇式和连续式两类.A 间歇式泡沫分离过程气体从塔底连续鼓入，形成底泡沫液从塔顶连续排出，原料液因不断形成泡沫而减少,可在塔底的下部补充适当表面活性剂，以弥补其在分离过程中的减少，间歇式操作可用于溶液的净化和有用组分的回收。操作流程如右图。 B 连续式泡沫分离过程 这种过程料液和表面活性剂连续加入塔内,泡沫液和残液连续从塔内排出. 按照原料液引入塔的位置不同，可将连续泡沫分离分为浓缩塔（或称精馏塔），提馏塔和两者叠加的复合塔，可分别得到不同的分离效果.（见上图a 、b、c） (a）浓缩塔：含表面活性剂的料液连续加入塔中的鼓泡区，在塔顶设置回流，将凝集的泡沫液部分引回塔顶,以提高泡沫液的浓度即塔顶产品浓度，故像精馏塔中的精馏段.除了外回流外，上升泡沫中气泡聚集所形成的内回流同样具有提高塔顶产品浓度的作用。但对残液的去污效果不好。 (b） 提取塔：料液从泡沫塔顶加入，相当于提取塔.这样的操作可以达到很高的去污系数。 (c)复合塔：料液和部分表面活性剂由泡沫段中部加入,塔顶也采用部分回流，相当于复合塔。 泡沫分离和其他分离过程一样,也可以把一组单级设备串联起来操作，以提高脱除率. 破沫可采用静止法、离心分离、声波、超声波、振动加热等方法。如果用加入表面活性剂来形成络合物的方法，脱除非表面活性物时，泡沫液中的络合物可通过化学反应使需脱除的非表面活性组分形成不溶解的化合物,然后用过滤将其从溶液中分出，再生的表面活性剂可循环使用.2、影响泡沫分离的因素评价泡沫分离方法的效果，主要看泡沫分离的富集率、分离率和回收率，一般而言影响这三个参数的因素有以下几项： A 待分离物质的种类 (1)待分离的物质是一种表面活性物质和一种溶剂的二元体系，则可应用Gibbs吸附公式计算表面过剩或分配系数。（2)待分离物质是非表面活性物质,如金属离子,则可用两种方法分离：（a)加入表面活性剂,使其与待分离离子一起被气泡带到液面予以分离;（b)把溶液调节至适当pH值，使待分离物质形成沉淀，并与表面活性剂一起被气泡带到泡沫层而分离。一般希望采用有机沉淀剂，因为它的选择性好，易于过滤。 B 溶液的pH值 溶液的pH值对分离效果有很大的影响。对于天然表面活性物质，如蛋白质在泡沫分离时，在等电点时效率最高，因为这时表面张力浓度曲线的斜率最大(吉布斯公式)；对于非表面活性物质，如金属离子，应控制在某pH值下使表面过剩和溶液浓度的比值C最大.这样可从离子混合物中分离出个别离子。 C 表面活性剂浓度 表面活性剂的浓度不宜超过临界胶束浓度，但也不能太低，使泡沫层不稳定,太高使分离效率下降。 D 温度 温度首先应达到表面活性剂的起泡温度，保持泡沫的稳定性，其次根据吸附平衡的类型来选择温度的高低。也可通过变温泡沫分馏，把不同的表面活性物质分开. E 气流速度 气流速度上升，泡沫形成的速度上升，则单位时间的去除率也上升，但泡沫中间歇液的含量也上升，因而降低了塔顶泡沫液的浓度。如气速过大,则泡沫中气液分离形成乳化气体，对操作会很不利。 F 离子强度 很多泡沫分离体系对离子强度很敏感,离子强度增加，效率很快下降。这是由相同电荷离子的竞争吸附引起的。 此外,泡沫的性质、层高、排沫方式、搅拌等也是影响泡沫分离的因素。2233 泡载分离技术的应用 泡沫分离的应用可以分两大类：一类是本身为非表面活性剂，可通过络合或其它方法使其具有表面活性的，这类体系的分离被广泛地用于工业污水中各种金属离子铜、锌、镉、铁、汞、银等的分离回收,以及海水中铀、钼、铜等的富集和原子能工业中含放射性元素锶的废水的处理.另一类是本身具有表面活性物质的分离以及各种天然或合成表面活性剂的分离,如全细胞、蛋白质、酶和胶体分子、合成洗涤剂等，下面着重介绍在生物工程中的应用。1 细胞分离 （1）大肠杆菌的分离 有报道用月桂酸硬脂酰胺或辛胺作表面活性剂，对初始细胞浓度为7。2106个cm3大常杆菌进行泡沫分离，结果用1分钟的时间能去除90的细胞，用10分钟时间就能去除99细胞。这个方法对于小球藻（Chlorela。 SP)和衣藻（Chlomydomonas。 SP)也是成功的。（2）螺旋藻的泡载分离曾文炉等2 用泡载分离法分离螺旋藻。首先将待处理藻液一次性倒入分离塔中，再经塔底引入经饱和增湿处理的载气N2,富集得到的浓藻液由塔顶排入贮槽，而经泡载分离得到的稀藻液则自塔底排出。泡载处理前，先向不同浓度藻液(OD560=0.32.1)中加入一定量的乙醇和表面活性剂Tween 20，使其浓度分别为Ce15（，下同)和CT=50300mgL,并调节藻液的pH为1012.5，离子强度（以电导率口表示）为0.91.9Sm同时控制载气流率Qg=2040L/h。结果发现在螺旋藻细胞的泡载分离与采收过程中,泡沫塔构造、起泡剂浓度、载气流率、藻液pH值、乙醇浓度等因素对泡载采收性能具有重要影响: 斜臂泡沫塔有助于泡沫间隙液的排放、提高泡沫相中细胞浓度及改善泡载采收性能.在 30min内，斜臂泡沫塔分离因子和浓缩倍数分别达到5。03和2。82，而垂直泡沫塔则仅分别为2.05和1。52。 当Tween 20浓度为100mgL、载气流率为30L/h，乙醇浓度为2%（)时，泡载采收过程分离因子和浓缩倍数较高在斜臂泡沫塔30min实验过程中,可分别达到5。046。52和2。744.31. pH对泡载分离性能有重要影响。pH为11左右可获得较高的采收效果，其分离因子和浓缩倍数分别为5。24和4。51。 (3） 酵母细胞的分离 酿成的啤酒，一般含有2040gL酵母，含水率达75，进行酵母的分离，对于酵母浆的脱水，可使用许多方法：浮选，分离，蒸发和干燥. 分离和浓缩酵母细胞的浮选法值得特别注意。但并不是所有的微生物培养物都具有足够的浮选能力，它在很大的程度上取决于酵母细胞的生理状态，为了获得浮选分离好的效果。必须有大的相接触表面（酵母细胞空气），要求空气的分散作用很小。浮选方法分离酵母较其它分离方法具有一系列的优点,比如可相当大地减少分离塔的数目,减少总投资,经济等。酵母的浮选能力受酵母的种属、细胞大小、杂质的存在影响,单枝细胞的浮选要比枝密酵母困难。 微生物工业使用的浮选设备可分为卧式与立式两种，也可以有一级操作和二级操作.最简单的结构是单级浮选塔。单级浮选装置1壳体;2固定槽；3隔离室；4充气器；5，8机械消沫器；6酵母悬浮体导入管；7泵设备由平面桶底的外部壳体1和泡沫槽2的内桶构成，泡沫槽与壳体之间的环形空间用隔板分成几段(V)，在V段中都装有充气器4，用机械的方法消泡5，处理过的发酵液从最后段经过用作水封的室排出，原始酵母悬浮体由发酵罐经连接管6进入浮选塔工段，在那里酵母被抽出达80%，然后酵母悬浮液通过隔板下部到达底部，在这些段中，酵母相应地被抽出10。52，这时生成泡沫并进入内泡沫槽,浓缩液由泡沫槽用离心泵送去分离。 2 蛋白质和酶的分离浓缩 蛋白质的泡沫分离28目前还只能说是处于一个初级阶段，真正要成功地将这一技术应用到生产还需要构建合适的研究模型,这就需要选取合适的蛋白质来研究.目前常用的研究模型蛋白质是血清白蛋白、酪蛋白和溶菌酶等，下表列出了一些研究过的用泡沫分离进行分离的物质。分离物来源参考文献磷酸酶磷酸酶粗品4链激酶链球菌培养物5蛋白酶人胎盘6,7血清白蛋白血清白蛋白稀液8，9，10血清白蛋白血清白蛋白和DNA混合物11，12，13血清白蛋白血清白蛋白和HBB混合物14溶菌酶溶菌酶和DNA混合物15胃蛋白酶胃蛋白酶和高血压蛋白原酶16尿素酶尿素酶和过氧化氢酶混合物17过氧化氢酶过氧化氢酶和淀粉酶混合物18大豆蛋白工厂黄浆水20-酪蛋白-酪蛋白稀液21 （1）几种蛋白的泡载分离泡沫分离可应用于多种蛋白质和酶的浓缩或分离。其最初是用于胆酸和胆酸钠混合物中分离胆酸.泡沫中胆酸的浓度为料液的36倍，活度增加65。泡沫分离还可应用于从非纯制剂中分离磷酸酶，从链球菌培养液中分离链激酶；从