基于高通量测序技术解析菌草酒发酵过程中细菌菌群变化.pdf

2023 Vol.42 No.852Serial No.378China BrewingResearch Report基于高通量测序技术解析菌草酒发酵过程中细菌菌群变化范锦琳1-2,易超1-2,王诗宇1-2,张丽丽1-2,林冬梅,林辉2,林占嬉2*（1.福建农林大学生命科学学院，福建福州350 0 0 2;2.福建农林大学国家菌草工程技术研究中心，福建福州350 0 0 2）摘要：以11个不同发酵时期的菌草酒酒酷样品为研究对象，通过高通量测序技术初步解析菌草酒发酵过程中细菌菌群结构的变化。结果表明，菌草酒发酵过程中细菌菌群在不断调整和平衡，共注释到14个门、32 个纲、6 2 个目、8 9个科、117 个属。优势细菌门（平均相对丰度 1%)有3个，分别为厚壁菌门（Firmicutes）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）。优势细菌属有7 个，其中未知菌属（unidentified)和魏斯氏菌属（Weissella)为发酵前期的绝对优势细菌属。片球菌属（Pediococcus）、乳酸菌属（Lactobacillus）、乳球菌属(Lactococcus）、泛生菌属（Pantoea)和芽孢杆菌（Bacillus)为发酵中后期的主要优势细菌属。主成分分析(PCA)结果表明，发酵0 d和2 d的样品较为接近，发酵0.5d、1d、3d 和5d的样品较为接近，发酵7 2 1d的样品距离较为接近，发酵30 d的样品与其他样本距离较远，说明不同发酵时期菌草酒酒醋样品的细菌菌群相似程度具有阶段性，且与发酵时间有关。关键词：菌草酒；高通量测序；细菌菌群变化中图分类号：S554.9引文格式：范锦琳，易超，王诗宇，等.基于高通量测序技术解析菌草酒发酵过程中细菌菌群变化.中国酿造，2 0 2 3,42(8)：52-57.Analysis of changes of bacterial flora of Juncao wine during the fermentation process based onFAN Jinlin2,YI Chao2,WANG Shiyu2,ZHANG Lili,LIN Dongmei,LIN Hui,LIN Zhanxi2*(1.College of Life Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China;2.National Engineering Research Center of Juncao,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)Abstract:In this study,using fermented grains samples of Juncao wine from 11 different fermentation periods as the research objects,the changes ofbacterial flora structure of Juncao wine during fermentation process were preliminary analyzed by high-throughput sequencing technology.The resultsshowed that the bacterial flora was constantly adjusted and balanced during the fermentation process of Juncao wine,and a total of 14 phyla,32 taxa,62 orders,89 families and 117 genera were noted.There were 3 dominant bacterial phyla(average relative abundance 1%),namely Firmicutes,Cyanobacteria and Proteobacteria.There were 7 dominant bacterial genera,among them,the unidentified and Weissella were the absolute dominantgenera in the early stage of fermentation.Pediococcus,Lactobacillus,Lactococcus,Pantoea,and Bacillus were the dominant genera of bacteria in themiddle and late stages of fermentation.The results of principal component analysis(PCA)showed that the samples fermented for 0 d and 2 d were sim-ilar,the samples fermented for 0.5 d,1 d,3 d and 5 d were close,the samples fermented for 7-21 d were close,and the samples fermented for 30 dwere significantly different from other samples,indicating that the similarity of the bacterial flora in fermented grains of Juncao wine at different fer-mentation periods was phased and related to fermentation time.Key words:Juncao wine;high-throughput sequencing;bacterial community change菌草最早是198 6 年由福建农林大学林占嬉研究员提出的。目前，根据三级系统筛选法已经获得菌草品种45种，主要为巨菌草、柠檬香茅、紫象草、五节芒、绿洲1号等。巨菌草(Cenchrus fungigraminus Z.X.Lin&D.M.Lin&S.R.Lansp.Nov.)具有产量高、纤维、粗蛋白和糖分含量高的特点。柠檬香茅（Cymbopogon citratus Stapf)含有丰富的多糖、多酚、黄酮类及香茅精油。师静等5通过对巨菌草纤维素的酶解条件进行研究，发现巨菌草酶解后含有丰富的收稿日期：2 0 2 3-0 1-15修回日期：2 0 2 3-0 5-17基金项目：福建农林大学学科交叉融合专项（XKJC-712021030）；福建省科技计划重大专项（2 0 2 1NZ029009）；福建省自然资源厅专项资金项目（KKY22003XA）；福建省农业农村厅项目（KKY22001XA)作者简介：范锦琳（1990-），女，博士，研究方向为微生物学。*通讯作者：林占（1943-），男，研究员，本科，研究方向为菌草学。文章编号：0 2 54-50 7 1(2 0 2 3)0 8-0 0 52-0 6high throughput sequencing technologydoi:10.11882/j.issn.0254-5071.2023.08.009还原糖，可制备乙醇。童金华以巨菌草、柠檬香茅、紫花首等为主要原料，成功研制了菌草复合饮料。这些研究为巨菌草和柠檬香茅作为菌草酒的发酵原料提供了理论参考。范锦琳等采用巨菌草和柠檬香茅为酿造原料，以安琪白酒曲为糖化发酵剂，采用固态发酵法发酵，经过多次蒸馏后得到具有独特风味的菌草酒。我国白酒的发酵主要通过自然富集和混菌发酵，大量研究表明，自然发酵过程中复杂的自然菌群对成品酒的2023年第42 卷第8 期中国酿造研究报告酿造具有积极作用8-1。目前，针对发酵过程中菌草酒细菌菌群组成及变化鲜有研究。杨旭等12 采用高通量测序技术，探究大曲细菌菌群结构，发现细菌组成的差异性是导致白酒品质差异的主要原因之一。王春艳等13 运用高通量测序技术，研究宋河浓香型白酒不同窖龄窖泥细菌菌群结构，发现窖龄越久细菌菌落结构越复杂。可见微生物在白酒的酿造中发挥着极其重要的作用，不同菌群微生物在酿酒过程中的活动会影响白酒的品质14。因此，研究菌草酒发酵过程中的自然菌群，阐明其群落结构及组成，是后续深入研究菌草酒酒体特征形成机理的基础，对提高菌草酒的出酒率、改善菌草酒的品质至关重要115。高通量测序技术能够同时对几十万甚至几百万条脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）序列进行测定，具有精确性高、重复性好，无需建库、无克隆误差，速度快、测速时间短等优点，被广泛应用于酿酒微生物的研究16-2 0 。本研究首次利用高通量测序技术探究菌草酒酿造过程中细菌菌群的变化。通过探究菌草酒酿造过程中酒酷的细菌菌群结构变化，为建立菌草酒微生物信息数据库、探究后续菌草酒发酵机理、提升菌草酒品质提供科学依据。1材料与方法1.1 材料与试剂巨菌草、柠檬香茅：由福建农林大学旗山校区菌草中心基地提供；白酒曲：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：市售;Ezup柱式土壤基因组DNA抽提试剂盒：上海生工生物工程有限公司；无水乙醇：上海阿拉丁试剂有限公司；琼脂糖：西班牙BiowestAgarose公司DNAMarker：大连Takara公司；AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒：美国Axygen公司；Gengreen染料：上海赛百盛有限公司；引物：北京奥维森基因科技有限公司。本研究所用试剂均为分析纯或生化试剂。1.2仪器与设备IlluminaMiseqPE250高通量测序仪：美国Illumina公司；T100 Thermal Cycler聚合酶链式反应(polymerase chain re-action，PCR）仪：美国BIO-RAD公司；InvitrogenQubit3.0荧光计：美国Life公司；ZF-288凝胶成像系统：美国UVP公司。1.3方法1.3.1酒酷样品制备及预处理新鲜巨菌草、柠檬香茅经过清洗和切分，在发酵温度为2 9，初始糖度为2 4Bx，酒曲接种量为0.45g/L的条件下自然发酵30 d7。分别采集0、0.5d、1d、2 d、3d、5d、7 d、10d、15d、2 1d 和30 d的酒样品，标记为D0、D 0.5、D 1、D 2、D3、D 5、D 7、D 10、D 15、D 2 1和D30。在超净工作台上，从发酵罐的上、中、下层三个不同的位置分别取50 g酒酪，进行等量混匀为一个样品，并且置于无菌采样袋密封。样品采集后迅速置于盛有干冰的泡沫箱中快速冷冻，于-8 0 的低温环境中保存2 1。总第37 8 期1.3.2酒酷样品细菌菌群基因组DNA的提取、PCR扩增及高通量测序参照DNAKit基因组DNA抽提试剂盒说明书提取酒酷样品细菌菌群的基因组DNA,以其为模板,采用引物338 F(5-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3）和引物8 0 6 R（5-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)PCR扩增细菌菌群的16 SrDNAV3V4区基因序列。PCR扩增体系（50 L：10 xPCRbuffer5L，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonu-cleoside triphosphate,dNTP)(10 mmol/L)0.5 L,DNA 10 ng,上下游引物(50 mol/L)各0.5L,Plantium Taq(5U/L)0.5L,加双蒸水(ddH,O)到50 L。PC R 扩增参数:95预变性5min；9 5变性45s，55退火50 s，7 2 延伸45s，2 8 个循环；7 2 再延伸10 min。PC R 扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，Tris-HCI洗脱，2%琼脂糖电泳检测，凝胶成像观察。对所有DNA样本等量混合后，依托北京奥维森基因科技有限公司进行IluminaMiseq高通量测序。1.3.3数据分析使用FLASH(V1.2.7)和UCHIME Algorithm软件(http:/ 。通过Uparse软件(http:/ 9 7%阈值进行操作分类单元（operationaltaxonomicunit,OTU）聚类，利用RDPClassifier与GreenGene数据库对OTUs代表序列进行物种注释（值为0.8 1.0)2 42 5。利用PyNAST软件（V1.2)与GreenGene数据库中“Core Set数据信息进行多序列比对,得到所有OTUs代表序列的系统发生关系2 6 。基于每个样品的Alpha多样性指数分析，用稀释曲线、超1（Chao1)指数、香农（Shannon）指数等来评估样品中微生物群落的物种丰度和多样性2 7-2 8 。通过Beta多样性分析样品之间群落组成的相异性2 9。2结果与分析2.1高通量测序结果及Alpha多样性分析稀释曲线的变化趋势可以直观反映出测序数据量与鉴定得到物种数量的相关性，在一定程度上可以反映实验测序量是否能充分覆盖样品中的实际物种数量30-31。稀释曲线后期逐渐平稳，表明测序数据量已充分覆盖样品中的物种32 。各酒酪样品的稀释曲线见图1。由图1可知，11条稀释曲线在测序量达到2 0 0 0 0 条以后均趋向平坦，说明不同发酵时期酒酷样品测序数据量合理，包含了大多数菌群，能够比较真实地反映样本的微生物群落多样性。从11个酒酷样品中共注释到14个门、32 个纲、6 2 个目、8 9个科、117 个属。序列统计和Alpha多样性评估见表1。由表1可知，通过对测序所得的序列进行预处理，去除低质量序列和模糊序列，从不同发酵时期的11个酒酷样品中共得到40 6 0 8 0 条原始序列，过滤后得到38 2 0 48 条532023 Vol.42 No.854Serial No.378有效序列。11个酒酷样品文库的覆盖率均 99.7 0%，说明测序结果可以真实反映样本内的细菌实际存在情况。通过归类共得到1343个OTU。由表1亦可知，菌草酒发酵过程中细菌菌群微生物的Alpha多样性指数均呈波动式变化。OTUs和Chao1指数整体均呈发酵前期(0 7 d)发酵末期（1530 d)发酵中期（7 15d)的规律，且均在发酵10 d时最低。可能是由于发酵10 d时酒精度达到最高，许多微生物耐受力较弱，引起这些指标急剧下降33。发酵10 d后，这些指标呈缓慢上升趋势，可能与发酵环境中的氧气浓度、酒精度和有机酸含量的变化有关，导致菌群数量发生变化34。而细菌菌群的Shannon指数总体表现出发酵末期发酵中期 发酵前期的趋势。发酵2 d时Shannon指数最小，表明菌群多样性在发酵2 d时最小。菌草酒发酵过程中细菌菌群丰富度和多样性在发酵的前2 d呈下降趋势，发酵的第2 天到第7 天逐渐上升，第10 天又急剧下降，之后开始缓慢上升至趋于稳定。推测可能是由于发酵初期酒精度增加较快，抑制了部分微生物的生长繁殖，到发酵第2 天时大部分微生物逐渐适应同时开始缓慢生长35。结果表明，菌草酒发酵过程中细菌菌群在不断调整和平衡。15000图1不同发酵时期酒酷样品的稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves of fermented grains samples at differentfermentation periods表1各样本的测序数据、操作分类单元及多样性指数统计Table 1 Sequencing data,operational taxonomic units and diversityindex statistics of each sample样品原始序列数/有效序列数/覆盖率/OTU数/编号条DO30677DO.532767D149 187D244979D332627D528 474D733 893D1059582D1541 157D2124 249D3028 488China Brewing2.2菌草酒发酵过程酒细菌菌群结构分析2.2.1基于门水平菌草酒不同发酵过程酒酷细菌菌群结构分析基于门水平菌草酒不同发酵过程酒酪细菌菌群结构结果见图2。由图2 可知，从酒酪样品中共注释到14个细菌门，包括3个优势细菌门（平均相对丰度 1.0 0%），分别为厚壁菌门（Firmicutes）（39.48%）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）（38.96%）、变形菌门（Proteobacteria）（2 0.7 9%）。各酒醋样品中这3类细菌门的相对丰度之和均 98%，充分说明在门水平上，菌草酒不同发酵过程酒的细菌菌群结构具有稳定性。发酵前期主要以蓝藻菌门（Cyanobacteria)为绝对优势菌群，发酵中后期主要以厚壁菌门(Firmicutes）为绝对优势菌群。厚壁菌门（Firmicutes）随着发酵时间逐渐增加相对丰度整体呈增加趋势，其中发酵第0 天时相对丰度最低，为8.43%；发酵第10 天时相对丰度最高，为7 7.14%。蓝藻菌门(Cyanobacteria)相对丰度整体呈减少趋势，其中发酵第0 天时相对丰度最高，为7 2.10%，发酵第30 天时相对丰度最低，为2.7 7%。变形菌门(Proteobacteria）相对丰度变化幅度相对较小，相对丰度在10.59%31.0 4%之间浮动，表明发酵环境抑制其生长繁殖。10080Di5%60D1040201000020000序列数量/条ChaolShannon条%个指数指数2848899.773051099.834643099.844369699.863022599.8426 44599.863051799.855252999.954073999.9224 10599.952836499.96Research ReportFirmicutesCyanobacteriaProteobacteria-Other0DO D0.5 D1 D2 D3 D5 D7 D10 D15 D21 D30Other表示平均相对丰度 1.0 0%），分别为未知菌属（unidentified）（52.37%）、片球菌属（Pediococcus）（13.8 5%）、魏斯氏菌属（Weissella）（12.7 3%）、乳酸杆菌属(Lactobacillus）（9.6 6%）、乳球菌属（Lactococcus）（4.8 1%）、泛生菌属（Pantoea）（1.7 8%）、芽孢杆菌属（Bacillus）（1.53%），不同酒酷样品中优势细菌属的相对丰度之和为95.2 9%99.74%，而其他细菌属的相对丰度之和 5%。2023年第42 卷第8 期中国酿造研究报告100180%聘40200D0 D0.5 D1 D2 D3 D5 D7 D10 D15 D21 D30unidentified-Pantoea-Pediococcus-Bacillus-Weissellaa.-Phaseolusacutifoliusteparybean-Pseudomonas-Lactobacillus-Acinetobacter:Sphingomonas-Lactococcus-Cronobacter.OtherOther表示相对丰度 1%)为厚壁菌门(Firmi-cutes）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）和变形菌门（Proteobacte-ria），其在各样品中的对丰度总和均 9 8%。发酵前期主要以蓝藻菌门（Cyanobacteria)为绝对优势菌群，发酵中后期主要以厚壁菌门（Firmicutes）为绝对优势菌群。在属水平上，酒酷样品的优势细菌属（平均相对丰度 1%)为未知菌属(unidentified)（52.37%）、片球菌属（Pediococcus）（13.8 5%）、魏斯氏菌属（Weissella）（12.7 3%）、乳酸菌属（Lactobacillus）(9.66%）、乳球菌属（Lactococcus）（4.8 1%）、泛生菌属（Pan-toea）（1.7 8%）、芽孢杆菌（Bacillus）（1.53%）。其中，未知菌属（unidentified）、片球菌属（Pediococcus）和乳酸杆菌属(Lactobacillus)的相对丰度在发酵过程中存在较大差异，说China Brewing明细菌群落在发酵过程中具有不稳定性。片球菌属(Pedio-coccus）的相对丰度在发酵过程中整体呈先上升后下降的趋势。乳酸菌属（Lactobacillus)和乳球菌属（Lactococcus)在发酵中后期丰度较高，乳酸菌属（Lactobacillus)在发酵第10天和第2 1天相对丰度大幅升高，魏斯氏菌属（Weissella)与之相反。芽孢杆菌(Bacillus)丰度变化主要发生在发酵末期。PCA结果表明，发酵0 d和2 d的样品较为接近，发酵0.5d、1d、3d 和5d的样品较为接近，发酵7 2 1d的样品较为接近，发酵30 d的样品与其他样本较远，说明菌草酒细菌菌群在发酵过程中样本遗传距离具有明显的阶段性，且与发酵时间有关。本研究首次解析菌草酒发酵过程中细菌的菌群结构及其变化，为后续探究菌草酒的风味物质形成与微生物群落特征之间的关系提供一定的科学依据，为将来筛选菌草酒酿造的优势微生物菌株奠定基础，为菌草酒的现代化、规模化、标准化生产提供新思路和理论依据。参考文献：1林占.菌草学概论M.第3版.北京：中国农业出版社,2 0 19:1-3.2梅嘉沼,葛红柳,刘翠翠，等.菌草种质资源AFLP多样性分析.热带农业科学，2 0 17,37(11)：32-38.3丁铭，白璐，王龙清.巨菌草引进试验及栽培种植技术1.农村科技，2013(12):60-61.4谷瑶，朱永杰，周丽珠，等.柠檬香茅草总黄酮和多糖含量的测定应用化工,2 0 18,47(4)：8 46-8 48.5师静，林占嬉，林冬梅，等.巨菌草纤维素的酶解条件.草业科学，2014,31(4):760-765.6童金华.菌草复合饮料配方的研究.农产品加工，2 0 2 1,13:2 6-2 9,33.7范锦琳，张丽丽，张煜隆，等.菌草酒酿造工艺优化及其品质分析.福建农林大学学报（自然科学版），2 0 2 3，52（1）：98：10 5.8陈慧颖，李慧星，许彬，等.高通量测序研究浓香型酒醋的细菌菌群多样性及共变性.工业微生物，2 0 2 1,51(4)：35-43.9李欣,王彦华，林静怡，等.高通量测序技术分析酱香型白酒酒醋的微生物多样性.福建师范大学学报，2 0 17,33（1)：51-59.10刘雪婷，王子媛，刘继明，等.清香型白酒酒酪发酵菌株分离鉴定及细菌群落结构分析J.中国酿造，2 0 2 1,40（1)：39-43.11李凯敏，付桂明，吴酬飞，等.特香型白酒酿造过程中真核微生物菌群演替J.食品科学，2 0 17,38(2 2)：131-136.12杨旭，马歌丽，王光路，等.高通量测序分析原香型白酒高温大曲的细菌群落J.酿酒科技，2 0 2 0,3:14-17.13王春艳，宋建阳，吕慧鑫，等.基于高通量测序的宋河浓香型白酒不同窖龄窖泥细菌群落结构分析J.中国酿造，2 0 19,38(9)：16 3-16 6.14沈才萍，李德林，敖宗华，等.酒酪微生物的分子生物学研究.技术与市场，2 0 13,2 0(6)：40-42.15 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