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免免 疫疫 诊诊 断断P241第一节第一节 抗原或抗体的检测抗原或抗体的检测一、原理：一、原理：物质基础：物质基础：抗抗原原的的表表位位与与抗抗体体的的高高变变区区分分子子间间结结构构互互补补性与亲和性。性与亲和性。反应的阶段性：反应的阶段性：特异性结合阶段特异性结合阶段 可见反应阶段可见反应阶段特异性：特异性：比例性：比例性：可逆性：可逆性：抗原抗体抗原抗体非共价建非共价建前带前带后带后带等价带等价带二、抗原抗体反应的特点：二、抗原抗体反应的特点：1.1.凝集反应：凝集反应：颗粒性抗原颗粒性抗原(细菌、红细胞等细菌、红细胞等)与相应与相应抗体结合，在有电解质存在时，比例适当，抗体结合，在有电解质存在时，比例适当，形成肉眼可见的凝集团块。形成肉眼可见的凝集团块。凝集凝集沉淀沉淀标记技术标记技术(二二)抗原或抗体的检测方法：抗原或抗体的检测方法：（1 1）直接凝集：）直接凝集：玻片法：定性检测未知抗原玻片法：定性检测未知抗原 如如ABOABO血型鉴定、细菌鉴定血型鉴定、细菌鉴定 试管法：定量检测未知抗体试管法：定量检测未知抗体 如肥达氏反应如肥达氏反应直接凝集反应直接凝集反应（2 2）间接凝集：载体颗粒）间接凝集：载体颗粒（RBCRBC、乳胶等）、乳胶等）间接凝集：包被已知抗原，间接凝集：包被已知抗原，如如Coombs test反向间接凝集：包被已知抗体反向间接凝集：包被已知抗体已知已知间接凝集抑制反应：妊娠乳胶试验间接凝集抑制反应：妊娠乳胶试验(HCG)标标本本2.2.沉淀反应：沉淀反应：可溶性抗原（血清蛋白、细胞裂解液可溶性抗原（血清蛋白、细胞裂解液等）与相应抗体结合后，在有电解质存在等）与相应抗体结合后，在有电解质存在时，比例适当，出现肉眼可见的沉淀物。时，比例适当，出现肉眼可见的沉淀物。半固体琼脂凝胶为介质。半固体琼脂凝胶为介质。原理原理:检测抗原检测抗原单向免疫扩散：单向免疫扩散：Ab+琼脂琼脂制板制板打孔打孔AgNSAgAg加样加样观察观察（含量）（含量）沉淀环沉淀环Ag扩散扩散AbAb固定于固定于琼脂琼脂单向免疫扩散单向免疫扩散（2 2）双向免疫扩散：）双向免疫扩散：琼脂琼脂AbNS(3)(3)对流免疫电泳：对流免疫电泳：方法和原理：方法和原理：双扩电泳双扩电泳NSAgAb（4 4）免疫电泳）免疫电泳原理：电泳后双扩原理：电泳后双扩应用：血清蛋白种类分析应用：血清蛋白种类分析3.3.免疫标记技术：免疫标记技术：标记物：荧光素、酶、放射性核素等标记物：荧光素、酶、放射性核素等 特点：敏感性高，定性、定位、定量特点：敏感性高，定性、定位、定量（1）免疫荧光法：）免疫荧光法：FITCFITC、PEPE应用：应用：检测检测CDCD分子；传染病分子；传染病和自身免疫病诊断。和自身免疫病诊断。FITC标记标记（2）酶免疫测定）酶免疫测定：HRP、AP*酶免疫组化法：酶免疫组化法：测定组织中或细胞表面抗原测定组织中或细胞表面抗原 *酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）：）：测定可溶性抗原或抗体测定可溶性抗原或抗体ELISA原理：原理：将将已已知知抗抗原原或或抗抗体体吸吸附附于于固固相相载载体体（聚聚苯苯乙乙烯烯微微量量反反应应板板）表表面面，使使抗抗原原抗抗体体反反应应在在固固相相表表面面进进行行，用用洗洗涤涤液液将将游游离成分洗去。离成分洗去。方法：方法：*双抗体夹心法：双抗体夹心法：检测抗原检测抗原Ag底物包被标本洗涤酶标抗体酶标抗体*间接法：间接法：检测抗体检测抗体洗涤洗涤洗涤洗涤洗涤洗涤标本标本观察观察结果结果*生物素生物素-亲和素系统（亲和素系统（BAS）ELISA：生物素标记抗体，酶标记亲和素生物素标记抗体，酶标记亲和素*抗原竞争抑制法：抗原竞争抑制法：标本标本（3）放射免疫测定法（）放射免疫测定法（RIA）：）：131I、125I标记，微量物质测定标记，微量物质测定或放射或放射自显影自显影（4）免疫印迹）免疫印迹Western Blot覆盖转印覆盖转印硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜（去垢剂）（去垢剂）将分子大小不同的蛋白质分开将分子大小不同的蛋白质分开41 2441 24120120稀释稀释的抗的抗凝血凝血淋巴细淋巴细胞分离液胞分离液淋巴细胞淋巴细胞分离液分离液第二节第二节 淋巴细胞的测定淋巴细胞的测定外周血单个核细胞（外周血单个核细胞（PBMCPBMC）分离：）分离：密度梯度分离法密度梯度分离法血浆血浆血小板血小板PBMC红细胞红细胞粒细胞粒细胞单核细胞单核细胞淋巴细胞淋巴细胞90%淋巴细胞亚群的分离与鉴定：淋巴细胞亚群的分离与鉴定：尼龙毛分离法：尼龙毛分离法：E E花结实验：花结实验：CD2/LFA-2CD2/LFA-2利用表面利用表面标志分离标志分离淋巴细胞淋巴细胞亚群亚群免疫荧光免疫荧光流式细胞术：流式细胞术：样样品品进进入入孔孔待分离单细胞悬液待分离单细胞悬液荧光标记抗体荧光标记抗体产生散射光产生散射光光电倍增管光电倍增管发射荧光发射荧光根据细胞根据细胞表面电荷表面电荷Lc功能测定：功能测定：1.1.淋巴细胞增殖淋巴细胞增殖/转化试验：转化试验：原理：原理：有丝分裂原等非特异刺激有丝分裂原等非特异刺激T T、B B细胞细胞向淋巴母细胞转化、增殖。向淋巴母细胞转化、增殖。方法：方法：MTTMTT法：法：线粒体琥珀脱氢酶线粒体琥珀脱氢酶MTT（噻唑盐）（噻唑盐）甲臜颗粒甲臜颗粒（紫蓝色）（紫蓝色）氚标记的胸氚标记的胸腺嘧啶核苷腺嘧啶核苷放射能放射能丝裂原丝裂原淋淋巴巴细细胞胞增增殖殖实实验验3 3H-H-TdRTdR掺入法掺入法MTT用酶标仪用酶标仪测定细胞测定细胞培养培养ODOD值值2.T2.T细胞介导的细胞毒试验：细胞介导的细胞毒试验：CTLCTL待检待检杀伤杀伤靶细胞靶细胞标记标记3.B B细胞溶血空斑实验：细胞溶血空斑实验：RBC表面表面AgAb溶血空斑溶血空斑补体补体13小时小时检测：检测：B B细胞的抗体产生功能细胞的抗体产生功能 溶血空斑溶血空斑溶溶血血空空斑斑实实验验