南京林业大学酶工程期末考试重点生物技术专业.doc

1、 酶的特点和米氏方程式的推导。酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。酶催化作用特点：（一）酶和一般催化剂的共性：用量少而催化效率高；不改变化学反应的平衡点；可降低反应的活化能。（二）酶作为生物催化剂的特点：用量少而催化效率高；专一性高；反应条件温和；可调节性。2、米氏常数的测定和意义。答：测定：基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。意义：当v=Vmax/2时，Km=s(Km的单位为浓度单位)。是酶在一定条件下的特征物理常数，通过测定Km的数值，可鉴别酶。可近似表示酶和底物亲和力，Km愈小，E对S的亲和力愈大；Km愈大，E对S的亲和力愈小。在已知Km的情况下，应用米氏方程可计算任意S时的V，或任意V下的S（用Km的倍数表示）。3、可逆抑制的种类和判别。答：竞争性抑制：某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。特点：Km变大，酶促反应速度减小；非竞争性抑制：酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。特点：Km虽然不变，但由于Vmax减小，所以酶促反应速度也下降了；反竞争性抑制：抑制剂仅能与酶底物复合物结合，但ESI不能转化为产物P 。特点：Km变小，Vmax减小，斜率不变。4、酶的分类和命名。答：分类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶。系统名：包括所有底物的名称和反应类型。推荐名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。酶系统编号：采用四码编号方法，第一个号码表示该酶属于6大类酶中的某一大类，第二个号码表示该酶属于该大类中的某一亚类，第三个号码表示属于亚类中的某一小类，第四个号码表示这一具体的酶在该小类中的序号。每个号码之间用圆点（）分开。5、酶活单位和酶活测定。答：酶活单位：酶活单位U：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。（浓度/时间）国际酶活力单位IU：在最适条件下，每分钟内催化1umol底物转化为产物所需的酶量。1972年定为1kat单位：每秒钟能催化1mol底物转化为产物所需的酶量。1kat=60106IU。酶的比活力：用每mg蛋白质所含酶活力单位数，比活愈大，纯度愈高。比活力酶活力U/mgPr总活力U/总蛋白mg酶活力测定的步骤：根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成溶液。根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度PH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，反应时间。运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。注意：若不能即时测出结果的，则要及时终止反应，然后再测定。6、酶活性中心的定义和部位。答：酶活性中心：酶的特殊催化能力只局限在大分子的一定区域，也就是说，只有少数特异的氨基酸残基参与底部结合及催化作用。这些特异的氨基酸残基比较集中的区域，即与酶活力直接相关的区域，称为酶的活性部位或活性中心。活性部位：通常分为结合部位和催化部位，前者负责与底物的结合，决定酶的专一性；后者负责催化底物键的断裂形成新键，决定酶的催化能力。对需要辅酶的酶来说，辅酶分子或辅酶分子上的某一部分结构，往往也是酶活性部分组成部分。7、影响酶催化作用的有关因素。答：底物浓度：在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征；当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。PH：在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性,通常称此pH 为最适 pH；pH稳定性。温度：一方面是温度升高,酶促反应速度加快；另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失；因此大多数酶都有一个最适温度。 在最适温度条件下,反应速度最大。酶浓度：在一个反应体系中，当SE反应速率随酶浓度的增加而增加（v=kE）,这是酶活测定的基础之一。抑制剂；激活剂。8、影响酶催化效率的有关因素答：（一） 底物和酶的邻近效应与定向效应：酶和底物复合物的形成过程既是专一性的识别过程，更重要的是分子间反应变为分子内反应的过程。这一过程包括：邻近效应和定向效应。邻近效应是指酶与底物结合形成中间复合物后，使底物和底物（如双分子反应）之间，酶的催化基团与底物之间结合于同一分子而使有效浓度得以极大的升高，从而使反应速率大大增加的一种效应。定向效应是指反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。（二）底物的形变和诱导契合：当酶遇到其专一性底物时，酶中某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力”，使敏感键的一端更加敏感，底物分子发生形变，底物比较接近它的过渡态，降低了反应活化能，使反应易于发生。（三）酸碱催化：酸碱催化是通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。在水溶液中通过高反应性的质子和氢氧离子进行的催化称为专一的酸碱性催化或狭义的酸碱催化；而通过H+和OH-以及能提供H+和OH-供体进行的催化称为总酸碱催化或广义的酸碱催化。（四） 共价催化：共价催化又称亲核催化或亲电子催化，在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加速。（五）金属离子催化：金属离子以3种主要途径参加催化过程（1）通过结合底物为反应定向；（2）通过可逆的改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应；（3）通过静电稳定或屏蔽负电荷。（六）多元催化和协同效应（七）活性部位微环境的影响9、简述胰凝乳蛋白酶的催化反应机制。答：胰凝乳蛋白酶选择裂解芳香族氨基酸如象Phe、Tyr羧基侧链。其活性中心由Ser195、His57和Asp102组成。在胰凝乳蛋白酶的催化反应中，组氨酸的咪唑基起着广义酸碱催化剂的作用，先促使Ser195的羟基亲核地附着到底物敏感肽键中的羧基原子上，形成共价的酰化中间物，在促进酰化的ES中间物上的酰基转移到水或其他的酰基受体（如醇、氨基酸等）上。丝氨酸三残基（包括天冬氨酸和组氨酸）构成的活性中心的一部分。组氨酸极化Ser侧链的羟基（去质子）。底物存在时，His57侧链接受Ser195侧链羟基的质子。因此His57是碱催化剂。Ser195丢失氢离子，产生烷基氧离子。烷基氧离子的亲核性比羟基大得多。Asp102协助His57定位，通过氢键和静电相互作用使His57更能接受Ser195的质子。10、酶活性的调节控制。答：一、调节酶的浓度；二、通过激素调节酶活性；三、反馈抑制调节酶活性；四、抑制剂和激活剂对酶活性的调节；五、其他调节方式：通过别构调控、酶原的激活、酶的可逆共价修饰和同工酶来调节酶的活性。11、协同效应：正协同效应：底物或调节物的结合大大增加了酶对后续底物分子的亲核性。（S型曲线）负协同效应：底物浓度较小的范围内，酶活力上升很快，随后底物浓度虽有较大提高，但反应速率升高很小，表现为负协同。（表现双曲线）同工酶：是指催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。酶的别构调节：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态，称为酶的别构调节。1、写出谷氨酸发酵的最理想途径，说明CO2固定化反应的重要性。答：途径：葡萄糖经糖酵解（EMP途径）和己糖磷酸支路（HMP途径）生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A（乙酰COA），然后进入三羧酸循环，生成酮戊二酸。酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。即，谷氨酸的生物合成途径包括EMP、HMP、TCA循环、DCA循环和CO2固定作用等。重要性：体系中如果不存在CO2固定反应，则有：3/2C6H12O6+NH4+=C5H9O4N+4CO2产率：147/（180*3/2）=54.4%体系中存在CO2固定反应，则有：C6H12O6+NH4+=C5H9O4N+CO2产率：147/180=81.7%可见，在GA的生物合成过程中，CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。实际上，发酵过程中不可能控制柠檬酸合成所需的C4二羧酸完全来自于CO2固定反应，体系也不可能完全不存在CO2固定反应，因此，GA 发酵的糖酸转化率应在：54.4%-81.7%。2、谷氨酸产生菌之所以能够合成、积累并分泌大量的GA，其菌种内在的原因有哪些？答：生物素缺陷型：谷氨酸产生菌大多数为生物素缺陷型,谷氨酸发酵时,通过控制生物素亚适量(贫乏量) ,引起菌种代谢失调, 使谷氨酸得到大量积累。具有CO2 固定反应的酶系：菌种能利用CO2 产生大量草酰乙酸, 有利于谷氨酸的大量积累。-KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失：体内-KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，-KGA才得以积累，为谷氨酸的生成奠定物质基础。GA产生菌体内的NADPH氧化能力欠缺或丧失：NADPH是-KGA还原氨基化生成GA必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联 的；由于NADPH的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，NADPH对于抑制-KGA的脱羧氧化有一定的意义。产生菌体内乙醛酸循环（DCA）的关键酶异柠檬酸裂解酶：该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA发酵的首要条件。糖的代谢才能沿着 - 酮戊二酸的方向进行, 从而有利于谷氨酸的积累。菌体有强烈的L-谷氨酸脱氢酶活性：-KGA + NH4+ +NADPH = GA + NADP L-谷氨酸脱氢酶，实质上GA产生菌体内该酶的酶活性都很强， 酮戊二酸易生成谷氨酸。该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联。3、谷氨酸发酵过程中，生物素（VH）作用表现在那几个方面？答：GA 产生菌大都是生物素的营养缺陷型，即：VH-。生物素对发酵的影响是全面的，在发酵过程中要严格控制其浓度。 （一） 生物素对糖代谢的影响：VH对于糖酵解有促进作用; 对丙酮酸的有氧氧化乙酰辅酶A的生成也有促进作用。这样培养基中如果有较丰富的VH，就会打破糖酵解与丙酮酸氧化之间的平衡，导致丙酮酸的积累，丙酮酸积累则可能导致乳酸的形成，乳酸生成，则使得碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的pH值下降。另一方面，可以通过控制VH的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭。（二） 生物素对氮代谢的影响：当VH缺乏时，异柠檬酸裂解酶的活性减弱；当VH丰富时，异柠檬酸裂解酶的活性必然加强。GA发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。（三） 生物素对菌体细胞膜通透性的影响：谷氨酸发酵采用的菌种都是VH-，而VH又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通过控制VH的浓度，来实现对菌体细胞膜通透性的调节。VH对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的主要成分磷脂中的脂肪酸的生物合成来实现的，当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个细胞膜不完整的菌体。4、生物素（VH）如何封闭乙醛酸循环的？答：乙醛酸循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，研究表明，该酶受以下几个因素的影响：为醋酸诱导；受琥珀酸阻遏。当VH缺乏时：（1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱(由于VH对TCA循环的促进作用)，则：乙酰辅酶A的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；（2）VH对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强；两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，DCA循环得到封闭。5、抗生素的定义、种类和作用机制。答：定义：抗生素是某些细菌、放线菌、真菌等微生物的次级代谢产物，或用化学方法合成的相同化合物或结构类似物，在低浓度下对各种病原性微生物或肿瘤细胞有强力杀灭作用或有其他药理作用的药物。作用机制：抑制细菌细胞壁的合成（B内酰胺类、磷霉素、万古霉素）；抑制细菌蛋白质合成（四环素、大环内酯类、氨基糖苷类、氯霉素类）；抑制细菌DNA合成（利福平）；抑制细菌RNA合成（放线菌素）；损伤细菌细胞膜（两性霉素B、粘菌素、氨基糖苷类）。6、青霉素生产菌种、生物合成途径、前体物质及其的作用。答：目前国内青霉素生产菌按其在深层培养中菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种，根据丝状菌产生孢子的颜色又分为黄孢子丝状菌和绿孢子丝状菌，常用菌种为绿孢子丝状菌。前体物质：前体是抗生素分子的前身或其组成的一部分，直接参与抗生素的生物合成而自身无显著变化。在一定条件下，加入前体可控制抗生素的合成方向，并增加产量。如：在青霉素G的生产中常加入苯乙酸或苯乙酰胺作为前体；在红霉素生产中添加丙酸、丙醇盐作为前体。但前体一般对生产菌有一定的毒性。7、为什么与葡萄糖相比，乳糖是生产青霉素的最好碳源？8、乳酸发酵机理的种类和合成途径。答：种类：同型乳酸发酵：发酵产物只有乳酸的一种发酵。产能途径为EMP途径。同型乳酸发酵的特点：1mol的G产生2mol乳酸，理论转化率是100%。另外有很少量的乙醇、乙酸和二氧化碳等。异型乳酸发酵：发酵产物除乳酸外还有一些乙醇、乙酸和CO2。是同型或异型决定于菌种特性并与发酵条件关系密切。此过程1mol己糖生成1mol乙醇、lmol二氧化碳和1mol乳酸。乳酸对糖转化率50。另外有比例较高的乙醇、乙酸和二氧化碳等。 9、细菌和根霉发酵乳酸的优劣比较。10、柠檬酸和乳酸钙盐法提取工艺流程的差别。11、黑曲霉柠檬酸生物合成途径。12、柠檬酸发酵过程中，锰缺乏为何会是铵根离子浓度升高呢？答：当培养基中Mn+ 缺乏时，NH4+浓度升高，同时微生物体内积累几种氨基酸（GA谷氨酸、Arg、Gin谷氨酰胺等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高之。13、柠檬酸溢出代谢的原因。答：引起柠檬酸溢出代谢的原因包括以下三个方面：（一）高水平的柠檬酸合成能力。这个能力由3个因素构成。第一：是在有高浓度草酰乙酸（OAA）的情况下对具有高度亲和力的组成型的柠檬酸合成酶（）的存在；第二：是催化丙酮酸（）固定生成草酰乙酸反应的高水平的组成型的丙酮酸羧化酶（）的存在；第三：是在缺少锰的条件下，蛋白质分解或蛋白质合成受阻造成的铵的高浓度能解除柠檬酸（）对磷酸果糖激酶（）的抑制。此外，柠檬酸的分泌，降低其胞内浓度。（二）较低的降解柠檬酸的能力。这个能力由两个因素构成。第一：是低水平的酮戊二酸脱氢酶（KD）影响TCA环运行的畅通程度，使TCA环前半部的中间产物积压；第二：在锰缺乏的条件下，顺乌头酸酶（AE）和异柠檬酸脱氢酶（ID）的活性降低，从而使柠檬酸的累积比其他几种酸（顺乌头酸、异柠檬酸和a酮戊二酸）更明显。（三）在柠檬酸过量合成阶段，培养基的PH值显然会影响细胞膜对目的产物柠檬酸的跨膜输送；柠檬酸的分泌也会影响培养基的PH值。锰与铁的缺乏有利于柠檬酸的排出。14、高产柠檬酸菌株的生理或形态特征。答：一般高产柠檬酸的菌株都具有一定的生理或形态特征。对于黑曲霉其主要特征有：在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长不太好，形成的菌落较小，形成孢子的能力也较弱；能耐受高浓度的葡萄糖并产生大量酸性a淀粉酶和糖化酶，即使在低PH下两种酶仍具有大部分活力；能耐高浓度柠檬酸，但不能利用和分解柠檬酸；能抗微量金属离子，特别是抗锰、锌、铜、铁等金属离子；在摇瓶和深层液体培养时能产生大量细小的菌丝球；具有旁系呼吸链活性，利用葡萄糖时不产生或少产生ATP。15、TCA循环在柠檬酸积累中的调节及中间物回补途径。答：调节：大量生产草酰乙酸是积累柠檬酸的关键；丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或极微弱；TCA循环的阻断或微弱（即顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶和a酮戊二酸脱氢酶活力降低），导致柠檬酸积累。而且，当柠檬酸浓度超过一定水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。回补途径：TCA循环重要功能除产能外，为一些氨基酸和其他化合物的合成提供了中间产物。回补方式：通过某些化合物的CO2固定作用；转氨基作用：一些转氨基酶所催化的反应也能合成草酰乙酸和a酮戊二酸；转氨基作用的定义：a氨基酸的氨基通过酶的催化，转移到a酮酸的酮基上，生成相应的氨基酸；原来的a氨基酸则转变成相应的a酮酸；通过乙醛酸循环。17、说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。答：乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子（H2O），因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为：氧是发酵过程生成的NADH重新氧化的氢受体；近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。18、简述二氧化碳固定反映对于提高柠檬酸产率的意义。答：通过CO2固定反应提供C4二羧酸192/180=106.6%C6H8O7 C6H12O6(C没有增加) 可见，CO2固定反应堆与柠檬酸发酵的重要性。19、绘制薯干粉发酵生产柠檬酸的工艺流程。20、并行发酵，侧系呼吸链，同性发酵，抗生素，液化，理论转化率。答：侧系呼吸链：NAD（P）H经过该呼吸链，可以正常的传递氢离子，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP。能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。抗生素：抗生素是某些细菌、放线菌、真菌等微生物的次级代谢产物，或用化学方法合成的相同化合物或结构类似物，在低浓度下对各种病原性微生物或肿瘤细胞有强力杀灭作用或有其他药理作用的药物。21、酶的提取、分离纯化技术路线及方法。22、酶提取的目标和原则。答：目标：将目的酶最大限度的溶解出来；保持生物活性。原则：相似相溶；远离等电点的PH值，溶解度增加。23、盐析沉淀的原理是什么？分段盐析的类型和常用盐析剂。答：盐析沉淀（改变离子强度）是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。盐溶：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。盐析：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。分段盐析的类型：Ks分段盐析法和B分段盐析。Ks分段盐析法：在一定的PH和温度条件下，利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）的沉淀方法。B分段盐析：在一定离子强度下，通过改变溶液的PH及温度的沉淀方法。常用的盐析用盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸盐、柠檬酸盐。24、根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤分为？根据推动力不同膜分离分为？答：类别截留的颗粒大小主要物质过滤介质粗滤2um酵母、霉菌、动植物细胞、固形物滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷微滤0.22um细菌、灰尘微滤膜超滤20A0.2um病毒、生物大分子超滤膜反渗透20A生物小分子、盐、离子反渗透膜根据推动力不同膜分离分为：加压膜分离、电场膜分离、扩散膜分离。25、常用的层析方法有几种，各分离依据是什么？答：层析方法 分离依据吸附层析 吸附力不同分配层析 各组分在两相中分配系数不同离子交换层析 离子交换剂上解离基团对离子亲和力不同凝胶层析 各组分相对分子量不同亲和层析 生物分子与配基间专一又可逆亲和力层析聚焦 等电特性与离子交换层析特性结合26、凝胶层析、离子层析、膜分离技术的原理，分离过程和常用树脂的类型、判别。答：凝胶层析的原理：凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，加入欲分离的混合物，大量蒸馏水或其他稀溶液洗柱；分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，最后流出柱外。分离过程：凝胶的选择和处理：根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。将干胶悬浮于510倍的蒸馏水中，充分溶胀，抽气，装柱。柱的选择：采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。加样：体积不能过多，不超过床体积的5%，脱盐时可在10%左右。洗脱：洗脱液与平衡时用的buffer一致。洗速不可过快，保持恒速。胶的保存：洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。用0.02%NaN3防腐。类型：交联葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶。离子交换层析的原理：根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的。酶是两性物质，当溶液的PH值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂进行层析分离，反之，用阳离子交换剂。若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。类型：阳离子交换剂常用羧甲基和磺丙基；阴离子交换剂常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2羟丙基。分离过程：装柱上样平衡洗脱收集再生上样：上样体积不十分严格。洗脱：梯度洗脱法：增加溶液的离子强度和改变溶液的PH值。再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合溶液或0.5mol/LHCl处理。膜分离技术的原理：借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。薄膜的作用是选择性的让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。27、如何检查一种酶的制剂是否达到了纯的制剂？试用所学过的知识加以论述。28、下面是某酶的纯化总结表，试计算比活力，回收率及纯化倍数。答：常用比活力表示酶制剂的纯度。比活力=酶活力（u/ml）蛋白质含量（mg蛋白/ml酶液）回收率表示提纯过程中酶损失程度的大小。回收率越高，损失越小。回收率=（提纯后酶总活力提纯前酶总活力）100%纯化倍数表示提纯过程中纯度提高的倍数。提纯倍数越大，表示该方法纯化效果越好。纯化倍数=提纯后比活力提纯前比活力总活力即样品中全部酶活力。总活力=酶活力单位数酶液总体积29、凝胶层析的洗脱中先流出的是？答：大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来。30、简述双水相萃取的概念与特点。答：概念：用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%90%），故称“双水相”系统。特点：每一水相中均有很高的含水量，为酶等生物物质提供了一个良好的环境；PEG、葡聚糖和无机盐对酶等无毒害作用，不会引起变性。萃取原理：利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。31、解释酶的发酵生产、酶的诱导、酶的反馈阻遏（产物阻遏）、分解代谢物阻遏。诱导的种类？固定化细胞，固定化酶，组成酶？答：酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动获得所需酶的技术过程，称为酶的发酵生产。酶的诱导：加进某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为酶生物合成的诱导作用，简称诱导作用。酶的反馈阻遏：是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。分解代谢物阻遏：是指某些物质（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）分解代谢的产物阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。诱导物的种类：固定化细胞：又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞，是指采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。固定化酶：与水不溶性载体结合、在一定的空间范围内起催化作用的酶称为固定化酶。组成酶：酶在细胞中的量比较恒定，环境因素对这些酶的合成速率影响不大，这类酶称为组成型酶。如DNA聚合酶、RNA聚合酶、糖酵解途径的各种酶等。适应型酶或调节型酶：生物细胞中合成的酶的含量却变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响。如大肠杆菌-半乳糖苷酶。32、酶的生产方法。答：一、提取分离法：采用各种提取、分离、纯化技术从动物、植物的组织、器官、细胞或微生物细胞中将酶提取出来，再进行分离纯化的技术过程；酶的提取：是指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，主要的提取方法有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。酶的分离纯化：是采用各种生化分离技术，使酶与各种杂质分离，达到所需的纯度，以满足使用的要求。二、生物合成法：生物合成法产酶首先要经过筛选、诱变、细胞融合、基因重组等方法获得优良的产酶细胞，然后在人工控制条件的生物反应器中进行细胞培养，通过细胞内物质的新陈代谢作用，生成各种代谢产物，再经过分离纯化得到人们所需的酶。（酶的主要生产方法）据所使用的细胞种类的不同生物合成法可分为微生物发酵产酶、植物细胞培养产酶和动物细胞培养产酶。三、化学合成法。采用合成仪进行酶的化学合成，成本高，难以工业化生产。33、微生物发酵产酶的一般工艺流程。34、原核生物中酶生物合成调节机制。答：原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节，又称为基因水平调节。酶合成的诱导：加入某些物质使酶的生物合成开始或加速的现象；末端产物阻遏：由某代谢途径末端产物的过量积累引起的阻遏；分解代谢物阻遏：指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏与利用慢的底物的分解有关的酶的合成的现象。35、常见产酶微生物有哪些？答：大肠杆菌：是最为著名的原核生物。大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖、大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌；枯草芽孢杆菌：是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5核苷酸酶、某些氨基酸及核苷，是应用最广泛的最常用的产酶微生物；链霉菌：链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要微生物；木酶：用于产纤维素酶的重要菌株。36、微生物产酶模式几种？特点？最理想的合成模式是什么？答：同步合成型：酶的合成与细胞的生长同步进行；延续合成型：酶的合成伴随着细胞的生长而开始，生长进入平衡期后，酶又延续合成一段时间；中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，进入平衡期后，酶的合成随之停止；滞后合成型：当细胞进入平衡期后，才开始并大量积累酶。最理想的合成模式：延续合成型。改造非理想模式：A、同步合成型：适当降低发酵温度，尽量提高相应的mRNA的稳定性；B、滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶合成提早开始；C、中期合成型：努力提高mRNA稳定性，解除代谢物阻遏物。38、简述微生物发酵产酶过程中工艺条件的控制？（从PH、温度、溶解氧三方面论述）答：pH值的控制：培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。不同的细胞，其生长繁殖的最适pH值有所不同。一般细菌和放线菌的生长最适pH值在中性或碱性范围（pH6.58.0）；霉菌和酵母的最适生长pH值为偏酸性(pH46)；植物细胞生长的最适pH值为56。细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值。温度的控制：不同的细胞有各自不同的最适生长温度。通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。溶解氧的控制：细胞必须获得充足的氧气，使从培养基中获得的能源物质（一般是指各种碳源）经过有氧降解而生成大量的能量ATP。在酶的发酵生产过程中， 处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。 39、在酶的发酵生产过程中，为了提高酶的产率，可以采取哪些措施？答：添加诱导物：酶的作用底物、酶的反应底物、酶的底物类似物、有些产物类似物；控制阻遏物浓度：产物阻遏、分解代谢物阻遏；添加表面活性剂：离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，用非离子型表面活性剂；添加产酶促进剂。活化能：在一定温度下，1摩尔底物全部进入活化态所需要的自由能（kJ/mol)酶的固定化:将酶和菌体与不溶性载体结合的过程;固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续进行反应，反应后的酶可回收重复使用;柠檬酸的发酵机理可概括为：大量的胞内NH4+和呼吸活性提高，使通过糖酵解途径的代谢得到加强葡萄糖经EMP通路分解成为丙酮酸，进入三羧酸循环，在丙酮酸脱氢酶复合物作用下氧化成为乙酰CoA及CO2，然后在柠檬酸合成酶作用下与草酰乙酸缩合而形成柠檬酸，而异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶因受到抑制，而使柠檬酸得以积累。 糖经糖酵解途径(EMP途径)，形成丙酮酸，丙酮酸羧化形成C4化合物，丙酮酸脱羧形成C2化合物，两者缩合形成柠檬酸。 目前用于工业化的生产菌种几乎都是黑曲霉。黑曲霉以无性生殖的形式繁殖研究柠檬酸溢出代谢的最好的例子无疑是黑曲霉。黑曲霉之所以能在特定环境条件下累积柠檬酸，是因为在这种环境条件下代谢途径前段的运转速率大于后段的运转速率。柠檬酸的溢出代谢是黑曲霉特有的遗传和生化机制与培养条件共同起作用的结果。菌种退化：指生产能力的下降，但有时也伴随产孢子能力、抗粗放环境等能力的下降。柠檬酸生物合成途径柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制追求柠檬酸的高产率 答：柠檬酸是微生物生长代谢过程中的一个中间性产物，在正常的微生物体内不能够积累的，如果有积累的话，与柠檬酸合成有关的各种酶的活性，则会受到抑制或阻遏，那么，柠檬酸发酵过程中，这种抑制或阻遏是如何被克服的呢？ 磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节：从葡萄糖柠檬酸的合成过程中，PFK 是一种调节酶或者称之为关键酶，其酶活性受到柠檬酸的强烈抑制，这种抑制必须解除，否则，柠檬酸合成的途径就会因为该酶活性的抑制而被阻断，停止柠檬酸的合成。微生物体内的NH4+，可以解除柠檬酸对PFK的这种反馈抑制作用，在较高的NH4+的浓度下，细胞可以大量形成柠檬酸。顺乌头酸酶活性的控制：该酶的丧失或失活是阻断TCA循环，大量生成柠檬酸的必要条件。由于该酶的活性受到Fe2+ 的影响，控制培养基中的Fe2+ 的浓度，可以使该酶失活。随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活(顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活)，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。 能荷调节对柠檬酸发酵的影响：菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通，在这个过程中：丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧化磷酸化产生3分子的ATP，造成了微生物体内能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止。柠檬酸产生菌可在有氧的条件下大量生成柠檬酸，也就是说，NADH即被氧化了，又没有产生ATP。柠檬酸发酵中，三个控制点 柠檬酸的积累机制总结答：1)由于Mn2缺乏抑制了蛋白质合成，导致细胞内NH4浓度升高和有一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链，这两方面的原因分别解除了对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制，促进了EMP途径的畅通；2)由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，就源源不断地提供草酰乙酸（CO2固定）。丙酮酸氧化脱酸生成乙酰-CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。3)顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡：柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸9037；4)控制Fe2+含量，顺乌头酸酶活力低，使柠檬酸积累；5)一旦柠檬酸浓度升高到某一水平就抑制异柠檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进了柠檬酸自身积累；6)柠檬酸积累使pH值降低，在低pH值下，顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，就更有利于柠檬酸的积累并排出体外。柠檬酸积累的理想条件：答：1、提高磷酸果糖激酶的活性2、提高丙酮酸羧化酶的活性3、提高柠檬酸合成酶的活性4、抑制顺乌头酸酶的活性5、抑制异柠檬酸脱氢酶的活性6、抑制a-酮戊二酸脱氢酶的活性7、抑制异柠檬酸裂解酶的活性