DB36_T 484-2005 饲料中沙丁胺醇的测定 酶联免疫吸附法(江西省).pdf

备案号18619-2006DB36 江西省也ETJ 方标准DB36/T 484一-2005饲料中沙丁服醇的测定-酶联免疫吸附法2005-12-25发布2006-02-01实施江西省质量技术监督局发布DB36/T 484-2005 目;欠II l范围.1 2.杠法原理l 3试剂和材料.4仪器设备l 5样品的制备.1 6分析步骤.1 7结果计算.2 8灵敏度.2 9其他.2 DB36/T 484一2005目IJ1=1 本;标准由江西省农业厅提出。本标准起草单位:江西省兽药饲料监察所。本标准起草人:文虹、周华娇、符金华、饶辉、尹腾桂、周伟良。II DB36/T 484-2005 饲料中沙丁肢醇的测定一酶联免疫吸附法1 范围本标准规定了饲料中沙丁肢醇酶联免疫吸附测定(ELISA)方法。本标准适用于配(泪)合饲料、浓缩饲料伞、甜、混合饲料及饲料添加剂中沙丁肢醇的测定。2 方法原理利用固相酶联免疫吸附原理，将沙T肢醇特异性抗体包被于聚苯乙烯微量反应板的孔穴中，再加入稀释的样品(未知抗原)及酌标沙丁肢醇的抗原(己生日抗原)，使队j者Lj抗体之间进行免疫竞争反应，然后加酌底物显色，颜色的深浅取决于抗体和酌标沙T肢醇抗原结合的量，即样品中沙丁肢醇多，则被抗体结合酌标沙丁版醉少，颜色浅，反之则深，用日测法或仪器法与沙丁肢醉标样比较米判断样品中沙T肢醉的含量。3 试剂和材料以下试剂除特别注明外均为分析纯，水为蒸t留水。3.1 沙丁服醇酶联免疫试剂盒3.1.1 1 X 9倒6孔版(12条X8子孔L)包被有抗沙J3.1.2 6X标T准住i主;液，(包2ml)为分别f含斗0，0.1,0.3,0.9,2.7,8.1pp阶b的SAL洛;液夜3.1.3 1 X SAL过氧化斗物匆酶标记物i浓;斗农d缩宿j榕容液1x酶反jV)成物(7 ml):含有过氧化尿素1x显色剂(7 ml):四甲基联苯肢1x反同停rr伞液(8 ml):1N盐酸1xPBS(15 ml):用于前释SAL-过氧化物酶标记物浓缩洛液1xPBST浓缩液(40 ml):力U800mL茶馆水稀释，洗板用3.2 1mol/L盐酸3.3 1mol/L氢氧化饷4 仪器设备4.1 实验室常用仪器设备4.2 酶标测定仪，含有450nm的滤光片4.3 振荡器:振荡频卒.100次/min(往复)4.4 离心机能达到4000rpm4.5 微量连续可调移液器及配套吸头10-300/L5 样品的制备5.1 取具有代表性的饲料样品，用四分法缩减至200g左右，粉碎过O.45mm孔径的筛，充分泪匀，装入磨口瓶备用O6 分析步骤DB36/T 484-2005 6.1 提取称取样品2g，精确至O.Olg，置于50mL试管中，加入2mLlmol/LHC1及16mL羔惘水1H!.匀，振荡15mi丑，然后4000rpm离心20mi丑，转移出上洁液并加入1MNaOH至上洁液中嗣合，调PH值在6.5-7.5之间，前置15mi丑后，再4000rpm肉120min转移出上洁液备用。6.2 测定6.2.1 试剂盒和待洲样品检测前平衡至室温(200C-250C)0 6.2.2 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录F标准和样品的位置，倒出孔巾的抗体液，用和释好的PBST洗涤三次，每次洗板应加入洗液后等2min再倒掉。6.2.3 加入501的标准液或处理好的样品到各自微孔巾。6.2.4 加入100l稀轩的酶标记物到微孔中，250C-30oC孵育30mino6.2.5 倒出孔中的液体，用250l稀释后的PBST洗涤三次，每次加入洗板液而等2min盯再倒掉。6.2.6 反应物与显色剂1:1混合后加入100l到微孔中，充分混合并在250C-300C暗处孵育15mino6.2.7 加入.50l反应停止液在10min内读取股光度值。7 结果计算7.1 所获得的标准和样品吸光度值和平均但除以第一个标准(0标准)的眼光度值再乘以100，因此O标准等于100%，并且以百分比的形式给出眼光度值。标准的眼光度值(或样品)X 100=%吸光度值。标准的吸光度值7.2 il算的标准值绘成一个对应沙丁肢醇浓度(Ong/g或ng/mU的平对数坐标系统曲线图，校正曲线在0.3-2.7ng/g(ppb)范围内应当成为线性，相对应每一个样品的浓度(口g/g或吨/mU可以从校rr曲线上读山。7.3 以0.9ng/g的标准孔为对照孔，样品吸光度恒小j二该孔的眼光度值为可疑阳性。8 灵敏度本力;去的检测限为O.lng/g9 其他9.1 试剂盒应放在20C-80C冰箱内保存。9.2 为分析人贝安全，操作时要戴上医用乳胶手套。9.3 本方法检出的可疑阳性样品必须经过GC-MS法进一步确证。2