PCR技术的原理与方法课件.ppt

PCR技术的原理与方法技术的原理与方法 钟召迪钟召迪PCR定义l 聚 合 酶 链 反 应(Polymerase Chain Reaction)简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。l 是指在DNA 聚合酶的催化下，以母链DNA 为模板，一特定引物为延伸起点，经过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出于母链模板DNA互补的子链DNA的过程。l 可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等。PCR反应特点l特异性强l灵敏度高l简便、快速l对标本的纯度要求低PCR技术的基本原理lPCR的反应成分lPCR的反应基本步骤lPCR的反应体系PCR的反应成分l模板DNA l引物l四种脱氧核糖核苷酸lDNA聚合酶l反应缓冲液，Mg2PCR的反应基本步骤lPCR的反应基本步骤l变性：高温使双链DNA解离成单链（94 ，30s）l退火：低温下，引物与DNA模板互补区结合（55 ，30s）l延伸：中温延伸，DNA聚合酶催化以引物为起点的DNA链延伸反应（7072 ，3060s）PCR的反应体系 10扩增缓冲液 1/10体积 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物(2个)0.2umol/L 模板DNA 102 105 Taq DNA聚合酶 1 2.5单位/反应体系 Mg2+1.52.5mmol/L 加双或三蒸水至 25 50ulPCR反应五要素l引物（primer）l 酶（Taq DNA polymerase）l dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）l模板（template）lMg2+（magnesium）引物l引物是PCR特异性反应的关键lPCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度l理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增引物设计的原则l引物最好在模板cDNA的保守区内设计l引物长度一般在1530碱基之间l引物GC含量在40%60%之间，Tm值最好接近72l引物3端要避开密码子的第3位l引物3端不能选择A，最好选择Tl碱基要随机分布l引物自身及引物之间不应存在互补序列引物设计的原则l引物5 端和中间G值应该相对较高，而3 端G值较低l引物的5端可以修饰，而3端不可修饰l扩增产物的单链不能形成二级结构l引物应具有特异性酶及其浓度l目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成l一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100 ul时）l浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少DNTP 的质量与浓度dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低模板（靶基因，TARGET GENE）l模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一l传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K 来消化处理标本SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸MG2+浓度lMg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响l在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜lMg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少PCR反应条件的选择 PCR反应条件:温度 时间 循环次数温度与时间的设置l设置变性-退火-延伸三个温度点l标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸l对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸变性温度与时间l变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因l一般9394lmin足以使模板DNA变性 若低于93则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。l此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败退火(复性)温度与时间l退火温度是影响PCR特异性的较重要因素l变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞l退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度l对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想延伸温度与时间l延伸温度：一般选择在7075之间 常用温度为72 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。l延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）34kb的靶序列需34min 扩增10Kb需延伸至15minl延伸进间过长会导致非特异性扩增l对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些循环次数l循环次数 决定PCR扩增程度l循环次数 主要取决于模板DNA的浓度l循环次数：选在3040次之间l循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多谢谢！