微生物菌种保藏方法.ppt

微生物菌种保藏方法 1.1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。2.一般地，大多数菌种的保藏温度以5为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：菌种管棉塞经常容易发霉；菌株的遗传性状容易发生变异；反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；需要定期转种，工作量大；杂菌的污染机会较多。3.2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。4.3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种，如土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤（5克）置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基（以含水量为土壤最大持水量的60%为宜），然后高压灭菌。再将需保存的微生物进行大量接种，培养至菌丝能用肉眼确认的程度为止，移入干燥器中经短时间干燥或风干后密封，冷藏或室温保存。5砂土保存法：取清洁的砂，过60目筛去掉大砂粒，并用磁铁吸去砂中铁屑，再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗数次，干燥后，置于试管或安瓶管中保持23cm深，再经干热灭菌后，加入1ml菌种培养液，经充分混匀后，放入真空干燥器中，完全干燥后熔封保存。也可用二份洗净的砂（经HCl预处理）和一份贫瘠、过筛的黄土搀和后灭菌，再进行菌种保藏。6.硅胶保存法：以616目的无色硅胶代替砂子，干热灭菌后，加入菌液。加菌液时，由于硅胶的吸附热常使温度升高，因而需设法加以冷却。磁珠保存法：将菌液浸入素烧磁珠（或多孔玻璃珠）后再进行干燥保存的一种方法。在螺旋口试管中装入1/2管高的硅胶（或无水CaSO4），上铺玻璃棉，再放上1020粒磁珠，经干热灭菌后，接入菌悬液，最后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。本法对酵母菌很有效，特别适用于根瘤菌，可保存长达两年半时间。麸皮保存法：在麸皮内加入60%的水，经灭菌后接种培养，最后干燥保藏。纸片（滤纸）保存法：将灭菌纸片浸入培养液或菌悬液中，常压或减压干燥后，置于装有干燥剂的容器内进行保存。7.4、悬液保存法：即使微生物混悬于适当溶液中进行保存的方法。常用的有，蒸馏水保存法：适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌，将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。糖液保存法：适用于酵母菌，如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗处保存，可长达10年。除此之外，也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。8.5、寄主保存法：即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。6、冷冻保存法：适用于抗冻力强的微生物。这些微生物可在其菌体细胞外遭受冻结的情况下而不受损伤，而对其它大多数微生物而言，无论在细胞外冻结还是在细胞内冻结，都会对菌体造成损伤，因此当采用这种保藏方法时，应注意以下几点，要选择适于冷冻干燥的菌龄细胞；要选择适宜的培养基，因为某些微生物对冷冻的抵抗力，常随培养基成分的变化而显示出巨大差异；要选择合适的菌液浓度，通常菌液浓度越高，生存率越高，保存期也越长；最好在菌液内不添加电解质（如食盐等）；9.可在菌液内添加甘油等保护剂，以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象。同样，也可添加各种糖类、去纤维血液和脱脂牛乳等具有良好保护效果的溶剂，但对有些微生物而言，不加保护剂时更有效。原则上应尽快进行冷冻处理，但当加入保护剂时，可静置一段时间后再进行处理。就动物细胞而言，应在20范围内以1/min左右的速度缓慢降温，此后必须尽快降到贮藏温度；而对绝大多数微生物而言，则不必如此，如结构较为复杂的原虫则可在35范围内进行缓慢降温，而噬菌体则必需采用上述的二阶段法进行冷冻；10.若进行长期保存，则贮藏温度越低越好；取用冷冻保存的菌种时，应采取速融措施，即在3540温水中轻轻振荡使之迅速融解。而就厌氧菌来说，则应选择静置融化的措施。当冷冻菌融化后应尽量避免再次冷冻，否则菌体的存活率将显著下降。11.常用的冷冻保存法包括：低温冰箱保存法（20、50或85）：低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便，也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多，有些可添加保护剂。此外，也可用5mm的玻璃珠来吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器内，再放入低温冰箱内进行保存的。干冰保存法（70左右）：即将菌种管插入干冰内，再置于冰箱内进行冷冻保存。12.液氮保存法（196）：是适用范围最广的微生物保存法。其操作步骤如下：a、装安瓶管：使用尽量浓厚的菌体悬浮于含有适当防冻剂（保存霉菌不用防冻剂）的灭菌溶液中，将0.21ml的这种溶液分装于安瓶中，或在装有分散剂的安瓶中直接接种，或将菌丝体琼脂块直接悬浮于分散剂中。b、熔封安瓶管：若直接贮存于气相液氮中（150170）时，则不需熔封。c、检查安瓶管是否熔封良好：即在4下，将熔封安瓶管在适当的色素溶液中浸泡230分钟后，观察有无色素进入安瓶。d、缓慢冷却：将熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮气以约1/min的速度冷却至25左右，也可在2025的冰箱内缓慢冷却3060min。e、速冷：最后浸入液氮中快速冷却至196。13.