什么是感受态及其他问题.doc

1.什么是感受态？
细菌处于0℃，0.1M CaCl2低渗溶液中，使菌细胞膨胀成球形，处于容易吸收外源DNA的状态，该状态称为感受态。
2. 什么是转化？
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
3. 什么是质粒？
独立于染色体之外的共价闭合环状DNA。
4. 什么是基因重组？
从广义上讲,任何造成基因型变化的基因交流过程,都叫做基因重组。而狭义的基因重组仅指涉及DNA分子内断裂—复合的基因交流。
5.冷冻离心机的使用及注意事项
(1) 开机设定：为了减少仪器的损耗，设定的加速度和减速度要低，最好设为3。
(2 )温度：开机后可以先2500rpm空转，直到达到设定温度为止。
(3) 开盖：尽量缩短开盖时间，因为时间太长，一方面使离心机内温度升高较大，另一方面也会增加离心机内的水汽凝结，加重了离心机的损耗。
(4) 上转子：上转子时切忌用力过大，上的过紧，如果很紧的话会造成缓冲环的损耗。
(5) 平衡：现在的冷冻离心机都有自动平衡功能，但是还是要平衡的，这样可以延长离心机的寿命。
(6) 放离心管：一定要对称放置，尤其是1.5ml的管子离心时，因为这种转子样品孔很多，容易放错。
(7) 转速的设定：离心机都有最高转速限制，不通转子的最高转速不一样，转子越小最高转速越高，注意不要超过最高转速。
(8) 善后工作：离心完毕后一定要把离心机的转子卸下来，擦干离心机里的水滴，然后在关机。电动机的轴承加注润滑脂；检查整流子和电刷的磨损情况，有磨损过度的应立即更换。
6.移液器的使用及注意事项
(1)吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气。
(2)为获得较高的精度，吸头需预先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时，吸头内壁会残留一层”液膜”，造成排液量偏小而产生误差。
(3)浓度和粘度大的液体，会产生误差，为消除其误差的补偿量，可由试验确定，补偿量可用调节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。
(4)可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法，来校正取液器，1mL 蒸馏水20℃时重0.9982g.
(5)移液器反复撞击吸头来上紧的方法是非常不可取的，长期操作会使内部零件松散而损坏移液器。
(6)移液器未装吸头时，切莫移液。
所设量程在移液器量程范围内不要将按钮旋出量程，否则会卡住机械装置，损坏了移液器。 数字清清楚楚在显示窗中， 旋转到所需量程 (7)在设置量程时，请注意
(8)移液器严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体（如浓酸、浓碱、有机物等）。
(9)严禁使用移液器吹打混匀液体。
(10)不要用大量程的移液器移取小体积的液体，以免影响准确度。同时，如果需要移取量程范围以外较大量的液体，请使用移液管进行操作
7.转化率及转化总数的计算
统计每个培养皿中的菌落数。
　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
　　转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)
　　感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
8. 简述影响转化效率的因素
提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：
　　(1). 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
　　(2). 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
　　(3). 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
　　(4). 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
9.碱性裂解法提取质粒DNA的基本原理
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
10.质粒有几种构型，转化率如何？
细菌质粒DNA有可以相互转化的3种不同构型，即线状、环状、超螺旋。微生物常常通过质粒倡导从而在自然条件下发生基因重组，常见的方式有：接合、传导、转化。超螺旋转化率最高。
11. 加入溶液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的目的和作用？
碱裂解法提取质粒DNA的基本原理是溶液I使细胞悬浮，并且EDTA可以与Ca2+和Mg2+螯合，抑制DNase的活性；溶液II裂解细菌，变性蛋白质和少量质粒；溶液III使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀，质粒DNA复性。
12.酶切的基本原理
限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。
13. 影响酶切效果的主要因素
（1）内切酶
（2）ＤＮＡ
（3）反应缓冲液
（4）酶解温度与时间
14.酶切时的注意事项
（1）浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。
（2）购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。
（3）尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。
（4）通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。
（5）注意星号酶切活力。
15.琼脂糖凝胶电泳检测DNA的基本原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。
16.溴化乙锭对DNA染色的原理及注意事项
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。
溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。
17.电洗脱法回收凝胶中的DNA的基本原理
将电泳分离后含目的ＤＮＡ片段的琼脂糖切割下来， 装于透析袋中，继续在高电压下电泳，这时目的ＤＮＡ会从凝胶中电泳出进入透析袋中， 由于ＤＮＡ分子量大，不能透过透析袋，从而保留于透析袋中。
取出透析袋中含ＤＮＡ的溶液， 进一步用酚、氯仿抽提纯化。
18为什么电泳结束时要反向电压,电洗脱后的ＤＮＡ如何去除ＥＢ？
电洗脱法回收凝胶中的DNA时在电泳结束时反向电泳1分钟，目的是使附着于透析袋上的DNA存在于透析袋中的电泳液中。电洗脱后的ＤＮＡ 去除ＥＢ主要是采用酚、氯仿抽提纯化。
19.DNA片断回收过程中的注意事项
（1）透析袋的处理
（2）切胶时要尽可能的贴近DNA
（3）尽可能的排完透析袋中的空气
（4）透析袋水平放入电泳槽（长度方向与电泳平行）， 加入适量缓冲液将透析袋浸没
（5）电泳结束时要反向电泳1分钟左右
20.植物基因组DNA提取的原理
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
21.细胞提取液中包含的溶液及作用
细胞提取液:
1. 100mmol/L Tris.HCL pH8.0 （缓冲液，保护DNA）
5mmol/L EDTA pH8.0 （离子螯合剂，保护DNA）
500mmol/L NaCl
1.25% SDS （表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来）
1mol/L β巯基乙醇 （抗氧化剂以降低植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响）
2. 5mol/L KCl （高盐环境，利于DNA沉淀）
22.PCR扩增基因的基本原理
原理类似于DNA的天然复制过程。人工合成与待扩增的DNA片段的两翼相互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，可将目的DNA扩增上百万倍。3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增10 6-10 9倍。
23.外源基因在大肠杆菌中的诱导表达的实验原理
将外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代—B—D—半乳糖)，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。
24. 重组子鉴定的方法
（1）利用抗生素初步筛选
（2）利用蓝白反应初步筛选
（3）酶切方法
（4）PCR方法
（5）测序方法
其中方法1，2方便快捷，但假阳性较高；方法3，4是常规方法，也存在假阳性；方法5最可靠，但费用较高。
25. 简述蓝白筛选的原理
许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸编码区。这个编码区中插入一个多克隆位点。受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当无外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷酶表达， 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色不同而区分重组子和非重组子