“叶绿体色素提取与分离实验”化学原理释疑_李芳.pdf

*通信联系人,E-m a i l:z w g n a n k a i.e d u.c n“叶绿体色素提取与分离实验”化学原理释疑李 芳1 赵卫光2*(1.南开大学化学学院化学国家级实验教学示范中心 天津 3 0 0 0 7 1;2.南开大学化学学院元素有机化学研究所 天津 3 0 0 0 7 1)摘要 叶绿体色素提取与分离实验是我国高中生物学经典实验,教材中对色素分离原理的解释“绿叶中的色素都能溶解在层析液中,但不同的色素溶解度不同。溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快,反之则慢”与实验不符。教材中的解释是分配色谱原理,我们认为实验内容用吸附色谱原理解释更为合理。介绍了叶绿体色素分离和色谱技术的由来,并利用高中生物学和化学知识,对叶绿体中色素的分离原理进行深入的探讨,有助于教师和学生掌握色素分离的原理,并加深相关知识的理解。关键词 叶绿体 色素 分离 原理D O I:1 0.1 3 8 8 4/j.1 0 0 3-3 8 0 7 h x j y.2 0 2 2 0 2 0 0 4 6 叶绿体色素的提取和分离是一个非常有意思的科学实验,既可以作为科普实验,同时也是高中生物学的经典实验1和大学化学专业的基础实验2,其中涉及很多生物学和化学方面的基础知识。在中学生物学教材中对色素分离原理的解释是:“绿叶中的色素都能溶解在层析液中,但不同的色素溶解度不同。溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快,反之则慢”,我们认为这个解释与书中的实验细节不甚相符。通过查阅相关文献,发现关于叶绿体中色素提取和分离实验的报道很多3-6,但对于分离原理解释的文章很少。朱晓林7在 绿叶中色素分离原理的解析一文中在教材的基础上进行了探讨,我们认为并不十分准确。本文介绍了叶绿体色素分离和色谱技术的由来,并利用高中生物学和化学知识,对叶绿体中色素的分离原理进行深入的探讨,有助于教师和学生掌握色素分离的原理,并加深相关知识的理解,与同行共同探讨。1 叶绿体色素的分离和色谱技术的创立8-9茨维特(M i c h a e l S e m e n o v i c h T s w e t t,1 8 7 21 9 1 9)是俄国植物生理学家和化学家(图1)。1 9 0 3年3月2 1日,他在华沙举办的“自然科学学会生物学分会会议”上,以O n a N e w C a t e g e o r y o f A d s o r p t i o n P h e n o m e n a a n d T h e i r A p p i l c a t i o n t o B i o c h e m i c a l A n a l y s i s为题报告了他的发现:石油醚极易溶解离析态的叶绿素和相关的色素,却不能从植物叶中直接提取出这些色素,加入少量乙醇则很容易直接提取出植物叶中的色素。他认为这是F i g.1 M.S.T s w e t t图1 茨维特由于植物组织的吸附能力造成的,于是使用滤纸进行了验证,石油醚只能从沾有色素的滤纸上提取胡萝卜素,而不能提取叶绿素,加入少量乙醇则可以提取所有色素。茨维特于是推测某些粉末状物质,也可能具有类似的性质,并有可能建立一种以吸附为基础的分离物质的新方法。茨维特作报告的这一天后来被视作色谱法的诞生日。1 9 0 6年茨维特在 德国植物学报连续发表了 叶绿素的物理化学研究和 吸附分析与色谱法,详细描述了他创立的新方法以及在叶绿素化学上的应用。文中写道:“像光谱中的光线一样,色素混合物的不同组分有规律地排列在碳酸钙柱上而彼此分离(图2),由此可以进行定量和定性鉴定。我称这一制备为色谱图,相应的方法为色谱法(C h o r m a t o g r a p h y)”。随着科技的不断发展,该方法已被广泛地应用5112 0 2 3年第4 4卷第5期 化 学 教 育(中英文)(h t t p:/w w w.h x j y.c h e m s o c.o r g.c n)F i g.2 S c h e m a t i c d i a g r a m o f c h l o r o p h y l l e x t r a c t i o n图2 叶绿素提取示意图到工农业、化学、化工、医药卫生、环境保护和大气监测等各个方面,并衍生出吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等诸多形式,并可以与质谱等其他分析方法联用,是现代实验室中常用的分离、分析手段之一。虽然“色谱”名称中的“色”失去了原有的意义,但“色谱”这一名称沿用至今。2 吸附色谱的原理2.1 定义色谱法又称色层法或层析法,是一种物理化学分析方法,它利用不同溶质(样品)与固定相和流动相之间的作用力(分配、吸附、离子交换等)的差别,当两相做相对移动时,各溶质在两相间进行多次平衡,使各溶质达到相互分离。大学和中学教材中叶绿体中色素的分离就是经典的吸附色谱(图3)。吸附色谱的定义是利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离,吸附色谱的产生过程(图4)是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。中学生物教材中的实验使用的是干滤纸和无水有机层析液,从定义可知,教材中“溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快,反之则慢”的解释是有疑问的,色素是与滤纸的吸附中心直接作用,其分离的核心在于吸附,而与溶解度关系不大。吸附可以分为物理吸附、化学吸附和半化学吸附。其中化学吸附是指物质分子与固定相发生化学反应,可以用于反应除杂质,但不能洗脱分离,通常这是要竭力避免的。物理吸附又称表面吸附,是因构成溶液的分子(溶质和溶剂)与吸附剂表面分子的分子间力的相互作用所引起的,主要以范德华力体现。半化学吸附主要是以氢键的形式产生的吸附。高中化学 物质结构与性质一书“分子间F i g.3 S e p a r a t i o n e x p e r i m e n t o f c h l o r o p l a s t p i g m e n t i n h i g h s c h o o l图3 中学叶绿体色素分离实验F i g.4 S c h e m a t i c d i a g r a m o f a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y图4 吸附色谱示意图 的作用力”一节对范德华力和氢键作用进行了比较详细的解释1 0,分子间相互作用力的可逆性和大小的不同构成了吸附色谱的基础。2.2 吸附色谱三要素吸附色谱的三要素是吸附剂、溶质(被分离物)、溶剂。首先我们看吸附剂,高中生物学实验中的滤纸和大学化学实验用的层析硅胶就是吸附剂,也可以叫作固定相。我们知道,纸张的主要组成部分是纤维素(图5),纤维素是由D吡喃型葡萄糖基(失水葡萄糖)组成,其中包含了大量游离的羟基,因此纤维素分子可以和溶质、溶剂产生范德华力和氢键的相互作用。层析硅胶的主要成分是二氧化硅,表面存在着硅醇基团(S iOH)和暴露的硅氧烷键(S iOS i),硅醇基团是强吸附的极性基团,可以形成氢键;硅氧烷基团则几乎不吸附极性溶剂分子,但可以吸附某些非极性溶剂分子。然后我们看溶质,叶绿体里面的色素(图5)主要包括叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素、胡萝卜素和叶黄素。从这些色素的化学结构看,叶绿素a中包含2个酯基和1个羰基,这些基团都可以和纤维素分子的羟基形成氢键作用,因此与纤维素的吸附作用较强。叶绿素b比叶绿素a还多一个醛基,与纤维素有更强的结合能力。对于叶黄素来说,虽然也含有2个可以和纤维素分子的羟基形成氢键的羟基,与纤维素也具有较611化 学 教 育(中英文)(h t t p:/w w w.h x j y.c h e m s o c.o r g.c n)2 0 2 3年第4 4卷第5期F i g.5 S t r u c t u r a l f o r m u l a o f p i g m e n t i n c e l l u l o s e a n d c h l o r o p l a s t图5 纤维素和叶绿体中色素的结构式强的相互作用,但叶黄素的2个羟基则位于分子的两端,很难同时与纤维素分子的羟基形成氢键。和叶黄素相比,叶绿素不但所含的羰基更多,而且羰基和酯基相距较近,可以同时和纤维素分子的羟基形成多个氢键,因此叶绿素和纤维素分子吸附的能力更强。胡萝卜素和胡萝卜素的结构差异仅仅是双键的位置不同,都属于烷烃,不含氧、氮等可以形成氢键的原子,因此与纤维素的相互作用只能是范德华力,吸附能力最弱,并且2者的吸附能力差距微乎其微,在该实验中不能分离。最后我们再来看下溶剂,即流动相。在高中生物学实验中,采用的是石油醚、苯和乙醇。显然,石油醚作为小分子烷烃,和色素、纤维素只能形成范德华力,因此在茨维特的研究中,石油醚只能洗脱滤纸上的胡萝卜素。当在石油醚中加入少量的乙醇以后,乙醇的摩尔数远远高于脱叶绿素的摩尔数,可以和叶绿素上的氧形成氢键,破坏叶绿素和纤维素之间的氢键,从而将叶绿素从纤维素上解离下来。茨维特的这部分研究形象生动地展示了“分子间的作用力”,实验操作简便易行,非常适合作为高中化学这一章节的演示实验或操作实验。2.3 基本原理如图6所示,当溶剂通过虹吸作用向上移动时,各组分与流动相分子争夺吸附剂表面的活性中心,由于滤纸对样品中各色素的吸附能力不同,色素在溶剂的带动下逐渐向上移动的过程中,不断与F i g.6 S c h e m a t i c d i a g r a m o f a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n p r o c e s s图6 吸附色谱分离过程示意图纤维素分子进行吸附 解析 再吸附 再解析的反复循环,各组分向上运动的速度也因此不同,吸附作用小的组分被固定相滞留的时间短,能较快地向上移动,与吸附作用大的组分差距越来越大,从而实现宏观上的分离。从吸附色谱三要素的结构和相互之间的作用力分析,我们可以更好地理解叶绿素分离实验中色素带的顺序,如图3所示,色带的顺序从上到下依次为胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a和叶绿素b。3 产生误解的原因中学生物学教材中对于色素分离原理的解释可能源于分配色谱。分配色谱的原理是将液体均匀地涂渍在惰性物质(载体)表面上作为固定相,利用分离组分在固定相与流动相中的溶解度差别所造成的分配系数差别而被分离(图7)。分配色谱中常7112 0 2 3年第4 4卷第5期 化 学 教 育(中英文)(h t t p:/w w w.h x j y.c h e m s o c.o r g.c n)F i g.7 S c h e m a t i c d i a g r a m o f d i s t r i b u t i o n c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n p r o c e s s图7 分配色谱分离过程示意图用的载体包括硅胶、硅藻土和纤维素,而纤维素是纸色谱的常用载体。纸色谱法1 1原理较为复杂,通常按分配色谱进行解释,常用于多官能团或高极性的亲水化合物如醇类、羟基酸、氨基酸、糖类和黄酮类等化合物的分离检验。纸色谱法是指把一种溶剂固定在滤纸上,由于滤纸纤维对水有较强的亲和力,一般能吸附其自身质量2 2%的水,其中6%的水以氢键与纤维素牢固结合,一般认为吸附水和结合水都是固定相。被水饱和的有机相(如正丁醇乙醚水系统)为流动相。由于纸色谱中大量水的存在,溶质与纤维素之间的吸附作用极其微弱,当流动相从含有氨基酸样品的滤纸上流过时,氨基酸就在固定相与流动相之间连续进行分配,相当于连续萃取。由于胡萝卜素是不饱和烯烃,不溶于水(固定液),在流动相中有较大的溶解度,很容易被洗脱,叶绿素则恰恰相反。实验中滤纸并没有被水或固定液预先饱和,色素是与纤维素直接作用,而不是在纤维素吸附的固定液和层析液之间进行分配。对于吸附色谱来讲,为了保证分离效果,硅胶通常需要高温活化,以去除硅胶吸附的水分子,大学教材中使用的是干燥活化过的薄层层析硅胶板,因此大学和中学教材中的实验都应该属于吸附色谱,而不是分配色谱。中学生物教材中的解释应该是把分配色谱和吸附色谱混淆了,2者的区别就是流动相(展开剂)是否含有大量的水,含水是分配色谱,不含水是吸附色谱。吸附色谱和分配色谱在气相色谱仪和液相色谱仪中都有十分广泛的使用,也容易发生混淆,主要是根据色谱柱类型进行区分。对于气相色谱来讲,一般填充柱属于吸附色谱,毛细管柱属于分配色谱。不同类型毛细管柱会涂有不同类型的固定液体以适应不同物质的分离需求,毛细管柱的柱效远低于填充柱,但其普适性非常高,所需样品少,柱效的不足很容易通过增加柱长来解决,因此填充柱在气相色谱中的应用目前已经比较少见了。4 范德华力、分子的极性和相似相溶前文提到的范德华力1 2-1 3包括取向力、诱导力、色散力。取向力是由于极性分子1 4的电性分布不均匀,一端带正电,一端带负电,形成偶极,主要发生在极性分子与极性分子之间。诱导力是由于极性分子偶极所产生的电场对非极性分子产生影响,使非极性分子的电子云变形,在极性分子和非极性分子之间以及极性分子和极性分子之间都存在。色散力是由于正电荷重心和负电荷重心发生瞬时的不重合,从而产生瞬时偶极,所有分子或原子间都存在。一般来讲,组成和结构相似的分子,相对分子质量越大,范德华力越大;相对分子量相同或相近时,分子的极性越大,范德华力也越大,极性分子间的作用力大于非极性分子间的作用力。因此在叶绿体分离实验中,分离效果与吸附剂(滤纸)、层析液和色素分子3者之间的相互作用息息相关。通常来讲,流动相的极性越强,洗脱能力越强,反之亦然。被分离物质的极性越大,吸附越牢固,越难以洗脱。因此在选择色谱分离条件时,需要从吸附剂、被分离物质和层析液等3个方面综合考虑,选择合适的吸附剂和层析液。相似相溶原理1 5即“结构相似者可能互溶”,也可以用范德华力来解释。当2种不同的极性物质放在一起时,2种不同的分子间也存在很强的取向力,从而可以相溶;2种非极性物质放在一起时,仅有色散力相互作用,色散力非常弱,2种物质倾向于无序扩散,从而相溶;而极性分子之间的取向力远大于极性分子与非极性分子之间的诱导力和色散力,因此不能互溶。这里需要注意的是相似相溶的前提是分子量相近,例如水和甲醇、乙醇互溶,但和叔丁醇就不能互溶了。在我们的日常生活中,食醋是乙酸的水溶液,食用油也是脂肪酸,则完全不溶于水,而脂肪则完全是固体了。分子量越大沸点越高,也是范德华力在作怪。因此相似相溶原理在一定程度上也是可以判断层析液与被分离物质之间作用力大小的。回到我们上面所说的色素的分离,对于分配色谱来说,“溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快”的解释是合理的,我们可以很好地用溶解度、相似相溶原理,辅以范德华力来解释其原理;对于吸附色谱来讲,我们可以用氢键和范德华力来解释其原理。5 教学建议叶绿体中色素的分离是一个非常好的实验,取材811化 学 教 育(中英文)(h t t p:/w w w.h x j y.c h e m s o c.o r g.c n)2 0 2 3年第4 4卷第5期方便,操作简单,形象直观,比较容易使学生对于生物大分子与溶质、溶剂等小分子以及小分子之间氢键、范德华力等的相互作用有更为深入的了解,因此,建议在高中教学中作为生物学和化学教学的共同实验开展,从生物学和化学两方面进行讲解。同时建议增加滤纸吸附叶绿素后,用石油醚和乙醇分别洗脱胡萝卜素和叶绿素,这样可以更形象地解释氢键和范德华力,同时结合色谱法的发现历史,培养学生的观察能力、分析能力和基本的科学素养。另外,中学生物实验中选用乙醇、石油醚和苯作为层析液,建议用甲苯代替苯作为层析液使用。从前文的叙述中,我们可知,甲苯和苯的性质非常类似,完全可以替代苯1 6。而苯毒性极大,L D5 0为4 8 m g/k g(小鼠经皮),并且是一类致癌物。甲苯毒性较弱1 7,L D5 0为1 2 1 2 4 m g/k g(兔经皮),并且很容易在体内代谢。甲苯属于三类易制毒,不易购买,也可以选用二甲苯代替,调节层析液中二甲苯的比例以满足分离需要。6 结语叶绿体色素的提取和分离实验在大、中学实验教学中具有至关重要的地位,该实验不但可以使学生掌握天然产物的提取和分离的基本方法,而且可以通过深刻理解吸附色谱和分配色谱的基本原理使学生更好地理解并掌握分子间的相互作用等化学基本原理,提高学生运用基本原理解释实际问题的能力,真正地做到“知其然,知其所以然”。参 考 文 献1 朱正威,赵占良.普通高中教科书:分子与细胞(生物学必修1).北京:人民教育出版社,2 0 1 9:9 7-9 92 邱晓航,李一峻,韩杰,等.基础化学实验.2版.北京:科学出版社,2 0 2 1:2 0 9-2 1 03 杨一思,张龚,吴昊.化学教育,2 0 1 3,3 4(5):7 0-7 24 廖永梅.生物学教学,2 0 2 1,4 6(1 0):5 3-5 45 姚斓,董娜,郝立华,等.生物学教学,2 0 2 1,4 6(1 2):5 6-5 96 殷亚妮.生物学教学,2 0 1,4 4(9):4 6-4 87 朱晓林.生物学教学,2 0 2 1,4 6(1):7 0-7 18 张清建.自然辩证法通讯,1 9 9 9,(2):6 9-7 49 袁翰青.化学教育(中英文),1 9 8 1,2(1):4 91 0 王晶,郑长龙.普通高中教科书:物质结构与性质(化学选择性必修2).北京:人民教育出版社,2 0 2 0:5 5-5 91 1 刘玉琛,王壹,魏丽娜,等.化学教育(中英文),2 0 1 9,4 0(1 6):3 5-3 81 2 花书贵,季姣,单靖舒,等.大学化学,2 0 1 9(1):1 0 4-1 0 71 3 高杰,王磊.化学教育,2 0 1 4,3 5(7):1 0-1 21 4 郑军.化学教育(中英文)2 0 2 0,4 1(2 1):2 2-2 71 5 刘帅,邹国华,邓阳,等.化学教育(中英文),2 0 2 1,4 2(1 1):6 0-6 41 6 陈英水.中学生物学,2 0 1 2(6):4 8-4 91 7 范亚维,周启星.生态毒理学报,2 0 0 9(1):1 3 6-1 4 1E x p l a n a t i o n o f C h e m i c a l P r i n c i p l e o f“E x p e r i m e n t o n E x t r a c t i o n a n d S e p a r a t i o n o f C h l o r o p l a s t P i g m e n t”L I F a n g1 Z HA O W e i-G u a n g2*(1.N a t i o n a l D e m o n s t r a t i o n C e n t e r f o r E x p e r i m e n t a l C h e m i s t r y E d u c a t i o n,C o l l e g e o f C h e m i s t r y,N a n k a i U n i v e r s i t y,T i a n j i n 3 0 0 0 7 1,C h i n a;2.S t a t e K e y L a b o r a t o r y a n d I n s t i t u t e o f E l e m e n t o-O r g a n i c C h e m i s t r y,C o l l e g e o f C h e m i s t r y,N a n k a i U n i v e r s i t y,T i a n j i n 3 0 0 0 7 1,C h i n a)A b s t r a c t C h l o r o p l a s t p i g m e n t e x t r a c t i o n a n d s e p a r a t i o n e x p e r i m e n t i s a c l a s s i c b i o l o g y e x-p e r i m e n t i n s e n i o r h i g h s c h o o l i n C h i n a.T h e e x p l a n a t i o n o f t h e p r i n c i p l e o f p i g m e n t s e p a r a t i o n i n t h e t e x t b o o k i s i n c o n s i s t e n t w i t h t h e e x p e r i m e n t t h a t“t h e p i g m e n t s i n g r e e n l e a v e s c a n b e d i s-s o l v e d i n t h e c h r o m a t o g r a p h i c s o l u t i o n,b u t t h e s o l u b i l i t y o f d i f f e r e n t p i g m e n t s i s d i f f e r e n t.T h o s e w i t h h i g h s o l u b i l i t y d i f f u s e q u i c k l y w i t h t h e c h r o m a t o g r a p h i c s o l u t i o n o n t h e f i l t e r p a p e r,a n d v i c e v e r s a”.T h e e x p l a n a t i o n i n t h e t e x t b o o k i s t h e p r i n c i p l e o f d i s t r i b u t i o n c h r o m a t o g r a-p h y,b u t t h e a u t h o r b e l i e v e s t h a t i t i s m o r e r e a s o n a b l e t o e x p l a i n t h e e x p e r i m e n t a l c o n t e n t w i t h t h e p r i n c i p l e o f a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y.T h i s p a p e r i n t r o d u c e s t h e o r i g i n o f p i g m e n t s e p a r a-t i o n a n d c h r o m a t o g r a p h y t e c h n o l o g y,a n d m a k e s a n i n-d e p t h d i s c u s s i o n o n t h e s e p a r a t i o n p r i n c i-p l e o f p i g m e n t i n c h l o r o p l a s t b y u s i n g t h e k n o w l e d g e o f b i o l o g y a n d c h e m i s t r y i n s e n i o r h i g h s c h o o l,w h i c h w i l l h e l p t e a c h e r s a n d s t u d e n t s m a s t e r t h e p r i n c i p l e o f p i g m e n t s e p a r a t i o n a n d d e e p e n t h e u n d e r s t a n d i n g o f r e l e v a n t k n o w l e d g e.K e y w o r d s c h l o r o p l a s t;p i g m e n t;s e p a r a t i o n;p r i n c i p l e9112 0 2 3年第4 4卷第5期 化 学 教 育(中英文)(h t t p:/w w w.h x j y.c h e m s o c.o r g.c n)