一、改良加藤法的操作规范.ppt

东至县血吸虫病防治站2016.9.2改良加藤氏厚涂片法（kato-katz法）一、改良加藤法的发展 1954年日本学者Kato and Miura首先报道了一种蠕虫卵厚涂片法的检查技术，是用在甘油透明液中浸泡过的亲水玻璃纸替代盖玻片。1971年巴西学者Katz等在此基础上进行改进，通过定量模具来获取定量粪便，实现了对蠕虫卵的定量检测，该法被称为改良加藤法（即Kato-Katz法)。1993年世界卫生组织WHO推荐该法，是目前应用最广泛的肠道寄生虫病病原检查方法之一 一次检查粪便量是直接涂片法的20倍以上。由于检出率比直接涂片法高，而且简便、省时、费用又少，故特别适用于集团检查。本法可以检查粪便中各种寄生虫卵。尼龙绢(80-100目）滤除粪便中的粗渣；定量板获取定量粪便；利用甘油对粪便、虫卵等的透明作用；孔雀绿：显微镜视野光线柔和，减少眼睛疲劳；二、原 理三、试剂与材料透明液：H2O 100ml+甘油100ml+3孔雀溶液1ml混匀；亲水玻璃纸:2630mm大小，24h；尼龙绢片:规格为80100目，裁剪成 8cm8cm大塑料定量板；塑料刮片等。四、操 作 步 骤制片前期准备：1、穿工作衣带手套2、登记并编号 每份粪样取1张载玻片编同一号,2、准备相关材料A10A10加藤法制片阶段1、刮取粪样A10A10 2.定量粪样将印有AJG字样的定量板面朝上并放在载玻片中部 A10A103、覆盖亲水玻璃纸并压片A104、透明/镜检与保存3.制片后期整理：1、制片完成后首先应核对总体数字、编号；2、收拾工作台，将制过片的粪样和废弃物放入指定位置进行处理；3、全部工作结束后洗手。五、结 果 观 察 1.将透明后的加藤片置于光学显微镜的载物台上，在低倍镜下（10）进行镜检。镜检时仔细检查每一视野，并特别注意受精蛔虫卵与未受精蛔虫卵的鉴别。2.个别虫卵鉴别困难时,可换高倍(40)镜检。七、结果记录及EPG计数观察的结果即时记录在原始登记表。感染度（EPG）计算：每孔粪便量为41.7mg时,则简化为:单孔(一粪一检)(EPG)=A24 双孔(一粪二检)(EPG)=A12 三孔(一粪三检)(EPG)=A8八、制片注意事项：1、收集的样本要新鲜，注意掌握好时间和温度，特别是夏季避免暴晒，以免虫卵的丧失；2、亲水性透明玻璃纸：玻璃纸浸泡要充分，要一片一片放入透明液中，切忌整叠放入，需浸泡24小时以上；3、确定定量板的容量，每孔所容粪便重量平均41.7mg，每片所得虫卵数乘以24，即得每克粪便的虫卵数。规格不一样容量有区别，用前需校正定量板的容量；4、粪便过硬时，可加少许蒸馏水或透明液浸泡，待粪便变软后再行刮取；粪便过稀时，可用吸水纸吸取多余水分，再行操作；带有脓血便的粪样应在脓血便处取样；5、涂片放置时间长短是确保镜检质量的关键。一般室温25、75%湿度以下，涂片放置时间不宜超过2小时若温度低，空气湿度大，涂片放置时间可适当延长。总之，涂片放置时间取决于粪样透明度，只要透明了，就应及时镜检，否则透明过渡，薄壳虫卵易变形看不清楚，会造成漏检或误判。也有学者用氨基黑-伊红染色来克服这一缺陷，并取得满意效果；6、粪膜需在玻片中部。如粪膜偏于一侧，则镜检时粪膜边缘不能进入视野，定量不准确。解决办法：此时可在显微镜载物台上放一块厚玻片，然后将带测样品的涂片放在厚涂片的中央部位即可；7、将制过片的粪样和废弃物放入指定位置，经处理后方能丢弃，防止污染环境。九、方法学评价 在病原学检查技术中，Kato-Katz法是定性、特别是定量检测肠道血吸虫和土源性蠕虫感染的相对标准化的方法，适宜检测常见蠕虫的感染度、患病率，在流行病学调查和防治效果考核中具有实用价值。1、应用范围：优点 1.方法简便，定性定量一次完成。2.操作过程中不像集卵法和孵化法那样有虫卵散失的缺陷,因而定量相对准确。3.涂片制作后可长期保存(薄壳虫卵除外)，便于质量管理和控制,也便于合理安排查病时间。缺陷 1.感染度偏低的地区,轻感染者易被漏检.2.薄壳虫卵在涂片中形态变化非常大,初学者难以辨认而影响检出率.3.由于排卵的不稳定性,实验条件掌握不当,都有 可能影响到检测效果.十、加藤片的保存:1.将制好的加藤片固定在标本盒中，喷杀虫 剂在4冰箱保存。2.或在加藤片中加入樟脑丸放入4冰箱保存。3.还可以将检查后的加藤片重叠放好，并用 报纸包好，外加带齿的塑料袋封好放入4 冰箱保存，这样保存的片子不易霉变且能久 存。附2.改良加藤厚涂片中常见蠕虫卵的形态特征（一）、线虫卵1、蛔虫卵人体蛔虫卵在改良加藤片中的形态有四种：有蛋白膜受精蛔虫卵、脱蛋白膜受精蛔虫卵、有蛋白膜未受精蛔虫卵、脱蛋白膜未受精蛔虫卵。（1）受精蛔虫卵：形态基本未变，宽椭圆形，棕黄色，脱蛋白膜后为无色透明或淡黄色，大小45-7535-50um，卵壳厚呈双线层，内含一个大而圆的卵细胞。要注意脱去蛋白膜的、卵细胞已分裂的受精蛔虫与钩虫卵相区别。鉴别要点是前者卵壳厚呈双线层，后者卵壳薄呈单线层。受精蛔虫卵（100）受精蛔虫卵（400）受精蛔虫卵（400）受精蛔虫卵（400）受精蛔虫卵（100）（2）未受精蛔虫卵：长椭圆形，黄色，大小88-9338-44um，内含的屈光颗粒常因透明过度而消失，卵壳薄，易于变形，形态很易与血吸虫卵相混淆，鉴别要点是未受精蛔虫卵卵壳厚薄不均且 凹凸不平，而血吸虫壳薄而均匀。透明适度的标本，血吸虫卵可见卵内毛蚴形态，毛蚴与卵壳间有空隙，而未受精蛔虫卵内无毛蚴形态，不存在毛蚴与卵壳间的空隙。未受精蛔虫卵（100）未受精蛔虫卵（400）未受精蛔虫卵（400）未受精蛔虫卵（400）未受精蛔虫卵（400）未受精蛔虫卵（400）未受精蛔虫卵（400）未受精蛔虫卵（400）2、钩虫卵：椭圆形，大小57-7636-40um，属薄壳虫卵，透明后虫卵形态变化最大。透明适度的标本，可见卵内一困困灰色卵细胞（2-8）。细胞膜与卵壳之间有明显的空隙，透明时间过长，卵内结构模糊不清，鉴别困难。最终会因透明过度而消失。一般涂片放置0.5-1小时即应镜检,不能超过4小时。另外注意钩虫卵与毛圆线虫属虫卵相鉴别。后者呈长椭圆形，两端不对称，内含8-25个卵细胞。钩虫卵（400）钩虫卵（400）钩虫卵（400）3.鞭虫卵形态基本未变，腰鼓形（橄榄形），黄褐色，大小50-5422-23um，卵壳厚，内容物呈颗粒状，两端的透明栓有时被粪便遮住或透明过度而消失。鞭虫卵（400）鞭虫卵（100）鞭虫卵（400）鞭虫卵（100）鞭虫卵（400）4、蛲虫卵：形态基本未变，为不对称的长椭圆形，一侧扁平，一侧稍 凸，一般无色透明，有时被孔雀绿染成绿色，大小50-6020-30um，卵壳厚，卵内有一胚胎期幼虫上，应注意将蛲虫卵与类似蛲虫卵的植物种子相区别。蛲虫卵（100）蛲虫卵（400）蛲虫卵（100）蛲虫卵（400）（二）吸虫卵 1、日本血吸虫卵：椭圆形，透明成白色，大小74-5555-80um，壳薄而均匀，透明适度的标本，可见卵内毛蚴形态，毛蚴与卵壳有空隙，如透明过度，则毛蚴结构不清楚，毛蚴与卵壳间的空隙消失。一般看不见一侧的小刺。与未受精蛔虫卵的鉴别要点是透明适度的标本，血吸虫卵可见卵内毛蚴形态，毛蚴与卵壳间有空隙，。未受精蛔虫卵卵壳厚薄不均且凹凸不平，而血吸虫卵壳薄而均匀。血吸虫卵（400）血吸虫卵（400）血吸虫卵（100）血吸虫卵（400）血吸虫卵（100）类似血吸虫卵类似血吸虫卵类似血吸虫卵 2、布氏姜片吸虫卵：长椭圆形透明成白色，大小130-14080-85um，卵壳薄而均匀，卵内含有的一个卵细胞和许多卵黄细胞常因透明而消失或不清楚，透明后卵内常形成2-4条皱折线，形态多样，折线中色较深，不透明，卵盖常裂开。易与棘口科虫卵和肝片形虫卵相混淆，鉴别主要靠测量虫卵的大小，必要时加做小瓶倒置或水洗沉淀法。姜片吸虫卵（100）姜片吸虫卵（100）姜片吸虫卵（400）姜片吸虫卵（100）3、卫氏并殖吸虫卵：(肺吸虫)卵壳比较厚，在改良加藤厚涂片中卵壳不易破裂，卵盖清楚，但卵盖有时会裂开，内含物（一个卵细胞和许多卵黄细胞）会消失或看不清楚，在内含物消失处的卵壳颜色常加深4华支睾吸虫卵(肝吸虫)低倍镜下为无色透明芝麻点状，大小27-3512-20um，高倍镜下为淡黄褐色，灯泡形，卵壳较厚，不变形，常见卵盖和卵内的毛蚴轮廓，肩峰和小疣不一定能看见。与异形科吸虫麝猫后睾吸虫卵很难鉴别，必要时驱虫鉴定。华支睾吸虫卵（100）华支睾吸虫卵（400）华支睾吸虫卵（100）华支睾吸虫卵（400X）卫氏并殖吸虫 卵壳比较厚，在改良加藤片中卵壳不易破裂，卵盖清楚，但卵盖有时会裂开，内容物（一个卵细胞和许多卵黄细胞）会消失或看不清楚在内含物消失外的卵南宁颜色常加深。带绦虫卵：猪带绦虫（链装带绦虫）卵和牛带绦虫（肥胖带绦虫）卵，在显微镜下难区分，故一并介绍。带绦虫卵的卵壳很薄，在粪便中已经脱落，所见近似卵壳之物其实是胚膜。改良加滕厚涂片中形态基本未变，圆形或卵圆形，淡黄褐色，直径31-43um，外层为具有放射状条纹的胚膜，内含一个六钩蚴。透明时间过长，则胚膜易破裂。带绦虫卵（400）缩小膜壳绦虫卵（长膜壳）：形态基本未变，椭圆形，黄褐色，大小60-7972-86um，壳稍厚，内含一个六钩蚴。若涂片放置时间过长，则虫卵易扭曲变形或破裂，要注意识别。长膜壳绦虫卵（400）长膜壳绦虫卵（400）长膜壳绦虫卵（400）长膜壳绦虫卵（400）微小膜壳绦虫卵（短膜壳）：灰色透明，大小48-6036-48um，卵壳薄而光滑，内含一个六钩蚴，胚膜两端有极丝，则虫卵可因透明而消失。短膜壳绦虫卵（400）