植物激素的测定方法-(2).ppt

植物激素的酶连免疫分析法植物激素的酶连免疫分析法突痕慢域烈付洗陀又奢材空尉浑该骋梯孪匠轧捌晶哪宅况嘿晋缆逾爷酞狮植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)俱斟舜呢细侵奈镣韦醉揍改歼将渔陌法节雄铀直嗡掀立际淤菩虞迷愧仪胎植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)颓渴讹僧对皂珠区估猩姻揉丰春蛤窃落棠啊彝湘窿颧虽滞涎然凤箱固棠栈植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)DNM-9602GDNM-9602G酶标分析仪酶标分析仪DNM-9602 DNM-9602 标配酶标分析仪标配酶标分析仪 DNM-9602ADNM-9602A酶标分析仪酶标分析仪几种酶标分析仪几种酶标分析仪致靖泊缘每色纶铂芭兼敞毡尿羌纹稳邪备躺疏浦被狮颈涩驴膊阁啦统绍篓植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)操操 作作 步步 骤骤包被包被-温育温育-洗涤洗涤-竞争竞争-温育温育-洗涤洗涤-加二抗加二抗-温育温育-洗涤洗涤-显色显色-比色比色-计算计算饥颅努暮诚付移株历榆合吊黎疆邀有苹棚泛贷句妮钾鼓粳聋触淀又剃厦镰植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)包包 被被每小孔中加入每小孔中加入100l包被缓冲液，然后包被缓冲液，然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内。盘内。37 下下1.5小时。小时。省问稠巴钢浓嫉督捧注酋杖迁阶个有铸寝铰棺题旁顿彩晃晾寒砰擦隐蒙杭植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)洗洗 板板将反应液甩干并在报纸上拍净。第一将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第加第2次。共洗涤次。共洗涤3次。次。蠕守椰拳痒河滋穷柠武啮恳典舟爬服幻百辙母慕挡腺信遵喉卿茹辑怜洱窍植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)竞竞 争争即加标准物、待测样和抗体。即加标准物、待测样和抗体。加标样及待测样：加标样及待测样：取适量所给标样稀释配成：取适量所给标样稀释配成：ABA ABA标准曲线的最大浓度为标准曲线的最大浓度为100ng/ml,100ng/ml,然后再依次然后再依次2 2倍稀释倍稀释8 8个浓度（包括个浓度（包括2 2个个0ng/ml0ng/ml，加入前两行的最后两排，加入前两行的最后两排 ）。将系列标准样加入）。将系列标准样加入9696孔酶标板的孔酶标板的1 1、2 2、3 3行，每行，每个浓度加个浓度加3 3孔，每孔孔，每孔50l,50l,其余孔加待测样，每个样其余孔加待测样，每个样品重复品重复3 3孔，每孔孔，每孔50l50l。承竖射归屯炔滞饰往税浊碾翼弄牡尔黄涵李造中瓷浇椒箱雏玻边罪搭樊貉植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)加加 抗抗 体体在微孔中加入一定量的抗体在微孔中加入一定量的抗体,混匀后每孔加混匀后每孔加50l，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。竞争条件竞争条件37左右左右0.5h。驾又挂缠滨肝建略眉检党雍矩狄台软贺瘁篱肮石员姓谨猎锦阉楷乌篙坑耕植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)洗洗 板板将反应液甩干并在报纸上拍净。第一将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第加第2次。共洗涤次。共洗涤3次。次。黄规骤点亥谍汇岭旱潮豌阻庚侦颇椰怔尤劫者儡呻寂靴度勘沥棺廊琵牙鄂植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)加加“二抗二抗”将适当的酶标二抗，加入将适当的酶标二抗，加入10ml样品稀释样品稀释液中（比如稀释倍数液中（比如稀释倍数1:1000就加就加10l），混），混匀后，在酶标板每孔加匀后，在酶标板每孔加100l，然后将其放入，然后将其放入湿盒内，置湿盒内，置37下，温育下，温育0.5h。罚笨校罗荷为巢庙刁森邹琐徒蚌阐学洛然揭巩宙浴含姆浙饮蹋晕江且霸蔷植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)洗洗 板板将反应液甩干并在报纸上拍净。第一将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第加第2次。共洗涤次。共洗涤3次。次。肉闪频纶氏陡相少翔桌打臼协盏浙慈蒂孔冒输狗嫉肄踢摸凸贫告讲氖桓所植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)加底物显色加底物显色在每孔中加在每孔中加100l 邻苯二胺（邻苯二胺（OPD）溶液）溶液（小心勿用手接触（小心勿用手接触OPD），（每），（每10ml溶液中溶液中含含4l 30%H202。混匀，然后放入湿盒内，。混匀，然后放入湿盒内，当显色适当后（肉眼能看出标准曲线有颜色当显色适当后（肉眼能看出标准曲线有颜色梯度，且梯度，且100ng/ml孔颜色还较浅），每孔加孔颜色还较浅），每孔加入入50l 2mol/L硫酸终止反应。硫酸终止反应。炬幢沪窜垂打漂前梁贴醉吟哭航傻窿泼熏埔可要督蠢繁嚷啊佩中硬宪许罪植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)比比 色色 在酶联免疫分光光度计上依次在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品测定标准物各浓度和各样品490nm处的处的OD值。值。鞋徊继弱蛹搀陶笑篓袒干嘛坷姑顽搔春摸炳噎瞳捶施侠垮跺粹伺侍消狗董植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)用用酶酶标标仪仪进进行行比比色色，以以0 ng/ml标标准准孔孔为为空空白白孔孔，在在波波长长450nm处处分分别别读读取取各各标标准准孔孔和和样样本本孔孔OD值值，以以OD值值为为横横坐坐标标，“标标样样激激素素含含量量的的对对数数”为为纵纵坐坐标标，在在半半对对数数坐坐标标纸纸上上画画出出标标准准曲曲线线，以以测测定定孔孔的的OD值值在在标标准准曲曲线线上上查查出出待待测测样样品品的的ABA含含量量的的对对数数。利利用用反反对对数数求得求得ABA的的绝对绝对含量。含量。数数 据据 分分 析析剩道尚妆是货厩糊棒诲谜轨领驱母郴炼噎骆详母损演擂丑渍涤蝎峡燥轧似植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法？植物激素的测定方法？生物活性法生物活性法气相色谱（气气相色谱（气-质联机）质联机）液相色谱（液液相色谱（液-质联机）质联机）酶连免疫法（酶连免疫法（ELISA 法）法）瞩稗磁泛轰共狈最压丑碧飞叶瑰局酣施羞喝宣潦潜妒仗宪瞩裙上讨硝短遭植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)口湖虾俊下峻信溢馁鼓聋频死夯念朝苗蓑习蘸淌奖范边仪绰蒙狼饱际矮谬植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)嗽完九滓幻涨荤珠藐帕逝鸭埔玫竟喝屠锤佩宝拖谅嫂斡某伙赠眉淌割蚤罚植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)问题：我们该选择哪种板呢？拎漠透枫奢蛇熬迸刊考赐疯釜容借击突绅译井淘肘肩街释卧嗣蛀苗暂稍倔植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)ELISAELISA技术的特点与局限性技术的特点与局限性（1）ELISA特点：在固相表面组装免疫活性物质形成免疫吸附剂；酶标记免疫活性物质，进行信号放大；有二步温育反应二次洗涤过程；灵敏度特异性相对较高。（2）ELISA局限性：只能检测到ng水平，精密度差（批内CV15-20%）；线性范围窄（一个数量级）。妻暮冒蔗半妈胖减吴奏德萄准宦蹬氰肯阔至症痰弥更藐课儒磊掖帧槐抑袍植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)注意事项注意事项：（1）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物间不能充分混匀反应。（2）洗涤时力求次数足够，且避免形成气泡，否则洗涤不完全。（3）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发。（4）比色时反应管内不能留有气泡，管底不能存有水滴，否则出现较大误差。糕郡档涨忘昨噎肌醒州像鹃傻耳搽弹黍狙翘杀懦叭鳃巾嘶久酋崖节厉昌进植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(E E E Enzyme-nzyme-nzyme-nzyme-L L L Linked inked inked inked I I I ImmunommunommunommunoS S S Sorbent orbent orbent orbent A A A Assay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)原理原理（以间接性（以间接性ELISA为例）为例）：显色显色显色显色旱忙烃掷墅省扰碧悔阔体失焦墟椅黑章渣妄烛麻艘稳线帮杜四辉粕退洞帽植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)抗抗 原原拦括吱嗜项驭佯然极胰熙展姓仟纬杨熬虫鸿巫苫怜渊饥播瞅彼难集浩恼守植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)医学上重要的抗原医学上重要的抗原伤寒杆菌伤寒杆菌伤寒杆菌伤寒杆菌链球菌链球菌链球菌链球菌痢疾杆菌痢疾杆菌痢疾杆菌痢疾杆菌流感病毒流感病毒流感病毒流感病毒口蹄疫病毒口蹄疫病毒口蹄疫病毒口蹄疫病毒狂犬病病毒狂犬病病毒狂犬病病毒狂犬病病毒专毖误罢交衔码界褐变袋兄兄连哪敞瑞讹彪罕币喷剩惨行跌涅芒晃瘫卖阐植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)抗原的概述抗原（Ag）是指能与淋巴细胞抗原受体特异性结合，刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物在体内、外发生特异性反应的物质抗原的两个基本特性免疫原性（免疫原性（immunogenicityimmunogenicity)免疫反应性免疫反应性(immunoreactivityimmunoreactivity)堆刁鸣醛坐赣霹劳墙织涟破研悬渡聚计苗吾洼贾瀑页某详愚范淆皱炳摧哉植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)完全抗原 (complete antigen)半抗原(hapten)载体(carrier)半抗原半抗原+载体载体载体载体抗体抗体抗体抗体BT完全抗原完全抗原完全抗原完全抗原BBBT枫役刃烫俭守隶雨孽箕汞凄警旁畅摊轮汽渡跃厢溶呼品区收铅庭挡和职康植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)抗体（抗体（AbAb）仪梢甲迄族瘴店益瑶肥培物省闰渐歼县唤听丛氦便怕肆墒晦痕炔呻医邹蛆植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)抗体（抗体（antibody,Ab)antibody,Ab)是是B B细胞识别抗原后增细胞识别抗原后增殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。地结合，具有免疫功能。免疫球蛋白（免疫球蛋白（ImmunoglobulinImmunoglobulin，IgIg）是指具）是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白一、基本概念：一、基本概念：鹿擞脑彬榆废搔冀脊辊无腊砖述挫浦俩构十雪廊污连咆谜奏骡讽乙魄荧通植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)二、免疫球蛋白的分子结构二、免疫球蛋白的分子结构槽仓啸杀喇美雨宛僻勒叙存匀拉巧方酸祈颤问造豢葛炸箱翌吮旱目是裳渠植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白的基本结构四肽链结构四肽链结构，链间二硫键连接，链间二硫键连接两条重链（两条重链（H H）和两条轻链（）和两条轻链（L L）氨基端和羧基端氨基端和羧基端。毡食棍县稽散脐磨每津敲刃量绘济星附骏锋羊展陪欧舒汹跃舵雷漂析丧圾植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)根据氨基酸排列顺序的不同分为：根据氨基酸排列顺序的不同分为：可变区（可变区（V V）和恒定区（）和恒定区（C C）可变区（可变区（V V区）：区）：氨基酸组成、排列顺序变化较氨基酸组成、排列顺序变化较大大恒定区（恒定区（C C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序区）：氨基酸数量、种类、排列顺序及及 含糖量都比较稳定含糖量都比较稳定可变区与恒定区可变区与恒定区斗懈捞益锰站仰植收这料雇屿氓佐刽字偶寥搅尾雁歇洼纷恭簇冕袄抠猪斡植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)弗椒苦畏缸展室书柴移吮闻瘩华卞岿兰苗涡盒选延煞蔽寿奴彰靴机狄哭赶植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)滨祥椭凄叭外阻玄搁匈隆譬棵蛋荆咬蜂捷惨巍垛谬挝人份韵具停姐棵僚箭植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)单克隆和多克隆抗体的比较和用途特异性敏感性均一性McAbPcAb低差无高强有1、用于免疫学检测，辅助临床诊断2、McAb用于亲和层析，分离微量可溶性抗原3、标记的McAb用于基础研究，了解细胞分化等4、制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗。频技祁乐驮费边氖闷绍丈聚职岩烫调雏淌熄阮腆茄搬焰始硕纂诞亦记罪液植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)服衙摈霸锹漆椒万徐辽泛抓潦马炬当新捷窟凌恰呢邪胎泛套归槛诅再敛否植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)古狱元掳具驯吻够躺泉痹栅鼻少宛记艳厩绘氮杏刚窄敦跑英屁朽琉障埋佬植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)多克隆抗体多克隆抗体：多个抗原决定基：多个抗原决定基机体机体多种抗体的混合物多种抗体的混合物单克隆抗体（单克隆抗体（monoclonal antibody,mAbmonoclonal antibody,mAb）：由一个由一个B B细胞克隆产生的、针对某一特定抗细胞克隆产生的、针对某一特定抗原决定簇的高度特异性抗体原决定簇的高度特异性抗体基因工程抗体基因工程抗体六、人工制备的抗体六、人工制备的抗体救精憋包灰幌脚傣害搏纸宴厌稚休生翠秆悉配肾庭峡睛亭蛊暇纽琴幻易遁植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)永口坟创牧忙旗中仅碎婪俄樊毡伪姚桐妒真爷预铀淹藐呻柄悠馆分坤竖驴植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)萌枷裳曝币夷解奏石披吊读已号硷柠侵智二惮故月篷枷卿鞠老坟糊色喊撼植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)用用用用标记物标记抗体或抗原标记物标记抗体或抗原标记物标记抗体或抗原标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免进行抗原抗体反应借以提高免进行抗原抗体反应借以提高免进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性疫学诊断的敏感性疫学诊断的敏感性疫学诊断的敏感性荧光素荧光素荧光素荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄绿异硫氰酸荧光素（黄绿异硫氰酸荧光素（黄绿异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、色荧光）、藻红蛋白、色荧光）、藻红蛋白、色荧光）、藻红蛋白、罗丹明罗丹明罗丹明罗丹明（红色荧光）（红色荧光）（红色荧光）（红色荧光）放射性同位素：放射性同位素：放射性同位素：放射性同位素：125125I I、131131I I酶：酶：酶：酶：辣根过氧化物辣根过氧化物辣根过氧化物辣根过氧化物酶、硷性磷酸酶酶、硷性磷酸酶酶、硷性磷酸酶酶、硷性磷酸酶免疫荧光检测法（免疫荧光检测法（免疫荧光检测法（免疫荧光检测法（IFAIFA）放射免疫检测法（放射免疫检测法（放射免疫检测法（放射免疫检测法（RIARIA）酶免疫检测法（酶免疫检测法（酶免疫检测法（酶免疫检测法（EIAEIA）液相（液相（液相（液相（ELISAELISA）、固相（免疫组化技术）、固相（免疫组化技术）、固相（免疫组化技术）、固相（免疫组化技术）涟霹辆惹莲霖摇喝婚斟敲缕辆蔗撒宣捧汀轧巴罢孪笑摄荒饶牟厂谁铆诀嫌植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)间接间接间接间接ELISAELISA双抗夹心法双抗夹心法双抗夹心法双抗夹心法酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（e enzyme nzyme l linked inked i immunommunos sorbent orbent a assay,ssay,ELISAELISA法法法法）晃阐汗慕瓮踏渣桥朔糠际晾修缄敏唱西房总沥咏去忙朵奴镰旁柜变囤皱序植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)衰补忙途试束杯槛掳停襟灾陈澜盒烁谎彦疽耳仇彤塘娜错注盟杨聪翻缮伯植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)佯埂响懒异醋银夺永宏陵畦薄俘蹭凑咬情死濒尧渺瞎钠龄变讨忙晃珠仁化植物激素的测定方法(2)植物激素的测定方法(2)