DB50_T 1006-2020 牛肺炎支原体抗体检测方法(重庆市).pdf

TCS 11.220 B 43 DB50 重庆市白山TE，方标准DB50/T 1006-2020 牛肺炎支原体抗体检测方法Enzyme-linker immunosorbent assay F or Mycoplasma bovis 2020-05-20发布2020-08-20实施重庆市市场监督管理局发布目IJ1=1 本标准按GB!T1.1-2009进行起草O本标准由重庆市动物疫病预防控制中心提出。本标准由重庆市农业农村委员会归口。DB50/T 1006-2020 本标准起草人:菌露、曾政、姚璐、董春霞、孙燕、谢建华、陈忠琼、凌j共权、梁望旺、杨泽林、程千)I。DB50/T 1006-2020 牛肺炎支原体抗体检测方法1 范围本标准规定了牛肺炎支原体抗体检测方法，利用牛肺炎支原体抗体酶联免疫吸附试验，检测牛肺炎支原体抗体。本方法适用于检测牛血清(血浆)的牛肺炎支原体抗体。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T1.1-2009 标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 牛肺炎支原体是指引起牛传染性支原体肺炎(又称烂肺病)以肺音1阳市变为主要特征的传染病的一种支原体。3.2 酶联免疫眼附试验简称酶联免疫法，或者ELISM去。将己知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，i吏酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。4 牛肺炎支原体P39抗原酶联免疫眼附试验4.1试验材料洗液:配制见附录第A.1章:稀释液:配制见附录第A.2章:标准阳性血清:含牛肺炎支原体抗体的牛血清:标准阴性血清:无牛肺炎支原体抗体的牛血清:酶结合物:辣根过氧化物酶CHRP)标记的羊抗牛IgG;底物溶液:配制参见附录第A.3-A.4章:终止液:配制参见附录第A.5章。4.2操作步骤4.2.1样品准备将被检血清(或血浆)用稀释液(见附录A.2)做1:40稀释。4工2加样取出抗原包被板，A1、B1加入1001.1L阴性对照，C1、D1加入1001.1L阳性对照，其余孔加入1:40稀释的被检血清(血浆)，每孔100L，将加样位置做好记录，用封膜封板，室温孵育30mino4.2.3洗涤DB50/T 1006-2020 吸除孔内液体，每孔加30011 L冲洗液(见附录A.l)冲洗，重复5次，在吸水纸上轻拍，确保孔内无残留液体。4.2.4加酶辛苦、抗体每孔加入酶标抗体液100L，以封膜封板，室温孵育30mino4工5洗j条洗涤方法同4.2.304.2.6加底物每孔加入100L底物使用液(见附录A.3和附录A.4)，室温孵育10mino4.2.7终止加终止液(见附录A.5),10011L!孔，使其终止反应。4.3结果判定设定酶标仪检定波长在450nm(即OD值);阳性对照均值(PC)0.5，阳性对照OD值的均值(PC)与阴性对照均值(NC)的比值4，判定实验有效，若两者不成立，则实验无效，需重复:待测样本的判定，s/P值O.4者判定为阳性，s/P值0.4为阴性样本。其中S为待测样本的OD值。2 S-NC s/p=一一一一一一PC-NC 附录A试剂的自己制DB50/T 1006-2020 A.l磷酸盐缓冲液(含0.05%Tween-20的O.Olmol/LpH7.4的PBS，即PBST)PBS 氯化纳8g 磷酸二氢饷0.2g 磷酸氢二纳2.9g 氯化甲0.2g 蒸馆水加至1000mLPBST Tweent-20 0.5mL 加O.Olmol/LpH7.4的PBS至100mLA.2稀释液(含O.l%BSA的PBST)牛血洁白蛋白(BSA)O.1g 加PBST至100mL 40C存放，避光。A.3底物缓冲液拧棱酸0.47g 十二水合磷酸氢二纳1.84g 蒸f留水加至1OOmL,pH 值5.0-5.4A.4底物使用液TMB(2mg/mL)0.5mL 底物缓冲液CpH5.5)9.5mL 0.75%H202 42L A.5终止液浓硫酸l1.1mL 蒸榴水88.9mL 3