基于高通量测序解析UHT灭菌乳品质劣变关联微生物.pdf

20235139基于高通量测序解析 UHT 灭菌乳品质劣变关联微生物娄梦雪1,2，贺凯茹1,2，韩琦1,3，刘晓燕1,2，朴瑜琼1,2，刘至立1,3，臧健4，武俊瑞1,2,3（1.沈阳农业大学食品学院，沈阳 110866；2.辽宁省食品发酵技术工程研究中心，沈阳 110161；3.沈阳市微生物发酵技术创新重点实验室，沈阳 110866；4.沈阳农业大学 分析测试中心，沈阳 110866）摘要：针对超高温灭菌（ultra-high temperature treated，UHT）乳在货架期内出现的脂肪上浮、水乳分离、沉淀等品质劣变问题，利用高通量测序和生物信息学等技术方法，对大型乳企采集的 9 份在货架期内品质劣变的 UHT 乳和正常质量的 UHT 乳样品的理化指标、酶活性、微生物菌群进行了分析比较，并通过关联分析解析 UHT 灭菌乳品质劣变的关联微生物。结果表明：品质劣变 UHT 乳在理化指标、酶活性和微生物群分布方面与正常 UHT 乳有明显不同，假单胞杆菌、不动杆菌为品质劣变 UHT 乳中核心功能微生物且均属于常见的嗜冷菌，能够产生耐热酶，这可能是导致 UHT 乳腐败变质的主要原因。本研究为进一步解决 UHT 乳品质劣变问题提供了参考。关键词：超高温灭菌乳；品质劣变；微生物多样性；戴尔福特菌属；假单胞菌属；不动杆菌属中图分类号：TS252.42文献标识码：A文章编号：1001-2230(2023)10-0004-11doi:10.19827/j.issn1001-2230.2023.10.001Analysis of microorganisms associated with quality deterioration of UHTsterilized milk based on High-throughput sequencingLOU Mengxue1,2,HE Kairu1,2,HAN Qi1,3,LIU Xiaoyan1,2,PIAO Yuqiong1,2,LIU Zhili1,3,ZANG Jian4,WU Junrui1,2,3(1.College of Food Science,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China；Liaoning Engineering ResearchCenter of Food Fermentation Technology,Shenyang 110161,China；3.Shenyang Key Laboratory of Microbial Fermen原tation Technology Innovation,Shenyang 110866,China；4.Analytical and Testing Center,Shenyang Agricultural Univer原sity,Shenyang 110866,China)Abstract：In view of the quality problems of ultra-high temperature treated(UHT)milk,such as fat floating,slight precipitation and water emul原sion separation during the shelf life,high-throughput sequencing and bioinformatics were used to compare and analyze the quality characteristicsand microbial flora of 9 UHT milk samples with poor quality and normal quality during the shelf life collected by large dairy enterprises,and thecorrelation between them was studied.The results showed that the quality deterioration UHT milk was significantly different from the normalUHT milk in terms of physical and chemical indicators,enzyme activity and microbial population distribution.Pseudomonas and Acinetobacter werethe core functional microorganisms in the quality deterioration UHT milk and were common psychrophilic bacteria,which could produce ther原mostable enzymes,which may be the main cause of the spoilage of UHT milk.This study provides an important theoretical basis for completelysolving the problem of UHT milk quality deterioration.Key words：ultra-high temperature sterilized milk;quality deterioration;microbial diversity;Delftia;Pseudomonas;Acinetobacter0引言超高温灭菌（ultra-high temperature treated，UHT）乳因具有品质高、方便饮用等特点而在我国乳品行业广受欢迎，现已成为人们日常饮食中的重要角色1。目前 UHT 乳货架期虽然能够延长至 6 个月以上，但是某些环节控制不当仍会造成 UHT 乳在货架期内出现一些质量问题，如脂肪上浮、凝块、变味、褐变、坏包等2，影响产品价值甚至危害人体健康。在超高温灭菌乳的长期储存期间，影响其口感和感官质量的主要过程是蛋白质分解、脂肪分解、氧化和美拉德反应3。Caldera 等研究了来自不同食品的 66 个假单胞菌菌株的酶解腐败活性，发现在 UHT 乳中测得的蛋白质分解活性变化很大4。UHT 乳中残留的微生物也与乳品质密切相关，黄卫强等5采用 16S rDNA高通量测序技术比较了 2 个不同品牌 UHT 乳中的微生物多样性，通过对两份 UHT 牛乳样品进行高通量测序分析发现，两份 UHT 牛乳中的生物多样性丰度收稿日期：2023-01-16基金项目：国家自然科学基金面上项目(31871831；32172279)；宁夏自治区重点研发计划农业农村领域项目(2022BBF03021)；沈阳市科技创新平台项目(21-103-0-14；21-104-0-28)。作者简介：娄梦雪（2000-），女，硕士研究生，研究方向为乳制品。通讯作者：武俊瑞（1977-），男，教授，研究方向为发酵乳制品。Vol.51，No.10 2023(total 395)存在一定的差异，但差异不显著。张敏等6应用高通量测序技术分析了新疆 2 地区的 7 种乳制品，结果表明，牛奶的优势菌门是变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes），优势菌属是假单胞杆菌属（Pseu原domonas）。目前，高通量测序技术已经广泛用于分析生乳及巴氏杀菌乳中微生物群落组成，并用于确定有益和有害细菌的存在7，但研究品质正常 UHT 乳与品质劣变 UHT 乳的微生物多样性差异的研究较少。本研究以某大型乳品企业采集的 9 份在货架期内品质劣变和正常质量的 UHT 乳为研究对象，通过高通量测序和生物信息学等技术方法研究样品乳在质量特征、微生物群谱方面的差异及两者之间的相关性，为探索品质劣变问题产生的原因提供新的见解，并分析与 UHT 乳品质劣变等质量问题相关的核心微生物群。1 材料与方法1.1 材料与试剂UHT 乳来自于同一品牌的某大型乳企。产地 1、产地 2、产地 3 按照相同的工艺生产，每个产地分别采集 3 个批次的样品进行检测分析。产地 1 为正常产品乳（SZ1、SZ2、SZ3）、产地 2（WY1、WY2、WY3）和产地3（QY1、QY2、QY3）在货架期内观察到品质劣变现象，样品形态如图 1 所示。DNA 提取试剂盒，上海美吉生物有限公司；脂肪酶（LPS）活性检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。1.2 仪器与设备ALC-1100.2H-2050R 型超速冷冻离心机，湖南湘仪公司；2720 型 PCR 扩增仪，南京贝登电子商务有限公司；DYY-6C 型电泳仪，济宁市翰业机械设备有限公司；凝胶成像系统，上海勤翔科学仪器有限公司；电子 pH 计，湖南湘仪公司；Mastersizer 2000 纳米粒径电位分析仪，英国马尔文仪器有限公司；120 乳品综合成分指标分析仪，山东国康电子科技有限公司。1.3 实验方法1.3.1 色差的测定采用 pH 计和色差仪测定 9 份样品 pH 值及色泽，确定其亮度值（L*）、红绿值（a*）、黄蓝值（b*）。样品中的蛋白质、脂肪、非乳脂固体和乳糖采用乳品综合成分指标分析仪进行测定。每个样品都进行 3 次平行测试。1.3.2 酒精阳性乳的测定9 份样品分别取 5 mL，加入 5 mL 70%的酒精。若牛乳产生微细颗粒或絮状凝块，则可判定为酒精阳性乳。反之，则是非阳性乳。试验重复 3 次。1.3.3Zeta 电位的测定9 份样品分别取适当体积于烧杯中，去离子水稀释 1 000 倍，用 0.45 滋m 的微孔滤膜过滤后使用纳米粒径电位分析仪进行 3 次重复测定，取平均值。1.3.4 蛋白酶活性的测定通过福林酚法测定样品中的蛋白酶活性。具体步骤参见杨旭等8研究。UHT 乳中蛋白酶活力为：X=AKL/T式中：X 为样品的蛋白酶活力（U/mL）；A 为样品的吸光度；K 为吸光常数；L 为反应试剂的总体积；T为反应时间。1.3.5脂肪酶活性的测定使用脂肪酶活性检测试剂盒测定脂肪酶活力。计算公式：酶活力=x/Tm式中：x 为吸光度；T 为催化反应时间；m 为发酵液稀释倍数。1.3.6微生物学检测1.3.6.1 基因组 DNA 提取将 20 mL UHT 乳置于 20 mL 的离心管中。离心后去除乳脂层，再 12 000 g 离心 20 min 收集菌体沉淀。使用 DNA 提取试剂盒提取 UHT 乳样品中的细菌 DNA，并利用 1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。1.3.6.2PCR 扩增采用细菌 338F 和 806R 通用引物对 16S rDNA的 V3耀V4 可变区进行扩增，PCR 产物利用 2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。1.3.6.3荧光定量电泳及 Miseq 文库构建将 PCR 产物用荧光定量系统进行检测定量，根据每个样品的测序量进行相应比例的混合后，最后采用 Illumina 系统进行文库构建并测序。1.4 数据分析数据采用 SPSS 软件进行处理，P0.05 为差异显著。利用 Majorbio 云平台（）将样本的序列数据进行分离，以 97%相似度区分有效 OTU数目。基于 OTU 聚类分析结果，通过 alpha 多样性指数反映微生物群落的丰富度和多样性，包括一系列统计学分析指数 Sobs 和 Shannon。同时在 OTU 水平上进行 beta 多样性分析。基于分类学信息，在门和属分类水平上进行群落结构的统计分析，对样本的群落组成进行一系列深入的统计学和可视化分析。最后进行相关的热力图分析。2结果与讨论2.1UHT 乳样品的质量特性分析2.1.1色差值的测定结果利用色差仪对 9 份样品的颜色进行检测分析。其中 L*值表示亮度，L*值越大，代表样品越亮。由图 2可知，与正常 UHT 乳 SZ 相比，WY 和 QY2 亮度均显著性升高（P约0.05），QY1 和 QY3 亮度显著降低。牛乳的 L*值与牛乳的成分组成有关，光线的聚集程度决定牛乳的亮度，酪蛋白和脂肪球的分散则会对其造成图 1 样品形态Research Papers研究报告20235139影响9。由图 3、图 4 可知，品质劣变 UHT 乳的 a*和b*值与正常 UHT 乳的 a*和 b*值有统计学差异（P0.05）。品质劣变 UHT 乳的 a*绝对值明显下降，而 b*值明显上升，说明品质劣变 UHT 乳 WY 和 QY 在颜色上都发生了较大变化，并向黄褐色转变，如图 1。一些研究表明，b*值的增加与美拉德反应有关，它导致了牛乳颜色的变化10。2.1.2 pH 值测定结果由图 5 可知，样品的 pH 值为 6.536.78 之间，处于正常乳所要求的 pH 值（6.46.8）区域内，即样品均符合标准。品质劣变 UHT 乳与正常 UHT 乳相比有统计学差异（P0.05），pH 值都在一定程度上呈现下降趋势。Devi 等11也发现液态配方奶储存期间 pH 值呈下降趋势，推测是因为脂肪与氧气接触产生游离脂肪酸，从而使 pH 值下降。2.1.3 营养成分测定结果通过乳品成分分析仪对 UHT 乳中常规营养成分进行检测，结果如图 6 所示。从图 6 可以看出，品质劣变乳的基础营养物质含量与正常 UHT 乳相比，变化不显著。品质劣变乳的蛋白质和脂肪含量略有下降，推测是乳中存在尚具有一定活性的嗜冷菌能够产生耐热酶类物质，从而分解蛋白质和脂肪，最终影响 UHT 乳品质。图 2 亮度值测定结果图 3 红绿值测定结果图 4 黄蓝值测定结果图 5 样品的 pH 值测定结果图 6 常规营养成分测定结果Research Papers研究报告Vol.51，No.10 2023(total 395)表 3 脂肪酶活性测定结果样品编号脂肪酶活/（U/mL）SZ10.28依0.03cSZ20.27依0.02cdSZ30.25依0.01fWY10.26依0.01deWY20.24依0.02gWY30.28依0.01cQY10.34依0.01aQY20.26依0eQY30.31依0.01b注：不同的上标字母代表有统计学差异（P0.05）。表 2 蛋白酶活性的测定样品编号蛋白酶活/（U/mL）SZ18.494 0依0.0349fSZ29.890 0依0.0533dSZ39.094 0依0.2627eWY113.086 7依0.0882bWY214.378 3依0.1726aWY313.112 7依0.1214bQY19.068 3依0.1926eQY210.67 3依0.3056cQY310.059 7依0.0610d注：不同的上标字母代表有统计学差异（P0.05）。表 1 9 份样品乳的酒精阳性乳结果样品编号酒精阳性乳结果SZ1不是阳性乳SZ2不是阳性乳SZ3不是阳性乳WY1沉淀较多，是阳性乳WY2沉淀较多，是阳性乳WY3沉淀较多，是阳性乳QY1不是阳性乳QY2沉淀较少，是阳性乳QY3不是阳性乳2.1.4 酒精阳性乳测定结果将 70%酒精与 9 份样品 1颐1 混合，出现沉淀即为酒精阳性乳。由表 1 可知，品质劣变乳 WY 和 QY2 均出现酒精阳性乳现象。酒精阳性乳试验是检验蛋白质稳定性的重要指标，目前使用酒精试验主要目的是检测牛乳中蛋白质的热稳定性，而牛乳中的蛋白质 85%为酪蛋白。有研究表明，阳性结果的絮状沉淀物就是酪蛋白胶束的凝集物12，因此酪蛋白含量改变可能是引起品质劣变产品乳产生酒精阳性乳现象的原因。2.1.5 Zeta 电位测定结果表征牛乳体系稳定性的指标之一就是 Zeta 电位，牛乳的体系稳定性与 Zeta 电位的绝对值呈正相关。由图 7 可知，所有样品的 Zeta 电位值均为负数，且与正常 UHT 乳相比，品质劣变乳 WY1、WY2、WY3 和QY2 样品的 Zeta 电位绝对值较低，与正常产品乳具有统计学差异（P约0.05）。推测品质劣变 UHT 乳 Zeta电位绝对值降低，体系稳定性下降的原因是牛乳中乳糖分解产生乳酸，使得乳的酸度增加，从而导致体系电位不稳定。2.1.6 蛋白酶活性测定结果样品中的蛋白酶活性通过福林酚法测定，结果如表 2。品质劣变 UHT 乳 WY 与 QY2 的蛋白酶活性显著高于正常产品乳 SZ（P约0.05）。这表明品质劣变产品乳出现的原因可能与乳中残留的耐热蛋白酶相关，乳中的一些嗜冷菌会产生耐热蛋白酶，耐热酶经 UHT杀菌处理并不能完全失活，而未失活的耐热酶在货架期内分解乳蛋白质，从而造成蛋白沉淀现象。2.1.7 脂肪酶活性测定结果脂肪酶活性由脂肪酶活性检测试剂盒进行测定，结果如表 3。品质劣变乳 WY 和 QY2 与正常产品乳相比不具有显著差异（P跃0.05），而品质劣变乳 QY1 和QY3 的脂肪酶活性显著升高（P0.05）。这可能是由于嗜热菌产生的耐高温脂肪酶分解了牛乳脂肪球膜，并聚集成大分子脂肪球，导致 UHT 乳在货架期内出现脂肪上浮和脂肪氧化等异常现象。2.2 UHT 乳微生物学检测结果2.2.1 细菌 PCR 扩增结果PCR 产物经 2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测的电泳图如图 8 所示。由图 8 可知，8 份 UHT 乳样品细菌 16S V3-V4区在 750 bp 处扩增条带明显，可进行后续试验。此外，SZ3 样品 DNA 提取未成功。2.2.2 细菌的稀释曲线从每个样本中随机抽取一定数量的序列，统计该序列所代表的 OTU 数目，从而判断样本测序数据的合理性。由图 9 可知，当样品细菌菌落测序碱基量较小时，图 7 Zeta 电位测定结果图 8 8 份样品乳的 PCR 扩增电泳Research Papers研究报告20235139OTU 数目随着测序碱基量呈抛物线增长趋势迅速增加，当测序量达到 400 左右时，稀释曲线总体趋势增长缓慢并趋于平缓，说明测序数据量合理，序列数基本可以反映出每组样品中的菌群结构，满足了后续生物信息学分析的要求。2.2.3 Alpha 多样性指数分析Alpha 多样性指数与种类数目和个体均匀性有关，可以直接反映样品的丰富度和均匀度。Shannon 指数反映微生物群落多样性，Sobs 指数反映群落丰富度。由图 10 可知，与正常产品乳相比，品质劣变乳Shannon 指数显著降低，表明品质劣变乳中微生物多样性降低，其中 WY3 样品其 Shannon 指数最小，该样品中菌群的多样性最低。由图 11 可知，与正常产品乳相比，品质劣变乳 Sobs 指数也较低，表明品质劣变乳中菌群丰富度较低。与正常 UHT 乳相比，劣变产品乳中 Alpha 多样性低，可能是由于品质劣变乳中产生了某种优势菌株。同时，品质劣变乳 WY 样品与品质劣变乳 QY 样品相比，Shannon 指数和 Sobs 指数更低，微生物群落的丰富度及多样性都更低。2.2.4 样本 Beta 多样性指数分析2.2.4.1 基于 OTU 水平的样本层级聚类分析为研究不同产地 UHT 乳样本群落结构的相似度或差异性，利用聚类方法建立了样本层次聚类树，如图 12 所示，结果表明，产地 2 品质劣变乳 WY 样品可聚为一个分支，说明产地 2 样品组间差异较小。产地 3品质劣变乳与产地 1 正常产品乳 SZ1 和 SZ2 可聚为一个分支，说明产地 3 品质劣变乳与正常产品乳物种间群落结构相似，从样品形态图中也可以看出产地 3品质劣变乳要优于产地 2，推测产地 3 出现品质劣变时间尚短，物种间群落结构还未发生较大变化，因此会与正常产品乳聚为一个分支。2.2.4.2 基于 OTU 水平的 PCA 分析图 13 为不同产地 UHT 乳 OTU 水平的 PCA 分析图。PCA 的两个成分（F1 和 F2）解释了总方差的98.03%，F1 和 F2 分别解释了 92.35%和 5.68%。根据OTU 水平的 PCA 聚类分析，劣变乳 WY 聚类在一起，组内样本点分布较聚集，与层次聚类分析结果相似。同时，品质劣变乳 WY 与正常产品乳 SZ1 和 SZ2间距离较远，说明样品间微生物群落结构差异较大。而品质劣变乳 QY 与正常产品乳 SZ1 间距离较近，微生物群落结构相似；与 SZ2 距离较远，微生物群落结构有较大差异。图 9 Alpha 多样性指数稀释图 10 Shannon 指数 alpha 多样性分析图 11 Sobs 指数 alpha 多样性分析树枝间的长度代表样本间的距离图 12 8 份样品的层级聚类分析图 13 样品乳的 PCA 分析横、纵坐标表示两个选定的主成分，无实际意义。样本点的距离远近表明物种组成的相似度Research Papers研究报告Vol.51，No.10 2023(total 395)2.2.5 门水平的细菌群落结构组成将测序所得序列与数据库进行比对，解析 UHT乳中具体微生物组成，门水平相对丰度分析如图 14所示，结果表明，UHT 乳样品中主要菌群为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）；这和黄卫强等研究发现 UHT 乳基于门水平的微生物结构组成的结果相似5。我们的研究结果确定了主要的 4 个细菌门，主导着 UHT 乳的微生物群落。品质劣变乳与正常UHT 乳在门水平组成上相似，各样品间的优势菌门基本相同，但相对丰度存在一定的差异。8 个 UHT 乳样品的优势菌门均为变形菌门（Proteobacteria），含量约为90%以上，其中 SZ2 中变形菌门（Proteobacteria）含量稍低，约为 81%。此外，品质劣变乳中，产地 2 的 WY样品与 QY2 样品组成及含量上接近；QY1 与 QY3 中变形菌门（Proteobacteria）含量相较于 QY2 和产地 2 样品低一些，但厚壁菌门（Firmicutes）含量稍高。2.2.6 属水平的细菌群落结构组成由于 16S 测序结果在属水平上最为准确，所以将门水平结果进一步整理，对属分类水平进行鉴定，得到结果如图 15 所示。由图 15 可知，在属水平上，戴尔福特菌属在各个UHT 乳样品中占比超过 61%以上，为各个样品的优势菌属，这与唐振华13检测水牛乳属水平细菌多样性的研究结果相同。品质劣变乳 WY 样品中微生物多样性相对较低，群落组成高度集中在戴尔福特菌属上，约 91%以上为戴尔福特菌属。而正常 UHT 乳的微生物群落均匀性相对较高，戴尔福特菌 属占比 为73.54%、61.73%，不动杆菌属占比为 15.26%、15.09%。品质劣变乳 WY 样品与正常 UHT 乳样品间属分类水平差异较大。同时，与正常 UHT 乳相比，品质劣变乳QY 样品在属水平的微生物组成上差异较小；QY 样品戴尔福特菌属占比为 82.22%、75.53%和 70.30%，不动杆菌属占比为 8.16%、19.93%和 16.49%。Douglas 等14在提取母乳微生物组 DNA 方法的研究中发现，戴尔福特菌属（Delftia）为乳 16S rDNA测序检测中常检出的微生物。此外，戴尔福特菌广泛分布于环境中，从污染土壤和废水中均可检出15-16。因此推测戴尔福特菌的高丰度出现的原因有两种，一种是戴尔福特菌为低生物量样本中的试剂污染物，来源于提取试剂盒，另一种是原料乳被牧场环境中的灰尘水体等污染，从而导致戴尔福特菌的存在。为了排查其他可能导致 UHT 乳品质劣变的微生物的存在，对UHT 乳中其他低丰度细菌进行进一步分析，结果如图 16。图 14 8 份样品门水平上的细菌群落结构组成图 15 8 份样品属水平上的细菌群落结构组成图 168 份样品属水平上的细菌群落结构组成（除戴尔福特菌属外）Research Papers研究报告20235139表 4 品质劣变乳中特有的部分微生物微生物属名中文名称OTU 数WY1WY2WY3QY1QY2QY3Subdoligranulum罕见小球菌属23-203Snodgrassella斯诺德格拉斯菌属524-59-Lactobacillus乳酸杆菌属160-Serratia沙雷氏菌属-911559Monoglobus单球菌8-27Caldilineaceae暖蝇菌属-2237Anoxybacillus厌氧芽孢杆菌属-503670Sporacetigenium孢子菌属1621-Bombiscardovia-43-12-Clostridium梭菌属221283-Anaerococcus厌氧球菌属-17-Roseiflexaceae绿弯菌属-11-Bacteroides拟杆菌属-14-Kapabacteriales卡帕杆菌属-14-Clostridia UCG-014梭菌属-34-Unclassified Bacteroidia拟杆菌属-25-Sporolactobacillus芽孢乳杆菌属51-46Persicitalea微杆菌属-26-Caproiciproducens己酸菌属-29-Ilumatobacteraceae发光杆菌属-12-Gilliamella吉列姆菌属63267-Chitinophagaceae-1702262366-24Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia伯克氏菌属8-2-715与正常 UHT 乳相比，品质劣变乳 WY 样品中优势菌属为假单胞菌属（Pseudomonas），为正常 UHT 乳样品的 5耀10 倍。此外，品质劣变乳 QY 样品也检测出假单胞菌属，与正常 UHT 乳样品间丰度差异较小。研究表明，假单胞菌属为乳中常见嗜冷菌，能够分泌耐热蛋白酶和脂肪酶17，UHT 处理后仍保持一定的酶活性，会导致乳品产生苦味甚至腐败变质7。品质劣变乳 QY 样品和正常 UHT 乳样品 SZ1 和 SZ2 的优势菌属均为不动杆菌属（Acinetobacter），为乳中常见的嗜冷菌属，低温保藏下也能生长，并产生耐热脂肪酶，造成脂肪上浮现象18，其中 QY2 样品中不动杆菌属丰度较高，约为正常 UHT 样品的 1.6 倍。此外，链球菌（Streptococcus）也是主要菌属，在正常 UHT 乳样品中丰度相似。同时，以 OTU 水平将品质劣变乳与正常 UHT乳进行对比分析，对品质劣变乳中特有的部分微生物进行提炼，结果如表 4 所示。与产地 1 正常 UHT 乳中微生物属种相比，选出产地 2 和产地 3 品质劣变乳中差异明显的特有微生物菌属共 23 种。产地 2 劣变产品乳中特有的斯诺德格拉斯菌属（Snodgrassella）、吉列姆菌属（Gilliamel原la）、Bombiscardovia 和孢子菌属（Sporacetigenium）均为蜜蜂肠道中的常见菌种或蜜蜂共生细菌19-20，推测产Research Papers研究报告Vol.51，No.10 2023(total 395)地 2 品质劣变乳可能受到昆虫污染。产地 3 品质劣变乳中，沙雷氏菌属（Serratia）和厌氧芽孢杆菌属（Anoxy原bacillus）为特有菌属；沙雷氏菌属为乳中常见嗜冷菌和致病菌，其胞外酶可以水解脂肪和蛋白质21-22；而厌氧芽孢杆菌属则是乳品工厂的废水中常检测到的优势菌23。2.3 与品质劣变 UHT 乳的质量特性相关的核心微生物群2.3.1 UHT 乳中微生物群落组成和理化特性之间的相关性利用相关热图分析了 UHT 奶中微生物群落组成和理化特性之间的相关性，如图 17。结果显示，样品的脂肪和蛋白质含量与微生物细菌群落有明显的相关性（P0.05）。一些细菌，如吉列姆菌（Gilliamella）、拉尔斯通尼亚菌（Ralstonia）和嗜酸菌（Acidovorax），与乳糖、脂肪和蛋白质的丰度表现出显著的正相关关系。此外，假单胞菌（WY 样品）、链球菌和不动杆菌（QY 样品）显著参与了 UHT 牛奶的多种理化性质。例如，假单胞菌与脂肪、蛋白质显示出明显的正相关关系。链球菌与 L*值、Zeta 电位呈负相关。这进一步说明，微生物的功能特征促进了糖类的代谢、蛋白质的分解和重要代谢物的产生7。（a）Research Papers研究报告20235139图 17 微生物与理化指标相关性热图2.3.2UHT 乳中微生物群落组成和酶活性之间的相关性品质劣变 UHT 乳（WY 和 QY）受到耐热蛋白酶和脂肪酶的影响，我们进一步分析了牛奶中的微生物属与酶活性之间的相关性。根据结果可以看出，大多数菌属在蛋白酶和脂肪酶含量上呈现相反的趋势如图 18 所示。例如，梭状芽孢杆菌（Clostridium）和拉尔斯通尼亚菌（Ralstonia）与蛋白酶含量呈显著正相关（P0.05），与脂肪酶含量呈负相关。此外，作为 QY 样品中的核心微生物，不动杆菌与脂肪酶活性呈正相关，与蛋白酶活性呈负相关，这也与之前测定的酶活性相符。研究表明，不动杆菌属是一种常见的导致牛奶中甜凝缺陷/苦奶油的病原体24，是常见产耐热酶的嗜冷菌，其大量繁殖会影响乳成分，导致腐败变质。然而，假单胞菌作为 WY 样品中的主要细菌属，与脂肪酶活性呈负相关，与蛋白酶呈正相关。Dina Raats 等25采用 DGGE技术分析，结果表明，乳中的嗜冷菌占主要比例的菌群均为假单胞菌属。研究表明，假单胞菌属约占低温保存的生牛乳微生物总量的 70%耀90%26。假单胞菌属的丰度主要是受其蛋白水解酶活性和耐低温特性影响，在巴氏杀菌甚至 UHT 处理后仍保持活性27，是造成牛奶腐败变质和货架期缩短的主要原因28。（b）Research Papers研究报告Vol.51，No.10 2023(total 395)3结论本文探讨了同一品牌正常 UHT 乳（SZ）和品质劣变 UHT 乳（WY、QY）的质量特性和微生物分布，并研究了它们之间的相关性。结果表明，品质劣变UHT 乳在理化指标、酶活性和微生物群分布方面与正常 UHT 乳有明显不同。并且假单胞菌和不动杆菌被确定为核心功能微生物，显著地参与并影响了UHT 乳的质量特性，这些菌产生的耐热酶类物质，能够分解蛋白质和脂肪，从而影响 UHT 乳品质。此外，发现假单胞菌的丰度在品质劣变 UHT 乳（WY）中明显增加，并与耐热蛋白酶含量呈明显的正相关，而品质劣变 UHT 乳核心微生物不动杆菌与耐热脂肪酶活性呈正相关。但对假单胞菌、不动杆菌产酶特性和作用机制没有进行深入的研究，以及戴尔福特菌属是否也是产酶的关键菌株同样需要进行进一步的试验。参 考 文 献：1 闫志国.UHT 乳生产工艺及其在贮藏期间理化性质的变化J.乳业科学与技术,2011,34(3):114-117.2 岳静,朱志成,张敏慧.UHT 灭菌乳在不同保藏条件下品质的变化J.食品工业,2014,35(1):174-176.3 贾凌云,胡志和,程凯丽,等.基于 Arrhenius 模型预测无乳糖超高温乳的货架期J.食品工业科技,2020,41(19):232-239.4 L CALDERA,L FRANZETTI,E VAN COILLIE,et al.Identification,enzymatic spoilage characterization and proteolytic activity quantificationof Pseudomonas spp.isolated from different foodsJ.Food Microbiology,2016,54:142-153.5 黄卫强,张家超,张和平.应用宏基因组测序技术检测 UHT 牛乳中的微生物J.中国乳品工业,2015,43(7):55-58.6 张敏,张艳,黄丽丽，等.基于 16S rDNA 高通量测序方法比较新疆西北部地区乳品中微生物的多样性J.食品科学,2017,38(20):27-33.7 DING R,LIU Y,YANG S,et al.High-throughput sequencing pro原vides new insights into the roles and implications of core microbiotapresent in pasteurized milkJ.Food Research International,2020,137:109586.8 杨旭,屈小玄,郭庆贺,等.牛奶中蛋白酶活力测定的方法比较J.中国乳品工业,2014,42(6):48-51.9 NORIKO MISAWA,DAVID M BARBANO,MARYANNE DRAKE.图 18 微生物与酶活力相关性热图Research Papers研究报告20235139Influence of casein as a percentage of trueprotein and protein level on col原or and textureof milks containing 1 and 2%fat 1J.Journal of Dairy Sci原ence,2016,99(7):5284-5304.10 ANNE VUHOLM SUNDS,VALENTIN MAXIMILIAN RAUH,JOHN S RENSEN,et al.Maillard reaction progress in UHT milkduring storage at different temperature levels and cyclesJ.InternationalDairy Journal,2018,77:56-64.11 ANASTASIA FITRIA DEVI,ROMAN BUCKOW,TANOJ SINGH,et al.Colour change and proteolysis of skim milk during high pressurethermal-processingJ.Journalof Food Engineering,2015,147:102-110.12 葛鑫,张瑞华,夏青.奶牛酒精阳性乳的发生机理研究进展J.上海畜牧兽医通讯,2019(1):13-17.13 唐振华,李开坤,谢芳,等.基于高通量测序技术分析患乳腺炎水牛生乳中的细菌多样性J.中国乳品工业,2020,48(12):10-15.14 DOUGLAS C A,IVEY K L,PAPANICOLAS L E,et al.DNA extrac原tion approaches substantially influence the assessment of the humanbreast milk microbiomeJ.Scientific reports,2020,10(1):123.15 RUPA RANI,VIPIN KUMAR,PRATISHTHA GUPTA,et al.Ef原fect of endosulfan tolerant bacterial isolates(Delftia lacustris IITISM30 andKlebsiella aerogenes IITISM42)with Helianthus annuus on remediation ofendosulfan from contaminated soilJ.Ecotoxicology and EnvironmentalSafety,2019,168:315-323.16 STOLZE Y,EIKMEYER F,WIBBERG D,et al.IncP-1plasmidsof Comamonas sp.and Delftia sp.strains isolated from a wastewater treat原ment plant mediate resistance to and decolorization of the triphenyl原methane dye crystal violetJ.Microbiology,2012,158(8):2060-2072