芽胞杆菌的净水作用的研究--毕设论文.doc

学科分类号 0818
本科生毕业论文

题目 ： 芽胞杆菌的净水作用的研究
Study of Bacillus on Water Purification Functions

学生姓名：　 李 汨
学　　号：　 0912402007　
系　　别：　 生命科学系　
专　　业：　 生物工程　　
指导教师：　 刘胜贵 教授　
起止日期：2012.3 — 2013.5

2013年 5月12 日

I

怀化学院本科毕业论文(设计)诚信声明

作者郑重声明：所呈交的本科毕业论文(设计)，是在指导老师的指导下，独立进行研究所取得的成果，成果不存在知识产权争议。除文中已经注明引用的内容外，论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的成果。对论文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确的方式标明。本声明的法律结果由作者承担。

本科毕业论文（设计）作者签名：

年 月 日

I

目录
摘 要 I
关键词 I
ABSTRACT I
KEY WORDS II
1 前言 1
2 材料与方法 3
2.1 实验材料 3
2.1.1 研究材料 3
2.1.2 实验药品 4
2.1.3 实验仪器 4
2.1.4 培养基 4
2.2 实验方法 5
2.2.1 筛选芽胞杆菌 5
2.2.1.1 细菌活化 5
2.2.1.2 芽胞染色 5
2.2.2 模拟污染水样 6
2.2.3 投菌 6
2.2.4 测定 7
3 实验结果与分析 7
3.1 氨氮的测定 7
3.2 硝酸盐的测定 9
3.3 COD的测定 11
3.4 pH值的测定 12
4 讨论 14
参考文献 15
致 谢 16

II

芽胞杆菌的净水作用的研究

摘 要
本文研究芽胞杆菌对水的净化作用。从微生物实验室保藏的50多个菌株中筛选芽胞杆菌，将7株芽胞杆菌(Bacillus )投放于模拟污染水样中，再分别监测污染水中的pH值、COD 值、硝酸盐浓度、氨氮浓度等水化学指标。结果表明，在污染水中加入芽胞杆菌后，水的COD值、硝酸盐、氨氮浓度有所降低，而总碱度显著上升，pH值维持在8.00～8.50 之间。研究证明了芽胞杆菌对调节养殖水体微生态结构稳定具有明显的作用。

关键词
芽胞杆菌；COD；硝酸盐；氨氮；净水作用

Study of Bacillus on Water Purification Functions

Abstract
The experiment is to research the water purification functions of the Bacillus.Firstly selecting Bacillus from about 50 different kinds of strains in the microbiological laboratory, then put these seven strains into the various simulated polluted waster samples, finally, we get the result by separately testing the chemical index in these water samples like pH values, COD value and the concentration of nitrogen and ammonia nitrogen.The results that Bacillus are transferred into the water samples, comparing with the decrease of the concentration of the COD value and nitrogen, the total alkalinity has dramatically increased and the pH value maintain the range from 8.00 to 8.50 shows Bacillus play a significant role in improving the quality of the farming water and keeping the stability of the structure of microbes.

Key words
Bacillus ; COD；nitrogen；ammonia nitrogen；purifying capacity

I

1 前言
随着水产养殖规模的不断扩大，集约化养殖程度的不断提高，水产养殖池的富营养化程度越来越高[1]。有机物的大量投放使残饵，鱼虾的排泄物等富营养因子共存于一个水体，加上池塘自净与调节能力的降低，养殖水体中化学需氧量 (COD)、生物耗氧量(BOD)、氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐、硫化物等指标严重超标，池塘水质恶化，鱼虾病害频频发生[2,3]。
抗生素在养殖池中的过量或频繁使用不仅会使细菌耐药性增加，破坏和干扰养殖环境的正常生物系统，导致养殖水体中微生物的生态失调，而且会产生二重污染，在生物体内残留，严重影响水产品的品质[4,5,6]，使水产品的出口受到严峻的挑战。
如果能有效避免有机物质及其分解产物的过量积累，就能获得良好的水质条件。正是基于这一原理，选育和培养高效安全的微生物菌剂，对净化水质尤为重要。将微生物菌剂[7]直接投放到受污染的水体中，就能改善和恢复养殖水体的生态环境，减少鱼虾疾病的发生，达到净水的目的。
芽胞杆菌作为一种真细菌[8]，是土壤中的优势种群，能强烈地分解含碳、氮、磷、硫等污染物，分解蛋白质和复杂多糖，对水溶性有机物分解也有重要的作用，同时可以与养殖环境中的有害藻类及水产致病菌竞争，形成优势种群，抑制有害藻类及水产致病菌。由于它的特性与功能优于光合细菌而有望成为光合细菌的替代品，已成为当前国际净水界的研究热点[9]。
芽胞杆菌类净水微生物的使用,使养殖者在不中断养殖过程的情况下，清除长时间残留于养殖水域底部废物，尤其是池底部积累的大量残余饵料、排泄废物、动植物残体以及有害气体(氨、硫化氢等)，使之先分解为小分子(多肽、高级脂肪酸等)，后分解为更小分子有机物(氨基酸、低级脂肪酸、单糖、环烃等)，最终分解为二氧化碳、硝酸盐、硫酸盐等，有效降低了水中的COD、BOD，使水体中的氨氮(NH4+-N)与亚硝酸氮(NO-2-N)硫化物浓度降低，从而有效地改善水质。同时还能为以单细胞藻类为主的浮游植物提供营养物质，促进繁殖。这些浮游植物的光合作用，又为池内底栖水产动物的呼吸，有机物的分解提供氧气，从而形成一个良性生态循环。由于芽胞杆菌大量繁殖，在池内形成优势种群，可抑制病原微生物的繁殖，减少疾病发生。
芽胞杆菌具有丰富的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、脱氢酶、脱羧酶、氧化酶等，能强烈的分解含碳污染物，分解蛋白质和复杂多糖，对水溶性有机物分解也有重要的作用。养殖池塘内的悬浮物(简称“絮团”)和底泥严重恶化了水环境，引起动物发病。而芽胞杆菌通过其酶的作用，能分解悬浮物和底泥，从而维持水生生态环境平衡。把芽胞杆菌投入养殖池，能降低水中COD、BOD，有效改善水质和周围环境。高密度集约化养殖给养殖池塘生态环境带来了严重的污染，过量的N、P排入水体引起池塘富营养化，在池塘内也易形成对水产动物有毒性的氨氮，影响动物的生长，甚至死亡。而芽胞杆菌可利用其丰富的酶，强烈分解含氮、碳污染物，净化养殖水体。NO3-在芽胞杆菌作用下，经NO2-，NO，N2O被还原为氮气，即芽胞杆菌是好氧菌和兼性厌氧菌，以分子氧为载体，在供氧不充分的时间与空间，可以利用硝酸盐为最终电子载体产生NO2-N和N2,而起反硝化作用，将硝酸盐移出系统外，提高pH。总的来说，芽胞杆菌具有强烈的分解含碳、氮、磷、硫污染物，分解蛋白质、复杂多糖、水溶性有机物的能力，已被广泛应用。
枯草芽胞杆菌（命名为4号菌株）是长沙拜特科技有限公司制剂中的优势菌，能迅速分解水体中有机物，达到净化水的作用。通过对COD，氨氮的含量，硝酸盐的含量等指标的测定，可以确定芽胞菌株的净水能力。
比较从微生物实验室筛选出的6株芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌（4号菌株）的净水能力，找出7种芽胞杆菌中净水作用最好的菌株。
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 研究材料
本实验所用的芽胞杆菌：
（1） 从微生物实验室已分离出的50种细菌中筛选出芽胞杆菌，微生物实验室已筛选出的一株超大芽胞杆菌（命名为7号菌株）。
（2） 枯草芽胞杆菌（命名为4号菌株），由长沙拜特科技有限公司提供的。
2.1.2 实验药品
NaOH，KI，HgI2，酒石酸钾钠（KNaC4H6O6.4H2O)，重铬酸钾（K2Cr2O7），浓硫酸，HgSO4 ，10%H2SO4，Ag2SO4 ，H2SO4，邻菲罗啉（C12HSN2﹒H2O），硫酸亚铁铵(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O，5%孔雀绿水溶液（四甲基代二氨基三苯甲烷），0.5%番红水溶液，豆粕粉，麦麸粉，浓硫酸，碳酸钠等。
2.1.3 实验仪器
Hach DRB 200 化学耗氧量（COD）分析仪（上海圣科仪器设备有限公司)，通风橱（宜兴市佳美实验装备有限公司），pH酸度计（上海雷磁仪器厂），AL104电子天平（Mettler-Toledo仪器公司），立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-50S1，上海博迅实业有限公司医疗设备厂），电热恒温培养箱（DHP-2000型，天津市华北实验有限公司），CJ型水平层流净化工作台（苏州洁净技术研究所制造），QYQ-1000-UL/QYQ- 200-UL移液枪（北京青云航空仪表有限公司生产），恒温水浴锅(HH – S，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂)，紫外分光光度计（T 21 P，上海光谱仪器有限公司），荧光显微镜(BX 60 F 5，日本)
大小烧杯若干，玻璃棒，试管，接种环，培养皿，酒精灯，载玻片，盖玻片，试管架，滤纸，载玻片夹子，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，报纸，滴定管，锥形瓶，pH试纸等。
2.1.4 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g， NaCl 5.0 g，琼脂粉1.6%，用1 mol/L NaOH调节pH 7.0，蒸馏水定容至1 000 mL。于0.1 Mpa、121 ℃下灭菌30 min，储存备用。
2.2 实验方法
2.2.1 筛选芽胞杆菌
2.2.1.1 细菌活化
将从微生物实验室已分离出的50种细菌，微生物实验室已筛选出的一株超大芽胞杆菌（命名为7号菌株）和长沙拜特科技有限公司提供的枯草芽胞杆菌（命名为4号菌株），进行活化。
2.2.1.2 芽胞染色
芽胞染色法筛选：制片，按常规方法涂片、干燥及固定。‚加热染色，向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持5 min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。ƒ脱色，待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。④复染，用0.5%番红水溶液复染2 min。⑤水洗，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。⑥镜检，将载玻片晾干后油镜镜检。（部分芽胞杆菌图片）（100×）

2号 1号

5号 6号
2.2.2 模拟污染水样
在一个塑料桶中装水20 L，分别加入豆粕粉和麦麸粉各12.0 g，硫酸铵1.0 g，硝酸钾6.0 g，硫化钠0.01 g，配制好的模拟养殖水用5%的碳酸钠溶液和硫酸钠调节pH值至8.0-8.5。
2.2.3 投菌
将筛选出来的芽胞杆菌和4号菌株与7号菌株分别编号为1，2，3，4，5，6，7号菌株。取7个1 000 mL的大烧杯，水样配制2 d之后，分别向杯中加入1 000 mL的模拟污染水样，再对培养好的接种液进行计算，分别投入1，23，4，5，6，7号菌株，将芽胞杆菌的浓度调整为2.5*107个/mL，至于室温下进行培养，并每隔12 h进行一次充氧。
2.2.4 测定
测定不同菌株对水样COD、pH、氨氮、硝酸盐[10,11]去除率的影响。
每隔12 h分别测定水样COD、pH、氨氮、硝酸盐的含量，直至120 h。
3 实验结果与分析
3.1 氨氮的测定
NH3-N的测定——纳氏试剂分光光度法[12]。
做标准曲线：在8个50 mL比色管中，分别加入0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、和10.00 mL氨氮标准工作溶液，其所对应的氨氮含量分别为0.0 µg、5.0 µg、10.0 µg、20.0 µg、40.0 µg、60.0 µg、80.0 µg、100.0 µg，加水至标线。加入1.0 mL酒石酸钾钠溶液，摇匀，再加入纳氏试剂1.0 mL,摇匀，放置10 min后，在波长420 nm下，用20 mm比色皿，以水为参比，测量吸光度。以空白校正后的吸光度为纵坐标，以其对应的氨氮含量（µg）为横坐标，绘制标准曲线。
原水经滤纸过滤（先要润洗滤纸），取5 mL(根据情况调整)放入50 mL比色管中，定容，加1 mL酒石酸钾钠，1 mL纳氏试剂，静置10 min，然后测吸光度。结果计算，水中氨氮的浓度按以下公式计算：
ΡN=As-Ab-a/b×v（ΡN——氨氮的质量浓度，mg/L，以氮计；水样的吸光度，Ab——空白试验的吸光度，a——校准曲线的截距，b——校准曲线的斜率，v——试料体积mL）
不同菌株对水样氨氮去除率的影响
菌株
时间/h
0
24
48
72
96
120
1
0.387
0.304
0.316
0.313
0.343
0.331
2
0.387
0.328
0.334
0.291
0.305
0.298
3
0.387
0.384
0.411
0.344
0.335
0.253
4
0.387
0.393
0.440
0.369
0.386
0.281
5
0.387
0.306
0.328
0.307
0.342
0.279
6
0.387
0.362
0.344
0.338
0.326
0.291
7
0.387
0.33
0.371
0.354
0.331
0.284

由图可以看出，各个菌株对氨氮的含量变化不同。7号菌株氨氮含量先上升后下降，3号菌株氨氮含量也是先上升后下降，且氨氮去除率效果较4号菌株要好，达到34.6%。
3.2 硝酸盐的测定
硝酸盐的测定——紫外分光光度法。
标曲的绘制：于5个200 mL容量瓶中分别加入0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL硝酸盐氮标准贮备液，用新鲜去离子水稀释至标线，其浓度分别为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L硝酸盐氮。按水样的操作步骤测量吸光度。
取样1 mL，定容至10 mL；加入l mL1 mol/L的盐酸，定容至50 mL，用紫外分光光度计测吸光度（λ=220 nm、λ=275 nm），计算结果：A=A220-2A275
硝酸盐氮含量计算 C=m/v*1 000(Ｃ——水样中硝酸盐氮浓度，ｍｇ／Ｌ； ｍ——依校正吸光度值Ａr从校准曲线上查出的相应硝酸盐氮含量，ｍｇ； Ｖ——所取水样的体积，ｍl)
不同菌株对水样硝酸盐去除率的影响
菌株
时间/h
0
24
48
72
96
120
1
0.075
0.176
0.154
0.075
0.151
0.156
2
0.075
0.178
0.195
0.067
0.11
0.009
3
0.075
0.088
0.057
0.105
0.007
0.135
4
0.075
0.037
0.128
0.028
0.015
0.001
5
0.075
0.135
0.118
0.077
0.097
0.151
6
0.075
0.05
0039
0.039
0.080
0.067
7
0.075
0.158
0.127
0.061
0.105
0.083

由图可以看出 ,各个处理水样的硝酸盐的含量变化起伏很大。在处理后的第一天，只有4号、5号菌株的硝酸盐含量有所降低，其他都是上升状态，在120 h后，4号菌株处理的硝酸盐的含量基本为0。
3.3 COD的测定
COD的测定——重铬酸钾滴定法[13]
准确吸取均匀水样5 mL（每批水样测量时需增加2个空白水样）于消解罐中，加入1 mL掩蔽剂（不含氯离子的水样可以不加），充分摇匀使Cl-与Hg+完全络合（若掩蔽剂很快全被溶解，既Cl-的含量过高，需补加掩蔽剂，直至任然有掩蔽剂不容为止），5.00 mL消解液，5.00 mL催化剂，摇匀。旋紧密封盖，依次将消解灌均匀地放入一起炉腔玻璃旋转周边，关好炉门。消解完成后，将样液转移到150 mL锥形瓶中，用20 mL蒸馏水分三次冲洗消解罐及盖的内壁，冲洗液并入锥形瓶中，加入2-3滴试亚铁灵指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液回滴，溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点，记录硫酸亚铁铵标准溶液的用量，按下时计算CODcr的值：
CODcr（mg/L）=（V0-V1）×C×8×1000/V2（V0——硫酸亚铁铵标准溶液用量（mL），V1——水样消耗硫酸亚铁铵标准溶液用量，C——硫酸亚铁铵标准溶液浓度（mol/L），8——氧（1/20）摩尔质量（g/mol），V2——水样体积（mL））

不同菌株对水样COD去除率的影响
菌株
时间/h
0
24
48
72
96
120
1
15.26
10.23
9.48
9.57
10.56
9.54
2
15.26
9.71
10.03
9.51
9.33
9.52
3
15.26
13.82
11.99
10.83
11.26
10.89
4
15.26
11.34
10.34
10.25
9.26
9.21
5
15.26
13.75
12.73
10.76
10.84
10.74
6
15.26
12.54
13.63
10.57
10.83
9.99
7
15.26
10.56
9.89
11.00
10.43
10.21

由上图可见，7株芽孢杆菌相比，24 h时，2号菌株对污水COD的降解能力最强，可达36.4%，随着时间的推移，菌株对污水COD的降解能力差不多。

3.4 pH值的测定
每隔12 h测定分别测定水样的pH值，用pH酸度计测定。
不同菌株对水样pH值的影响
菌株
时间/h

0
24
48
72
96
120

1
8.20
7.99
8.00
8.12
8.24
8.22

2
8.20
8.32
8.22
8.15
8.26
8.28

3
8.20
7.79
8.10
8.21
8.30
8.39

4
8.20
8.30
8.28
8.34
8.41
8.45

5
8.20
8.22
8.24
8.26
8.29
8.30

6
8.20
8.23
8.21
8.27
8.30
8.32

7
8.20
8.30
8.10
8.15
8.16
8.20

由图可以看出,处理水样的初始 pH 值为8.20，为偏碱性，随着时间的推移而有所变化，原因可能是因为发酵产生的污染物改变了水体的 pH值。在此次水质净化过程中，5号，6号菌株的pH趋于平稳，而其他菌株的pH的起伏较大，不利于水生物的生长，说明5号，6号菌株在一定程度上可以起到调节pH的作用。
4 讨论
有机物质在水中的积累超过一定的限度时，会使养殖水体呈富营养型，溶氧、pH等水质条件恶化，对鱼、虾生长带来不良的影响。各国渔业水质标准中都对有机物质含量作了规定:如COD (O2) <3～5 mg/ L。COD 是指示水体被还原性物质污染的主要指标。还原性物质包括各种有机物、亚硝酸、硝酸盐、亚铁盐和硫化物等。本研究主要从降解有机物方面考察了不同芽胞杆菌净水作用。
本实验通过在玻璃缸中加入了麸子和豆粕粉，模拟喂养的剩余物，加入不同的污染物，模拟了水产养殖的真实环境，每隔12 h测定测定水质的COD、硝酸盐、氨氮和pH值，确定不同菌种的水体净化作用。研究结果表明，在污染水中加入芽胞杆菌后，水的 COD 值、硝酸盐、氨氮浓度有所降低，而总碱度显著上升，pH 值维持在 8.00～8.50 之间，表明芽胞杆菌对调节养殖水体微生态结构稳定具有明显的作用。
本实验中也存在一些不足，如综合利用不同菌种（如加入光合细菌）的不同的降解净化作用，互为补充，以便能达到最好的效果，如改变培养条件，这也是我们在下步实验中主要考虑的问题。

参考文献
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[8]编辑:阮庆文.有益微生物制剂水质调控法.养殖世界.2011年第十期.
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[10]赵斌,何绍江.微生物学实验[M].北京:科学出版社,2002.　
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[12]国家海洋局第三海洋研究所.GB 12763.4-1992中华人民共和国国家标准海洋调查规 范海水化学要素观测.北京:中国标准出版社,1993.
[13]袁汉鸿,胡艳平,戚惠良.重铬酸钾法测定水中COD问题的探讨.珠海市供水总公司,广
东珠海.519020.

致 谢
该论文的工作写作和实验的研究工作均是我的导师刘胜贵教授的悉心指导下完成的。刘胜贵教授渊博的知识、严谨的治学态度、活跃的思维、井然有序的处事风格使我受益匪浅。在此我向刘胜贵教授致以我最真挚的感谢和敬意。
感谢邓伟光学长，在我失败的时候帮我分析原因，给予我无私的帮助。在这里向你致谢。
感谢寝室的姐妹们在生活上的包容和理解。
最后，我要特别感谢我的家人对我的理解和支持，正是他们的
理解和支持才使我能认真投入到试验中去。

16